微小RNA—200a對肺癌細(xì)胞增殖影響及抑癌基因功能分析

謝悅　　董禮文　　王軍　　李雄偉

[摘要] 目的 分析miRNA-200a對肺癌細(xì)胞增殖影響及抑癌基因功能影響。 方法 Real-time PCR對正常肺支氣管上皮細(xì)胞16HBE、肺癌細(xì)胞SK-MES-1、NCI-H520、A549及25例非小細(xì)胞癌癌旁組織與癌組織內(nèi)miR-200a表達(dá)量檢測，CCK-8法檢測肺癌A549細(xì)胞增殖活性受miRNA-200a影響狀況，生物信息學(xué)對miRNA-200a靶基因進(jìn)行預(yù)測，雙熒光素酶聯(lián)合Western blot及Real-time PCR檢驗(yàn)YAP1受miRNA-200a調(diào)控影響。CCK-8法檢測肺癌549細(xì)胞受YAP1增殖影響。 結(jié)果 肺癌細(xì)胞株SK-MES-1、NCI-H520及A549內(nèi)miR-200a表達(dá)量均低于正常細(xì)胞株16HBE，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。miR-200a mimics組內(nèi)A549細(xì)胞在48、72及96 h時(shí)其吸光度均低于Mimics-NC，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。肺癌A549轉(zhuǎn)染siRNA-NC或者siRNA-YAP1后，PCR檢測顯示siRNA-YAP1內(nèi)YAP1 mRNA表達(dá)量為（0.37±0.06），siRNA-NC內(nèi)YAP1 mRNA表達(dá)量為（1.03±0.07），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；Western blot顯示siRNA-YAP1內(nèi)YAP1蛋白表達(dá)量比siRNA-NC低；siRNA-YAP1內(nèi)YAP1細(xì)胞吸光度在48、72及96 h時(shí)均低于siRNA-NC，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。 結(jié)論 miR-200a對肺癌細(xì)胞增殖的抑制作用主要是經(jīng)過靶向作用YAP1基因來實(shí)現(xiàn)的，進(jìn)而在肺癌內(nèi)起到抑癌功能。

[關(guān)鍵詞] 肺癌；miRNA-200a；YAP1；細(xì)胞增殖

[中圖分類號] R734.2 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-9701（2018）31-0020-05

Analysis on the effect of microRNA-200a on proliferation of lung cancer cells and function of tumor suppressor gene

XIE Yue DONG Liwen WANG Jun LI Xiongwei

Department of Cardiothoracic Surgery，Hangzhou Hospital of TCM，Affiliated Guangxing Hospital of Zhejiang Chinese Medicine University， Hangzhou 310000，China

[Abstract] Objective To analyze the effects of miRNA-200a on the proliferation of lung cancer cells and the function of tumor suppressor genes. Methods Real-time PCR was used to detect the expression quantity of miR-200a in normal lung bronchial epithelial cells 16HBE， lung cancer cells SK-MES-1， NCI-H520， A549 and non-small cell carcinoma para-carcinoma tissue tissues and cancer tissues in 25 cases. CCK-8 assay was used to detect the effect of miRNA-200a on the proliferation activity of lung cancer A549 cells. Bioinformatics was used to predict miRNA-200a target genes， and dual fluorescein combined with Western blot and Real-time PCR were used to detect the effect of miRNA-200a regulation on YAP1. CCK-8 assay was used to detect the effect of YAP1 proliferation on lung cancer 549 cells. Results The expression quantity of miR-200a in lung cancer cell lines SK-MES-1， NCI-H520 and A549 was lower than that in normal cell line 16HBE， and the difference was statistically significant（P<0.05）. The absorbance of A549 cells in miR-200a mimics group was lower than that of Mimics-NC at 48， 72 and 96 h， and the difference was statistically significant（P<0.05）. After lung cancer A549 was transfected with siRNA-NC or siRNA-YAP1， PCR detection showed that the expression quantity of YAP1 mRNA in siRNA-YAP1 was（0.37±0.06）， and the expression quantity of YAP1 mRNA in siRNA-NC was（1.03±0.07）. The difference was statistically significant（P<0.05）； Western blot showed that the expression quantity of YAP1 protein in siRNA-YAP1 was lower than that of siRNA-NC； the absorbance of YAP1 cells in siRNA-YAP1 was lower than that of siRNA-NC at 48， 72 and 96 h， and the difference was statistically significant（P<0.05）. Conclusion The inhibitory effect of miR-200a on the proliferation of lung cancer cells is mainly achieved by targeting the YAP1 gene， which in turn plays a tumor suppressor function in lung cancer.

[Key words] Lung cancer； miRNA-200a； YAP1； Cell proliferation

肺癌為臨床常見腫瘤，特別是近些年來，隨著人們生活環(huán)境和生活方式的改變，肺癌發(fā)病率逐漸升高，對人們的生命安全產(chǎn)生了嚴(yán)重影響。伴隨生物技術(shù)不斷深入探究，腫瘤療法的一個新的研究熱點(diǎn)為驅(qū)動基因分子靶向療法，為臨床患者提供了新的治療手段。微小RNA（miRNAs）為長度17～25個核苷酸高度保守、內(nèi)源性單鏈非編碼RNA，能夠結(jié)合下游3-非編碼區(qū)（3-UTR），可使mRNA降解或在轉(zhuǎn)錄后對其翻譯起抑制作用，在機(jī)體腫瘤進(jìn)展中有“抑癌基因”或“癌基因”影響[1-2]。miR-200家族一員miR-200a定位在機(jī)體好的染色體內(nèi)，相關(guān)研究顯示，機(jī)體惡性腫瘤進(jìn)展和miR-200a的異常表達(dá)有一定聯(lián)系，在多數(shù)腫瘤內(nèi)如肝癌、胰腺癌、腎細(xì)胞癌等miR-200a表達(dá)量降低，有“抑癌基因”影響，同時(shí)有研究顯示，在卵巢癌及鼻咽癌等腫瘤內(nèi)其表達(dá)升高，有“癌基因”影響[3-4]。因此，本研究通過分析miRNA-200a對肺癌細(xì)胞增殖影響及抑癌基因功能影響，為臨床患者治療提供一些實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

組織標(biāo)本：選取2017年3月～2018年1月間在本院進(jìn)行手術(shù)的非小細(xì)胞肺癌患者25例，收集其肺癌組織及癌旁組織（離腫瘤邊緣5 cm以上），置于液氮并保存于-80℃冰箱內(nèi)，肺癌患者均經(jīng)過病理切片確診，其中男17例，女8例，年齡40～65歲，平均（55.37±6.81）歲，依據(jù)WHO肺癌分類，腺鱗癌2例、鱗癌9例，腺癌14例。本文研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，患者或家屬知情并簽署同意書。

試劑和細(xì)胞：β-cation及YPA1抗體（由美國Abcam公司生產(chǎn)），正常肺支氣管上皮細(xì)胞株16HBE、肺鱗癌細(xì)胞系SK-MES-1、NCI-H520及非腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549（由美國ATCC公司生產(chǎn)），CCK-8試劑盒（由上海東仁化學(xué)公司生產(chǎn)），LipofectamineTM2000、Trizol試劑（由美國Invitrogen公司生產(chǎn)），YAP1 siRNA質(zhì)粒、陰性對照mimics-NC、miR-200a mimics、siRNA-NC（由美國Santa Cruz公司生產(chǎn)），YAP1、miR-200a和內(nèi)參GAPDH、U6引物均為上海吉瑪公司合成，pmirGLO載體、RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、雙熒光素酶試劑盒及Real-time PCR試劑盒（由美國Promega公司生產(chǎn)）。

1.2 研究方法

1.2.1 培養(yǎng)細(xì)胞與轉(zhuǎn)染 16HBE、SK-MES-1、NCI-H520和人肺癌細(xì)胞株A549均放置在RPMI 1640培養(yǎng)基（包含10%胎牛血清）內(nèi)，含5% CO2、37℃培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，2～3 d按照1：3進(jìn)行傳代。細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)選取A549對數(shù)生長期肺癌細(xì)胞進(jìn)行接種，細(xì)胞貼壁在70%～80%行轉(zhuǎn)染，依據(jù)LipofectamineTM2000試劑盒的說明來行相關(guān)操作，對siRNA-NA、miRNA-200a mimics、siRNA-YAP1及mimice-NC轉(zhuǎn)染。

1.2.2 Real-time PCR對YAP1 mRNA、miR-200a進(jìn)行檢測 Trizol試劑對細(xì)胞或者組織總RNA進(jìn)行提取，并檢測RNA含量，選取總RNA 1 mg依據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒的說明反轉(zhuǎn)錄獲取cDNA。Real-PCR體系，反應(yīng)條件：95℃下3 min、95℃下10 s、59℃下30 s，共進(jìn)行40循環(huán)。內(nèi)參為U6/GAPDH，2-△△Ct計(jì)算YAP1、miR-200a mRNA表達(dá)量。

1.2.3 Western blot對YAP1蛋白表達(dá)量檢測 轉(zhuǎn)染48 h后采集細(xì)胞，PBS洗滌3次，細(xì)胞總蛋白使用蛋白裂解液提取，蛋白含量使用BCA法檢測。選取蛋白40 mg上樣，在SDS-PAGE電泳30 min，而后將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜內(nèi)，5%脫脂奶粉封閉液加入，在室溫下封閉2 h，β-actio、YAPA1一抗加入，在0℃下過夜，第2天洗膜，二抗加入后在室溫下孵育2 h，洗膜ECL發(fā)光劑加入，凝膠成像顯影，YPA1和β-actin的蛋白條帶灰度比值為YPA1表達(dá)量。

1.2.4 CCK-8對細(xì)胞增殖活力檢測 96孔板內(nèi)接種轉(zhuǎn)染24 h后細(xì)胞，行常規(guī)培養(yǎng)，依據(jù)CCK-8試劑盒說明在轉(zhuǎn)染24、48、72及96 h時(shí)加入CCK-8溶液10 mL，在劑量為50 mL/L的CO2、37℃培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2 h，450 nm吸光度使用酶標(biāo)儀檢測，重復(fù)3次。

1.2.5 預(yù)測miR-200a靶基因和雙熒光素酶驗(yàn)證 使用miRNA靶基因的預(yù)測軟件miRanda聯(lián)合基因功能分析，篩出miR-200a直接靶基因可能為YAP1。帶有突變型聯(lián)合位點(diǎn)熒光載體pmirGLO-YAP1-mtUTR與帶野生型聯(lián)合位點(diǎn)熒光載體pmirGLO-YAP1-wtUTR由上海吉瑪公司構(gòu)建。行轉(zhuǎn)染前1 d，24板孔內(nèi)接種肺癌A549細(xì)胞，在轉(zhuǎn)染當(dāng)前把測序驗(yàn)證正確pmirGLO-YAP1-mtUTR或者pmirGLO-YAP1-wtUTR熒光載體和mimics-NC或者miR-200a mimics對肺癌A549進(jìn)行轉(zhuǎn)染，并分成四組，在轉(zhuǎn)染48 h后采集細(xì)胞，依據(jù)雙熒光素酶活性說明書對海腎熒光素酶、螢火蟲熒光素酶活性檢測。熒光酶活性=螢火蟲熒光素酶活性/海腎熒光素酶活性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料且符合正態(tài)分布以（x±s）表示，采用t檢驗(yàn)或方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞及組織內(nèi)miR-200a表達(dá)狀況

肺癌細(xì)胞株SK-MES-1、NCI-H520及A549內(nèi)miR-200a表達(dá)量均低于正常細(xì)胞株16HBE，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）（表1），且A549內(nèi)表達(dá)量最低，所以在后續(xù)研究中選取A549。

2.2 miR-200a表達(dá)上調(diào)對肺癌細(xì)胞A549增殖活力抑制狀況

PCR檢測顯示A549轉(zhuǎn)染以后miR-200a mimics細(xì)胞內(nèi)miR-200a的表達(dá)量為（5.61±0.42），轉(zhuǎn)染Mimic-NC組細(xì)胞內(nèi)miR-200a表達(dá)量為（1.05±0.40），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=4.072，P<0.05），說明轉(zhuǎn)染效果比較高。CCk-8檢測顯示miR-200a mimics組內(nèi)A549細(xì)胞在48、72及96 h時(shí)其吸光度均低于Mimics-NC，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表2。

2.3 miR-200a直接調(diào)控靶基因?yàn)閅AP1

采用miRanda靶基因預(yù)測數(shù)據(jù)庫聯(lián)合基因功能顯示，YAP1可能為miR-200a靶基因，miR-200a種子序列和YAP1 3-UTR在理論上有互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)。miR-200a mimics結(jié)合野生型YAP1-wtUTR后其細(xì)胞熒光素酶活性比低于miR-200a mimics結(jié)合野生型YAP1-wtUTR，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表3。

2.4 miR-200a上調(diào)后對YAP1蛋白及mRNA表達(dá)抑制影響

PCR檢測顯示，miR-200a內(nèi)YAP1 mRNA表達(dá)量為（0.54±0.07），Mimics-N內(nèi)YAP1 mRNA表達(dá)量為（1.07±0.09），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=4.071，P<0.05），Western blot顯示miR-200a內(nèi)YAP1蛋白表達(dá)量比Mimics-NC低。見圖1。

2.5 YAP1下調(diào)對肺癌A549增殖活力抑制狀況

肺癌A549轉(zhuǎn)染siRNA-NC或siRNA-YAP1后，PCR檢測顯示siRNA-YAP1內(nèi)YAP1 mRNA表達(dá)量為（0.37±0.06），siRNA-NC內(nèi)YAP1 mRNA表達(dá)量為（1.03±0.07），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=4.180，P<0.05）；Western blot顯示siRNA-YAP1內(nèi)YAP1蛋白表達(dá)量比siRNA-NC低（圖2）；CCk-8檢測顯示siRNA-YAP1內(nèi)YAP1細(xì)胞吸光度在48、72及96 h時(shí)均低于siRNA-NC，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）（表4）。

3 討論

miR-200a是miR-200成員之一，當(dāng)前相關(guān)研究顯示機(jī)體惡性腫瘤和miR-200a異常表達(dá)聯(lián)系緊密[5]，Gao SL等[6]研究顯示，神經(jīng)母細(xì)胞瘤內(nèi)miR-200a表達(dá)量比癌旁組織顯著下降，而miR-200a表達(dá)上調(diào)后可經(jīng)過靶向AP-2γ基因?qū)Τ闪黾澳[瘤細(xì)胞增殖有抑制作用。Yao J等[7]研究表明乳腺癌患者機(jī)體內(nèi)miR-200a表達(dá)量降低，而miR-200a表達(dá)上調(diào)后可經(jīng)過靶向TFAM基因?qū)δ[瘤細(xì)胞增殖起到抑制作用。本研究經(jīng)過Real-time PCR對正常肺支氣管上皮細(xì)胞16HBE、肺癌細(xì)胞SK-MES-1、NCI-H520、A549及25例非小細(xì)胞癌癌旁組織與癌組織內(nèi)miR-200a表達(dá)量檢測顯示，肺癌細(xì)胞系及非小細(xì)胞肺癌組織內(nèi)miR-200a表達(dá)量均顯著下降，和其他相關(guān)研究一致。為進(jìn)一步分析miR-200a對于肺癌細(xì)胞的增殖狀況，本研究經(jīng)過脂質(zhì)體介導(dǎo)把miR-200a mimics轉(zhuǎn)染到肺癌A549細(xì)胞內(nèi)，A549細(xì)胞成功過表達(dá)miR-200a。CCK-8檢測顯示，miR-200a過量表達(dá)對肺癌A549細(xì)胞增殖活力有抑制作用，說明miR-200a對肺癌細(xì)胞增殖有抑制影響，為肺癌的“抑癌基因”。

一個miRNA能夠參加到多個靶基因的調(diào)控，同時(shí)每個靶基因會受到數(shù)個miRNA進(jìn)行同時(shí)調(diào)控。在腫瘤內(nèi)miRNA影響取決于調(diào)控下游靶基因內(nèi)生物學(xué)效應(yīng)[8-10]。Chen Y等[11]研究顯示，miR-200a能夠經(jīng)過靶向TSOAN1對肺癌細(xì)胞侵襲起到抑制作用。Zhen Q等[12]研究表明miR-200a可經(jīng)過靶向c-Met及EGFR對肺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移和侵襲起到抑制影響。為分析miR-200a對于肺癌細(xì)胞增殖相關(guān)機(jī)制，本研究采用靶基因的預(yù)測數(shù)據(jù)庫，同時(shí)聯(lián)合基因功能進(jìn)行判別，結(jié)果顯示YAP1可能為miR-200a靶基因，miR-200a種子序列和YAP1 3UTR區(qū)在理論上其結(jié)合位點(diǎn)可互補(bǔ)，經(jīng)過雙熒光素酶驗(yàn)證miR-200a可和YAP1 3UTR區(qū)特異性聯(lián)合，降低熒光蛋白表達(dá)量，為更進(jìn)一步證明miR-200a靶基因是否是YAP1，使用Western blot與Real time PCR檢測顯示miR-200a表達(dá)上調(diào)后可使YAP1蛋白及mRNA表達(dá)量下降，說明miR-200a對于YAP1基因有負(fù)調(diào)控影響，也驗(yàn)證了miR-200a直接靶基因?yàn)閅AP1。YAP1為Hippo信號路徑下游的信號分子，對于機(jī)體內(nèi)源性穩(wěn)態(tài)、DNA修復(fù)及細(xì)胞生長發(fā)育有重要影響[13-15]。相關(guān)研究顯示，YAP1在正?；罨癄顩r時(shí)加速機(jī)體修復(fù)創(chuàng)傷，而在超激活狀況時(shí)對細(xì)胞增殖有加速作用，促進(jìn)產(chǎn)生腫瘤[16-18]。本研究經(jīng)過YAP1表達(dá)量下調(diào)對肺癌A549細(xì)胞增殖有抑制作用，與miR-200a表達(dá)上調(diào)對肺癌A549細(xì)胞影響一致，由此說明miR-200a可經(jīng)過調(diào)控YAP1基因而對肺癌細(xì)胞增殖發(fā)揮作用，與王新勝[19]關(guān)于 MicroRNA-200a靶向調(diào)控對腎細(xì)胞癌生物學(xué)行為影響相近，值得給予關(guān)注。有報(bào)道研究顯示很多肺癌組織內(nèi)都有S期激酶相關(guān)蛋白2，而且隨著腫瘤惡性程度的增加體內(nèi)S期激酶相關(guān)蛋白2表達(dá)也顯著加強(qiáng)，S期激酶的相關(guān)蛋白2則和磷酸化細(xì)胞周期的負(fù)性調(diào)控因子p27表達(dá)為負(fù)相關(guān)[20]，S期激酶相關(guān)蛋白2能夠特異性辨別抑癌的基因p27，經(jīng)過泛素化路徑使p27降解，細(xì)胞周期出現(xiàn)異常調(diào)控，參加了肺癌細(xì)胞的增殖與發(fā)展。

綜上所述，miR-200a對肺癌細(xì)胞增殖的抑制作用主要是經(jīng)過靶向作用YAP1基因來實(shí)現(xiàn)的，進(jìn)而在肺癌內(nèi)起到抑癌功能。

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（收稿日期：2018-07-12）