骨形態(tài)發(fā)生蛋白復(fù)合多孔鈦鈮合金試件的體外成骨分化研究

彭亮權(quán)，許 鑒，周 勇，陳 康，李 瑛，陸 偉，朱偉民，王大平

作為最常用的金屬材料之一，鈦及其合金被廣泛應(yīng)用于骨科領(lǐng)域，機(jī)械性能優(yōu)異，骨接觸相容性良好。鈦鈮合金是一種新型骨科植入物材料，具有無(wú)毒性、抗腐蝕性良好等特點(diǎn)[1]。本研究自行設(shè)計(jì)多孔鈦鈮合金試件，觀察體外兔骨髓間充質(zhì)干 細(xì) 胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）與復(fù)合骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）、未復(fù)合BMP的金屬試件共培養(yǎng)后分化生長(zhǎng)的情況，分析多孔鈦鈮合金試件的細(xì)胞相容性，探討B(tài)MP對(duì)其成骨活性的影響，從而為鈦鈮合金植入材料的研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選取3～4月齡健康新西蘭純種大白兔4只（實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK2015-0106），體重2.5～3.0 kg，雌雄不限，以顆粒干飼料及間斷青飼料喂養(yǎng)。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)材料和儀器

1.2.1主要實(shí)驗(yàn)材料 FXNb-1鈦鈮粉（Ti-25Nb，株州硬質(zhì)合金廠）、聚乙烯醇（PVA，天津光復(fù)精細(xì)化工研究所）。

1.2.2主要實(shí)驗(yàn)試劑 DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶（Gibco公司，美國(guó)）；透明質(zhì)酸酶、0.1%膠原酶Ⅱ（Sigma公司，美國(guó)）；PBS液（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）；水溶性rhBMP-2（pH值7.25～7.40，純度95%，上海環(huán)亞生物科技有限公司）；骨鈣素放免分析試劑盒（中國(guó)原子能科學(xué)研究院）；堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）檢測(cè)試劑盒（南京建成生物工程研究所）。

流式細(xì)胞檢測(cè)抗體CD44（賽業(yè)生物科技有限公司）、CD29（eBioScience公司，美國(guó)）、CD34（北京博奧森生物技術(shù)有限公司）；熒光標(biāo)記物選用PE熒光染料，抗體采用羊抗兔單克隆抗體（Abcam公司，英國(guó)）。

1.2.3主要實(shí)驗(yàn)儀器 倒置相差顯微鏡（Olympus公司，日本）、JSM-6050型LV掃描電子顯微鏡（日本電子株式會(huì)社）、IB-5離子濺射儀（EiKO公司，日本）、GS-15R超凈工作臺(tái)（Beckmen公司，美國(guó)）、流式細(xì)胞儀（Becton Dickinson公司，美國(guó)）。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組及方法

1.3.1多孔鈦鈮合金試件的制備 采用粉末冶金法，將鈦鈮粉、PVA水溶液制備成浸漬漿料，干燥后燒結(jié)，制備加工成直徑10 mm、厚1 mm、孔徑200～500μm、70%孔隙率的鈦鈮合金圓盤形樣品10枚（圖1）。隨機(jī)分為單純實(shí)驗(yàn)試件組（A組）和復(fù)合rhBMP-2實(shí)驗(yàn)試件組（B組），每組各5枚。

圖1多孔鈦鈮合金試件 1A實(shí)物圖片 1B電鏡掃描圖片（70%孔隙率，材料表面粗糙，孔隙間三維連通，孔徑為200～500μm，×50）

1.3.2復(fù)合rhBMP-2多孔鈦鈮合金試件的制備 將5枚B組試件分別稱重，每克樣品加入20 mL濃度為100 ng/L的rhBMP-2，加入鹽酸胍溶液振蕩，室溫下作用5 h。棄去上清液，以3 500 r/min、30℃離心30 min。半透膜打包樣本，4℃條件下檸檬酸透析液透析，持續(xù)72 h，每隔4 h更換一次透析液。30℃水浴1 h，17 500 r/min高速離心80 min。取沉淀物置入表面經(jīng)1∶1氯仿甲醇洗滌的容器，4℃下自然干燥4 d。

1.3.3兔BMSCs混懸液的制備 取實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，3%戊巴比妥鈉l mL/kg耳緣靜脈注射麻醉。以16號(hào)骨穿針于股骨髁抽取2 mL骨髓，同法抽取另一側(cè)股骨髁上骨髓，抽吸l mL DMEM/F12培養(yǎng)液，將骨髓與培養(yǎng)液充分混勻，離心取細(xì)胞層，制成單細(xì)胞懸液，經(jīng)細(xì)胞計(jì)數(shù)后，以3×105個(gè)細(xì)胞/cm2接種培養(yǎng)瓶，置于37℃、5%CO2飽和濕度孵箱內(nèi)孵育，3 d后首次全量換液，棄去大量懸浮細(xì)胞，以后隔日換液。待細(xì)胞融合成單層后隨即傳代培養(yǎng)，每天在倒置顯微鏡下觀察培養(yǎng)瓶中細(xì)胞的形態(tài)變化和生長(zhǎng)狀況。

取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期第3代的兔BMSCs進(jìn)行流式細(xì)胞儀分析。采用流式細(xì)胞分析儀對(duì)干細(xì)胞表面抗原進(jìn)行分析。收集約 2×106個(gè)P3代細(xì)胞，1 500 r/min離心4 min后棄去上清液，Buffer液重懸，吸取100μL細(xì)胞懸液（約3.0×105個(gè)細(xì)胞）加入Ep管內(nèi)，按量加入抗體CD44、CD29和CD34抗體。避光孵育30 min，1 500 r/min離心4 min后棄去上清液。每樣品管加入300μL Buffer溶液重懸，上機(jī)檢測(cè)，所對(duì)應(yīng)的激發(fā)波長(zhǎng)488 nm，發(fā)射波長(zhǎng)575 nm。

取BMSCs第4、5代，0.25%胰酶消化1 min后，加入10%PBS溶液4～5 mL物理吹打后，收集并進(jìn)行細(xì)胞記數(shù)。以1 500 r/min離心5 min，加入DMEM培養(yǎng)液制備成3×107/mL的細(xì)胞混懸液。

1.3.4 BMSCs與實(shí)驗(yàn)試件復(fù)合 分別將A組和B組試件置入細(xì)胞混懸液中，37℃、5%CO2條件下靜置2 h，倒置相差顯微鏡下觀察，待BMSCs貼附于試件后，將各試件移入6孔培養(yǎng)板中，37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。隔日換液。

1.3.5 BMSCs在實(shí)驗(yàn)試件上的成骨活性鑒定

1.3.5.1倒置相差顯微鏡觀察 分析BMSCs與兩組實(shí)驗(yàn)試件復(fù)合后細(xì)胞貼附增殖情況、形態(tài)變化和分化程度。

1.3.5.2培養(yǎng)上清液ALP測(cè)定 收集兩組試件BMSCs細(xì)胞復(fù)合后3、6、9、12、15 d各孔培養(yǎng)液，冷凍干燥，取100μL PBS復(fù)溶，離心取上清液，按試劑盒說明進(jìn)行ALP活性檢測(cè)（標(biāo)準(zhǔn)管中加入50μL酚標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液，空白管加入雙蒸水50μL，各管加入緩沖液0.5 mL和基質(zhì)液0.5 mL，充分混勻，37℃水浴15 min，加入顯色劑1.5 mL，立即混勻，選擇520 nm波長(zhǎng)、0.5 cm光徑，空白管調(diào)零，以分光光度計(jì)比色，測(cè)各管吸光度），根據(jù)下列公式計(jì)算ALP活性：ALP（金氏單位/100 mL）=（測(cè)定管吸光度/標(biāo)準(zhǔn)管吸光度）×10。

1.3.5.3培養(yǎng)上清液骨鈣素檢測(cè) 兩組試件復(fù)合于細(xì)胞培養(yǎng)液中培養(yǎng)2、4、6、8、10、12、14 d，收集各孔培養(yǎng)液，冷凍干燥，取100μL PBS復(fù)溶，離心取上清液，進(jìn)行骨鈣素檢測(cè)。取125I標(biāo)記的骨鈣素及骨鈣素抗體100 pL混勻，4℃放置24 h，每管加入20%PEG 500μL分離劑，充分混勻，室溫放置 20 min，4℃、3 500 r離心20 min，棄去上清液，測(cè)沉淀cpm數(shù)，由自動(dòng)γ計(jì)數(shù)儀預(yù)先編制程序，直接給出相關(guān)參數(shù)、標(biāo)準(zhǔn)曲線及樣品濃度，結(jié)果以ng/mL/孔表示。

1.3.5.4電鏡掃描觀察 兔BMSCs與試件復(fù)合培養(yǎng)24 h、2周、4周，用PBS漂洗細(xì)胞表面，4℃預(yù)冷的3%濃度戊二醛固定24 h，吸出固定液，PBS浸洗2次，每次10 min。用4℃預(yù)冷的鋨酸固定1 h。PBS浸洗2次，每次10 min。乙醇系列梯度（30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%）脫水，每種濃度酒精通過2次，每次15 min。CO2臨界點(diǎn)干燥，離子濺射儀真空噴金，掃描電鏡觀察試件表面結(jié)構(gòu)及孔洞內(nèi)細(xì)胞生長(zhǎng)情況。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 倒置相差顯微鏡觀察結(jié)果

兔BMSCs原代接種于培養(yǎng)瓶后，可見細(xì)胞呈類圓形懸浮。A組試件置于細(xì)胞混懸液24 h后，可見試件下方蓋玻片上有BMSCs貼附，細(xì)胞形態(tài)呈長(zhǎng)梭形，胞體多有突起；2周后細(xì)胞數(shù)量增多，但仍呈單層生長(zhǎng)。B組復(fù)合培養(yǎng)2周后大部分細(xì)胞表現(xiàn)出成骨細(xì)胞形態(tài)，多數(shù)呈三角形、多角形或不規(guī)則性，多有偽足，胞核偏于一側(cè)，呈復(fù)層生長(zhǎng)，鏡下視野可見細(xì)胞結(jié)節(jié)。4周后兩組棄去培養(yǎng)液，行蓋玻片茜紅染色，B組可見鈣結(jié)節(jié)生成，A組則無(wú)。見圖2。

經(jīng)抗CD29、CD34、CD44兔抗人單克隆抗體流式細(xì)胞鑒定，第三代BMSCs中96%表達(dá)CD44，95%表達(dá)CD29，僅有5%表達(dá)CD34（圖3）。

2.2 培養(yǎng)上清液ALP活性測(cè)定結(jié)果

圖2兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）復(fù)合培養(yǎng)顯微鏡圖片（A組：?jiǎn)渭儗?shí)驗(yàn)試件組；B組：復(fù)合rhBMP-2實(shí)驗(yàn)試件組）2A BMSCs原代接種傳代到第4～5代，細(xì)胞呈小圓形懸浮狀態(tài)（×100）2B BMSCs與A組試件復(fù)合培養(yǎng)24 h，細(xì)胞已貼壁（×100）2C BMSCs與A組試件復(fù)合培養(yǎng)2周，細(xì)胞增多，但仍呈單層生長(zhǎng)（×100）2D BMSCs與B組試件共同培養(yǎng)2周，大部分細(xì)胞已向成骨細(xì)胞分化，表現(xiàn)出成骨細(xì)胞形態(tài)（×200）2E B組試件與BMSCs共同培養(yǎng)4周，可見鈣結(jié)節(jié)生成（茜紅染色，×200）

如圖4所示，隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，兩組ALP值逐漸升高，B組第6天表現(xiàn)出明顯的陡升趨勢(shì)，與A組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000），培養(yǎng)9、12、15 d時(shí)B組ALP均明顯高于A組（均P=0.000）。

2.3 培養(yǎng)上清液骨鈣素檢測(cè)結(jié)果

隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，兩組培養(yǎng)上清液骨鈣素逐漸升高，至12 d時(shí)達(dá)到高峰；比較2、4、6、8、10、12和14 d兩組骨鈣素濃度，B組均顯著高于A組（均P=0.000），見圖5。

2.4 電鏡掃描觀察結(jié)果

共培養(yǎng)2周后電鏡掃描觀察，A組可見大量細(xì)胞附著在材料外表面和孔洞內(nèi)，細(xì)胞形態(tài)呈梭形，表現(xiàn)為單層生長(zhǎng)，B組則呈復(fù)層生長(zhǎng)。4周后B組材料孔洞內(nèi)可見鈣沉積，而A組材料孔洞內(nèi)未有鈣沉積（圖6）。

圖3第三代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中96%表達(dá)CD44，95%表達(dá)CD29，僅有5%表達(dá)CD34

圖4兩組多孔鈦鈮合金試件與兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞共培養(yǎng)不同時(shí)間點(diǎn)上清液堿性磷酸酶（ALP）活性測(cè)定（A組：?jiǎn)渭儗?shí)驗(yàn)試件組；B組：復(fù)合rhBMP-2實(shí)驗(yàn)試件組；*與A組比較，P＜0.05）

圖5兩組多孔鈦鈮合金試件與兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞共培養(yǎng)不同時(shí)間點(diǎn)上清液骨鈣素濃度檢測(cè)（A組：?jiǎn)渭儗?shí)驗(yàn)試件組；B組：復(fù)合rhBMP-2實(shí)驗(yàn)試件組；*與A組比較，P＜0.05）

圖6兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）復(fù)合培養(yǎng)電鏡掃描圖片（A組：?jiǎn)渭儗?shí)驗(yàn)試件組；B組：復(fù)合rhBMP-2實(shí)驗(yàn)試件組）6A A組試件與BMSCs復(fù)合培養(yǎng)后2周，可見孔洞內(nèi)細(xì)胞呈梭形、表現(xiàn)為單層生長(zhǎng)（×100）6B，6C A組試件與BMSCs復(fù)合培養(yǎng)后4周，材料表面和孔洞內(nèi)均未見鈣沉積（E×50，F(xiàn)×100）6D B組試件與BMSCs復(fù)合培養(yǎng)后2周，可見孔洞內(nèi)細(xì)胞呈梭形，表現(xiàn)為復(fù)層生長(zhǎng)（×100）6E，6F B組試件與BMSCs復(fù)合培養(yǎng)后4周，材料表面和孔洞內(nèi)均可見鈣沉積（白色箭頭所指為鈣沉積部位，×100）

3 討論

鈦合金包括α合金、α+β合金和β合金3種類型，其中α+β合金可作為純鈦的替代品，像鈦鋁釩合金，是目前骨科植入物最常使用的材料[2-3]。但其含有鋁、釩等毒性元素，可能對(duì)人體造成潛在的危害。為較好地解決這一問題，人們用金屬鈮元素、鐵元素來(lái)替代釩元素，既無(wú)毒性，同時(shí)又具有良好的抗腐蝕性[4]。

3.1 多孔鈦鈮合金的生物學(xué)性能

骨科內(nèi)植物尤其是人工關(guān)節(jié)的力學(xué)性能，對(duì)于生物材料-骨結(jié)合界面及其在體內(nèi)的穩(wěn)定性有著至關(guān)重要的影響。在滿足機(jī)體負(fù)重所需的力學(xué)強(qiáng)度的同時(shí)，其彈性模量必須與骨的彈性模量相近，而單純鈦合金的彈性模量均明顯高于骨本身，植入后易導(dǎo)致應(yīng)力遮擋效應(yīng)，引發(fā)骨重塑，改變骨形態(tài)，最終導(dǎo)致骨吸收[5-6]，進(jìn)而影響假體的遠(yuǎn)期效果，引起骨質(zhì)疏松、植入物松動(dòng)移位甚至術(shù)后再骨折，翻修手術(shù)的難度也相應(yīng)增加。

為降低鈦合金材料的彈性模量，多孔設(shè)計(jì)得到廣泛應(yīng)用。多孔金屬材料可使單位截面積下材料本身所承載的應(yīng)力下降；同時(shí)提供良好的生物學(xué)固定，促進(jìn)骨組織長(zhǎng)入植入物孔隙，利于骨與植入物之間的應(yīng)力分布平衡[7-8]。

Xu等[9]利用粉末冶金方法制備的具有不同孔隙度的多孔鈦鈮合金試件，能夠很好地促進(jìn)BMSCs長(zhǎng)入合金試件內(nèi)部，生物相容性良好；Weng等[10]的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果亦證實(shí)，多孔鈦鈮合金試件在兔模型體內(nèi)相容性良好，具有與骨相當(dāng)?shù)膹椥阅Ａ?；亦有學(xué)者對(duì)多孔鈦鈮合金的機(jī)械性能和彈性模量進(jìn)行研究，結(jié)果提示，該試件機(jī)械性能較好，抗腐蝕性強(qiáng)，具有良好的應(yīng)用價(jià)值[11-12]。本研究所采用的多孔鈦鈮合金試件同樣使用粉末冶金法制備，其在生物學(xué)性能方面的表現(xiàn)與上述研究一致。

3.2 BMP-2與鈦鈮合金試件的復(fù)合及其體外成骨分化能力

為了保證生物型人工關(guān)節(jié)植入后獲得長(zhǎng)期穩(wěn)定，通常需要假體與骨之間的牢固結(jié)合。既往研究主要集中于對(duì)材料表面進(jìn)行改進(jìn)或涂層等，如珍珠面、鈦絲面、噴砂面、羥基磷灰石面等，能夠起到促進(jìn)骨質(zhì)長(zhǎng)入及整合、利于骨質(zhì)再生的作用[13-14]。但假體-骨界面接觸總面積有限，因此上述改良處理方法對(duì)于骨與假體結(jié)合范圍、深度和強(qiáng)度的影響也較為局限[15-16]。為進(jìn)一步提高骨長(zhǎng)入的速度及骨長(zhǎng)入量，目前常用的是將生物活性因子與材料相結(jié)合，其中包括BMP-2與多孔材料復(fù)合的方法[17-18]。

BMP-2是一種低分子量酸性多肽，存在于骨基質(zhì)中，可誘導(dǎo)血管周圍BMSCs和未分化間充質(zhì)細(xì)胞向軟骨和成骨細(xì)胞分化，同時(shí)具有高效的骨傳導(dǎo)作用[19-21]。為了明確多孔鈦鈮合金支架復(fù)合BMP后是否具備體外成骨誘導(dǎo)作用，我們觀察BMSCs在具備不同微環(huán)境材料上的貼附、分化、增殖情況。

顯微鏡及電鏡結(jié)果提示，與A、B兩組試件復(fù)合24 h、2周、4周后，BMSCs貼附增殖情況良好，說明多孔鈦鈮合金材料具有良好的細(xì)胞相容性。B組BMSCs因富含BMP，2周時(shí)即表現(xiàn)出向成骨細(xì)胞分化的趨勢(shì)，細(xì)胞形態(tài)向成骨細(xì)胞改變且數(shù)目明顯增多；4周時(shí)B組材料上有鈣結(jié)節(jié)生成。而A組2周時(shí)細(xì)胞僅表現(xiàn)為單層生長(zhǎng)，4周時(shí)玻片染色亦未發(fā)現(xiàn)有鈣結(jié)節(jié)生成。這些結(jié)果提示BMP復(fù)合多孔鈦鈮金屬試件具有誘導(dǎo)BMSCs成骨活性的作用。

ALP是成骨細(xì)胞的生化和組織學(xué)標(biāo)志，其表達(dá)水平可反映BMSCs向成骨細(xì)胞的分化特性。骨特異性ALP定位于骨源性細(xì)胞的表面，是評(píng)價(jià)機(jī)體組織分化能力和成骨活性的特異性標(biāo)志酶[22]。本實(shí)驗(yàn)中骨特異性ALP值隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸升高，B組6 d時(shí)ALP表現(xiàn)出明顯的陡升趨勢(shì)，且在6、9、12、15 d時(shí)ALP測(cè)得值均明顯高于A組，進(jìn)一步證實(shí)了BMP的成骨誘導(dǎo)作用。

骨鈣素是一種小分子蛋白質(zhì)，主要沉積在骨組織的細(xì)胞外間質(zhì)，可調(diào)節(jié)骨的礦化及轉(zhuǎn)化過程，被認(rèn)為是成骨細(xì)胞另一特征性的表型標(biāo)志，可由成骨細(xì)胞產(chǎn)生[23]。本實(shí)驗(yàn)B組上清液中骨鈣素在2、4、6、8、10、12、14 d測(cè)得值均高于A組，推測(cè)與BMP誘導(dǎo)成骨作用導(dǎo)致的鈣成分增加有關(guān)。

綜上，兔BMSCs在多孔鈦鈮合金試件中表現(xiàn)出正常的形態(tài)及良好的增殖分化能力，提示該金屬試件具有良好的細(xì)胞相容性；BMSCs在多孔鈦鈮合金中經(jīng)rhBMP-2誘導(dǎo)，可向成骨細(xì)胞分化，證實(shí)BMP對(duì)復(fù)合試件的成骨活性有重要影響。本實(shí)驗(yàn)存在一些不足，實(shí)驗(yàn)僅分兩組，未充分考慮到實(shí)驗(yàn)試件本身對(duì)細(xì)胞增殖的影響，且BMP為單一濃度，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中將進(jìn)一步加以完善。