免疫磁珠高通量自動凈化-超高效液相色譜法測定糧食中玉米赤霉烯酮

陳金男，葉 金,*，郭旭光，李 麗，劉洪美，吳 宇，王松雪,*

（1.國家糧食和物資儲備局科學研究院，糧油質(zhì)量安全研究所，北京 102629；2.河南省口岸食品檢驗檢測所，河南 鄭州 450003）

玉米赤霉烯酮為首次從患有赤霉病的玉米中分離得到的鐮刀菌代謝產(chǎn)物，廣泛存在于霉變的玉米、高粱、小麥等糧食及其制品中，嚴重危害人類及動物的健康。玉米赤霉烯酮有強烈的生殖毒性和致畸作用，影響家畜的繁殖，給畜牧業(yè)造成很大的經(jīng)濟損失[1-4]。我國和歐盟對谷物中的玉米赤霉烯酮制定了相關限量標準[5-6]。GB 2761—2017《食品中真菌毒素限量》中食品（谷物及其制品）中的玉米赤霉烯酮限量為60 μg/kg[5]。李丹迪等[7]對山東省濟南市區(qū)4 個不同地點隨機采集的50 份即食谷物加工制品中玉米赤霉烯酮含量進行檢測，76.0%的樣本檢出玉米赤霉烯酮陽性，其中8 份樣品超過我國食品中規(guī)定限量，受污染樣品的最大值為國家限量標準值的3.1 倍。陳皆全[8]在2017—2019年間對廣西省百色市12 個縣（市、區(qū)）隨機抽取的186 份處于收獲期的玉米中玉米赤霉烯酮含量進行檢測，玉米赤霉烯酮檢出率為45.16%，其中最高含量為4 221.0 μg/kg，超標率為22.04%，收獲期玉米受污染較為嚴重。Golge等[9]從土耳其采集了240 份糧食樣本，其中，4%的小麥、20%的玉米、55%的稻谷和4%的面粉中檢測出玉米赤霉烯酮陽性，1 份稻谷樣本超過歐盟對玉米赤霉烯酮的限量。因此，糧食及其制品中的玉米赤霉烯酮污染較為普遍，加強對糧食中玉米赤霉烯酮污染情況的監(jiān)測至關重要。

樣品前處理是糧食中玉米赤霉烯酮分析方法的重要步驟。前處理方法影響檢測結(jié)果的準確性和精密度，是最耗時、容易出錯的步驟。糧食中玉米赤霉烯酮的前處理方法主要有免疫親和柱法[10-11]、固相萃取柱法[12-13]、QuEChERS（quick, easy, cheap, effective, rugged and safe）[14-15]法等，上述方法雖然能夠有效提取糧食中的玉米赤霉烯酮，但是存在操作復雜、耗時長、成本高等缺點。免疫磁珠（immunomagnetic beads，IMBs）是新型磁性納米粒子材料，具有超順磁性、尺寸小及可進行多樣化修飾等特點。近幾年，基于免疫磁珠的凈化方法由于靈敏度高、操作簡單、耗時短、可批處理樣品、人員要求低等優(yōu)點，受到了廣泛關注與研究[16-17]。免疫磁珠凈化方法通過免疫磁珠上玉米赤霉烯酮抗體特異性的親和作用將玉米赤霉烯酮從樣品稀釋液中識別和富集出來，清洗雜質(zhì)，再利用有機試劑破壞免疫磁珠上抗體的空間結(jié)構(gòu)，從免疫磁珠上釋放玉米赤霉烯酮，便于后續(xù)的分析檢測。孫毅蒙等[18]以金屬有機框架為基礎，制備出Fe3O4@AMP&ZnCl2·ZEA單抗磁珠用于玉米中玉米赤霉烯酮的檢測。制備磁珠的玉米赤霉烯酮毒素負載量為3 μg/100 mg。對玉米粉進行3 個水平的添加回收率實驗，回收率在84.61%～90.00%之間，相對標準偏差為4.86%～9.44%。劉玉梅等[19]通過玉米赤霉烯酮與對苯二胺反應，制備玉米赤霉烯酮免疫磁珠分離富集試劑盒，試劑盒對樣品中玉米赤霉烯酮的捕獲量為50 ng/mL。在捕獲量范圍內(nèi)的添加回收率為65.4%～93.8%，且對與玉米赤霉烯酮結(jié)構(gòu)或功能相似的競爭藥物無交叉反應，具有較高的特異性。上述免疫磁珠凈化方法雖然能夠滿足糧食中玉米赤霉烯酮的分離與純化，但是步驟仍較為復雜，需手動進行，且凈化時間較長。因此，采用自動化、高通量的前處理方法具有重要意義[20-22]。本方法開發(fā)的自動凈化、高通量前處理方法能有效減少前處理時間，提高效率，且避免人為因素影響實驗結(jié)果，可提高糧食中玉米赤霉烯酮常規(guī)檢測的準確性、便捷性和重復性。

目前常規(guī)高效液相色譜法多用于檢測糧食中玉米赤霉烯酮，但該方法分析速度慢、溶劑耗費多、靈敏度低。為建立一種高效、靈敏的快速定量分析方法，本實驗采用超高效液相色譜（ultra-high performance liquid chromatography，UPLC）檢測糧食中的玉米赤霉烯酮。相比于高效液相色譜，UPLC具有進樣量小、分離度高、靈敏度高、分析速度快等優(yōu)點，是近年來用于微量快速分析的熱門方法[23-26]。

本實驗結(jié)合免疫磁珠高通量自動凈化的前處理方法，基于UPLC分離技術，建立一種操作簡單、快速準確、成本低的檢測方法，以期滿足糧食中玉米赤霉烯酮高通量、自動化、高準確性和高靈敏度的檢測需求。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玉米赤霉烯酮甲醇溶液（GBW(E)100301）、玉米全粉嘔吐毒素、玉米赤霉烯酮成分標準物質(zhì)（GBW(E)100383）、國家有證標準物質(zhì)全麥粉玉米赤霉烯酮成分標準物質(zhì)（GBW(E)100384）、玉米全粉玉米赤霉烯酮成分標準物質(zhì)（GBW(E)100385）、糙米粉玉米赤霉烯酮質(zhì)控樣品（TOXIN-JTZK-015）、全麥粉玉米赤霉烯酮質(zhì)控樣品（TOXIN-JTZK-003）、全麥粉玉米赤霉烯酮質(zhì)控樣品（TOXIN-JTZK-030）、全麥粉空白（TOXIN-JTZK-006）、玉米全粉空白（TOXINJTZK-005） 國家糧食和物資儲備局科學研究院；糧食中玉米赤霉烯酮免疫磁珠試劑盒 北京東孚久恒儀器技術有限公司；玉米赤霉烯酮免疫親和柱 北京華安麥科生物技術有限公司；甲醇、乙腈（均為色譜純） 美國Fisher公司；桶裝水 中國屈臣氏（香港）有限公司；0.2 μm PTFE膜針頭過濾器 美國PALL公司；高純氮北京千禧京城氣體有限公司；移液槍（100～1 000 μL）德國Eppendorf公司。

1.2 儀器與設備

Acquity UPLC儀、Acquity熒光檢測器 美國Waters公司；JJHZ10真菌毒素全自動凈化儀 北京東孚久恒儀器技術有限公司；5810R臺式高速冷凍離心機 德國Eppendorf公司；MTV-100多管旋渦混合儀 杭州奧盛儀器有限公司；電子天平 賽多利斯科學儀器有限公司；N-EVAP112快速溶劑吹干器 美國Organomation公司。

1.3 方法

1.3.1 標準溶液配制

用移液槍準確吸取一定體積的玉米赤霉烯酮甲醇標準溶液，用甲醇-水（1∶1，V/V）稀釋成5、10、20、50、100、200、500 ng/mL的標準工作液于2 mL進樣瓶中，渦旋混勻后，室溫保存以備檢測。

1.3.2 樣品前處理

糧食樣品經(jīng)過粉碎（90%通過20 目篩）混勻后，準確稱?。?.00±0.01）g于50 mL離心管中，加入15 mL提取液，充分振蕩20 min，室溫、7 000 r/min離心5 min。吸取1 mL上清液加入到試劑盒樣品孔中，將試劑盒放置到真菌毒素全自動凈化儀中，啟動玉米赤霉烯酮凈化程序。凈化結(jié)束后，及時吸取洗脫孔0.4 mL洗脫液，50 ℃氮吹至干，用0.4 mL流動相進行復溶，渦旋30 s溶解殘留物，用0.22 μm有機濾膜過濾后收集在進樣瓶中，室溫保存以備檢測。

1.3.3 免疫磁珠高通量自動凈化及UPLC檢測流程

免疫磁珠高通量自動凈化-UPLC檢測流程如圖1所示。糧食樣品經(jīng)過提取后，吸取上清液加入試劑盒稀釋孔中，隨即將試劑盒放入真菌毒素全自動凈化儀中，啟動凈化程序，自動完成樣品的稀釋、毒素富集、雜質(zhì)清洗和目標物的洗脫等流程。凈化結(jié)束后準確吸取洗脫液進行氮吹、復溶和過濾，即可上機檢測。每個樣品的磁珠使用量為1 mg，含有抗體約0.4 mg。

圖1 免疫磁珠高通量自動凈化-UPLC檢測流程圖Fig.1 Flow chart of high-throughput automatic purification based on immunomagnetic beads coupled with UPLC

1.3.4 儀器條件

真菌毒素全自動凈化儀凈化程序：磁珠轉(zhuǎn)移到樣品孔，混合5 min，磁吸7.5 min；磁珠轉(zhuǎn)移到清洗孔（2 個），每個清洗孔清洗1 min，磁吸1 min；磁珠轉(zhuǎn)移到洗脫孔，洗脫1 min，磁吸1 min后將磁珠轉(zhuǎn)移到磁珠回收孔，凈化結(jié)束。單個樣品中玉米赤霉烯酮的自動凈化時間為26 min。

UPLC條件：色譜柱為BEH-C18柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；柱溫40 ℃，樣品溫度10 ℃；進樣量10 μL。流動相：水-乙腈（45∶55，V/V）溶液，等度洗脫，流速0.2 mL/min。熒光檢測波長：激發(fā)波長303 nm，發(fā)射波長440 nm。

1.3.5 分析方法的驗證

對免疫磁珠高通量自動凈化-UPLC方法進行加標回收率、重復性、穩(wěn)定性、線性范圍、檢出限（limit of detection，LOD）和定量限（limit of quantitation，LOQ）測定。LOD和LOQ采用逐級稀釋法得到，峰響應值RSN=3時確定LOD，RSN=10時確定LOQ。對糧食陰性樣品（小麥、玉米）進行3 個不同添加量水平（低、中、高）基質(zhì)加標回收率的測定?；|(zhì)加標后在室溫25 ℃放置過夜，以蒸發(fā)加入標準溶液中的有機溶劑。除基質(zhì)加標回收率的研究，還通過檢測國家有證標準物質(zhì)或質(zhì)控樣品評估該方法的準確性和精密性。在60 μg/kg加標量測定重復性，重復測定4 d，考察該方法的穩(wěn)定性。采用t檢驗和Bland-Altman法對免疫磁珠和免疫親和柱凈化法之間的差異進行分析。

1.4 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)均使用Microsoft Excel 2016軟件計算，并使用OriginPro 8.5軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 免疫磁珠與玉米赤霉烯酮反應時間的優(yōu)化

將免疫磁珠與玉米赤霉烯酮標準溶液（添加量60 μg/kg）反應，分別考察不同反應時間（2、5、8、12 min）下磁珠與玉米赤霉烯酮的結(jié)合效率（圖2）。反應5 min后磁珠吸附玉米赤霉烯酮的回收率可達99.36%。反應時間超過5 min后，回收率未明顯提高。因此，在免疫磁珠自動凈化過程中，免疫磁珠與玉米赤霉烯酮反應5 min即可達到預期效果。

圖2 免疫磁珠與玉米赤霉烯酮反應時間的優(yōu)化（n=3）Fig.2 Optimization of reaction time between immunomagnetic beads and zearalenone (n = 3)

2.2 樣品提取液的優(yōu)化

在全麥粉和玉米全粉陰性樣品中加入玉米赤霉烯酮標準溶液（添加量60 μg/kg），加標回收率如圖3所示。70%甲醇-水、90%乙腈-水和70%乙腈-水3 種提取液的加標回收率在合理范圍內(nèi)，但是70%甲醇-水對小麥和玉米基質(zhì)的提取效果相對較差。當免疫磁珠從提取稀釋液中識別和富集玉米赤霉烯酮時，較大比例的有機試劑會對免疫磁珠上的抗體產(chǎn)生破壞作用。采用不同體積分數(shù)的乙腈（0%、5%、10%、15%、20%、30%）作為提取稀釋液進行測定，將免疫磁珠與玉米赤霉烯酮標準溶液（添加量60 μg/kg）反應測定其加標回收率，結(jié)果如圖4所示。當提取稀釋液中乙腈體積分數(shù)達到30%時，玉米赤霉烯酮的加標回收率明顯下降，僅為65.1%。因此，為保證抗體不被破壞，本方法采用有機試劑相對含量較低的70%乙腈-水作為提取液。

圖3 不同提取液對糧食陰性樣品加標回收效果的影響Fig.3 Effects of different extraction solvents on recoveries of spiked grain matrices

圖4 乙腈體積分數(shù)對免疫磁珠回收率的影響（n=2）Fig.4 Effect of acetonitrile concentration on recoveries of zearalenone (n = 2)

2.3 免疫磁珠對不同糧食基質(zhì)凈化效果的優(yōu)化

如圖5所示，經(jīng)過免疫磁珠凈化后小麥、玉米等糧食基質(zhì)的UPLC圖均較為干凈，目標峰附近沒有干擾物，因此本方法的雜質(zhì)凈化效果良好。

圖5 2種糧食基質(zhì)玉米赤霉烯酮免疫磁珠凈化的UPLC圖Fig.5 UPLC profiles of zearalenone purified with immunomagnetic beads from two grain matrices

2.4 分析方法的驗證

2.4.1 方法的線性范圍、LOD和LOQ

在5～500 ng/mL范圍內(nèi)制備了一系列標準溶液建立標準曲線。以峰面積（Y）與標準溶液質(zhì)量濃度（X）繪制標準曲線，得到回歸方程Y=727.11X+2 151.76，R2=0.999 98，其具有良好的線性，LOD為3.5 μg/kg，LOQ為12.0 μg/kg，均低于我國谷物及其制品中玉米赤霉烯酮的限量[5]，可滿足日常檢測要求。

2.4.2 方法的準確度和精密度

為考察該方法的準確度和精密度，對玉米全粉和全麥粉陰性樣品添加30、60、120 μg/kg的玉米赤霉烯酮進行含量和加標回收率測定，結(jié)果見表1。玉米和小麥進行低、中、高3 個水平的加標回收率在99.04%～109.26%之間，變異系數(shù)不大于6.88%。選用玉米全粉、全麥粉、糙米粉、小麥粉等糧食基質(zhì)中玉米赤霉烯酮成分的國家有證標準物質(zhì)或質(zhì)控樣品驗證該方法的準確性，檢測結(jié)果如表2所示，測定值在標準值及其擴展不確定度范圍內(nèi)，變異系數(shù)不大于3.54%，檢測結(jié)果較理想。

表1 玉米赤霉烯酮免疫磁珠凈化的加標回收率和變異系數(shù)（n=3）Table 1 Spiked recoveries and coefficients of variation of zearalenone with immunomagnetic bead purification (n = 3)

表2 不同糧食基質(zhì)玉米赤霉烯酮成分標準物質(zhì)和質(zhì)控樣品檢測結(jié)果（n =2）Table 2 Results of zearalenone determination in reference materials and quality control samples for different grain matrices (n = 2)

2.4.3 日間精密度考察

采用免疫磁珠自動凈化方法檢測連續(xù)4 d的加標回收率，結(jié)果見表3。本凈化方法連續(xù)4 d的加標回收率平均在101.63%～103.01%之間，日間精密度在4.88%～5.72%之間，重復性良好。

表3 本方法日間精密度Table 3 Intraday precision of the method%

2.4.4 免疫親和柱凈化法（國標法）和免疫磁珠自動凈化法的評測

本實驗分別采用免疫親和柱凈化法（國標法）和全自動凈化儀-免疫磁珠凈化試劑盒對采集于全國不同地區(qū)新收獲的小麥、玉米、糙米共22 個陽性樣品進行測定。采用配對t檢驗，評價2 種凈化方法測定結(jié)果的一致性。如表4所示，通過t檢驗可知，td值（1.46）小于理論t0.05(21)值（2.08），P＞0.05，2 種凈化方法的測定結(jié)果無顯著差異。

表4 免疫親和柱和免疫磁珠凈化測定結(jié)果（n=2）Table 4 Results of zearalenone determination in freshly harvested wheat, corn and brown rice samples by purification using immunoaffinitycolumn and immunomagnetic beads (n = 2)

采用Bland-Altman法對2 種凈化方法之間的差異進行分析，結(jié)果如圖6所示，免疫磁珠凈化方法與免疫親和柱法效果一致[27-29]。有4.5%（1/22）的點在95%一致性界限之外。在一致性界限范圍以內(nèi)，免疫親和柱凈化法和免疫磁珠凈化法的測定值相比，差值的絕對值最大為17.5 μg/kg，差值平均值為-1.8 μg/kg。這2 種凈化方法的差異在可接受范圍內(nèi)，因此可以認為這2 種方法的凈化效果具有較好的一致性，在凈化和富集糧食中玉米赤霉烯酮時，可以互相代替使用。另外，使用免疫磁珠凈化糧食中玉米赤霉烯酮的成本更低，每個樣品檢測成本約是免疫親和柱法的二分之一。

圖6 2種凈化方法Bland-Altman差值法分析圖Fig.6 Bland-Altman plot showing good agreement between two purification methods

3 結(jié) 論

本研究建立了糧食中玉米赤霉烯酮免疫磁珠高通量自動凈化-UPLC的檢測方法，并對全麥粉和玉米全粉陰性樣品添加不同量的玉米赤霉烯酮，檢測其加標回收率，同時使用國家有證標準物質(zhì)和質(zhì)控樣品對本方法進行了驗證。相比于目前廣泛使用的免疫親和柱凈化方法，本方法具有操作簡單、自動化、高通量和成本低等優(yōu)點。采用配對t檢驗和Bland-Altman法分析，結(jié)果表明免疫磁珠凈化與免疫親和柱凈化方法效果一致。UPLC分析方法的LOD、LOQ滿足糧食中玉米赤霉烯酮日常檢測需求。

免疫磁珠凈化方法配套使用的真菌毒素全自動凈化儀可同時凈化10～24 個樣品，平均每個樣品的凈化時間約為2～3 min，可有效減少對操作人員的操作要求，實現(xiàn)高通量、自動化提取糧食中玉米赤霉烯酮；UPLC分析方法的準確度和精密度較高，為高效檢測糧食中玉米赤霉烯酮提供參考。