皖貝母產(chǎn)生物堿內(nèi)生真菌的篩選與鑒定＊

許 勇，戴陳偉，董朝陽，蔡 標(biāo)

（安徽省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院微生物研究所 合肥 230061）

貝母皖貝母為百合科（Liliaceae）貝母屬（FritillariaL.）植物安徽貝母（Fritillaria anhuiensisS.C.Chen et S.P.Yin）的干燥鱗莖，1985年被認(rèn)定為國家一類新藥，自然分布于大別山區(qū)與江淮丘陵區(qū)，具有清熱、化痰、止咳鎮(zhèn)喘等功效[1-2]，可用于治療急、慢性支氣管炎等疾病[3]。研究發(fā)現(xiàn)，皖貝母的主要活性成分為異甾生物堿，如貝母素甲和貝母素乙等[4]。近年來，由于全球氣溫變暖，肺疾增多，貝母的需求量急增，導(dǎo)致野生資源采挖過度，以及農(nóng)戶種植傾向的變化，皖貝母藥用資源已經(jīng)比較匱乏[1,5]。

植物內(nèi)生菌是指那些其全部或部分生活史在健康植物的各種組織或細(xì)胞內(nèi)部度過的真菌或細(xì)菌（包括放線菌），其存在不引起明顯的宿主感染癥狀，但可通過組織學(xué)方法或從嚴(yán)格表面消毒的植物組織中分離[6]。植物內(nèi)部存在真菌的現(xiàn)象十分普遍[7]，具有促進(jìn)植物生長、合成植物激素、增加植物抗脅迫能力、提高植物光合作用和抗病抗蟲能力等作用[8]。內(nèi)生真菌長期生活在植株體內(nèi)的特殊環(huán)境中與其協(xié)同進(jìn)化，能夠產(chǎn)生與宿主植物相同或相似的次生代謝產(chǎn)物[9]，甚至新的化合物[10]。1993年，美國科學(xué)家Stierle首次從內(nèi)生真菌中分離出了和宿主相同的具有抗癌作用的活性物質(zhì)[11]。近年來，藥用植物內(nèi)生真菌產(chǎn)抗菌類活性物質(zhì)、抗腫瘤和抗氧化活性類物質(zhì)、免疫抑制活性物質(zhì)和其他活性物質(zhì)等方面的研究越來越多，成為內(nèi)生真菌研究的熱點(diǎn)領(lǐng)域[9]。從藥用植物中分離篩選出了產(chǎn)活性物質(zhì)的內(nèi)生真菌，借內(nèi)生真菌產(chǎn)生的新型化合物填充天然藥用的資源庫，成為緩解藥用資源緊張的局面的一條途徑。厲秀秀等從黃連（Coptis chinensisFranch.）中篩選出了產(chǎn)小檗堿的擬莖點(diǎn)霉屬內(nèi)生真菌（Phomopsis）[12]，侯曉強(qiáng)等從鐵皮石斛（Dendrobium officinale）分離出了8株具有促生長活性的內(nèi)生真菌[13]，畢江濤等從藥用植物車前（Plantago asiaticaL.）內(nèi)分離出11株內(nèi)生真菌對(duì)1種或多種植物病原真菌指示菌有不同程度的抑制作用[14]。

目前，尚未見有關(guān)從皖貝母中分離出產(chǎn)活性成分的內(nèi)生真菌報(bào)道，本試驗(yàn)對(duì)皖貝母內(nèi)生真菌進(jìn)行分離，并對(duì)這些內(nèi)生真菌的代謝產(chǎn)物進(jìn)行檢測，旨在從皖貝母中篩選出能夠產(chǎn)生物堿的內(nèi)生真菌，為解決皖貝母藥用資源匱乏的問題提供理論依據(jù)。

圖1 內(nèi)生真菌bm-2菌株產(chǎn)生物堿的TLC分析

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)材料

貝母采自安徽省霍山縣太平畈鄉(xiāng)農(nóng)戶家中，由安徽中醫(yī)藥大學(xué)王德群教授鑒定為安徽貝母（Fritillaria anhuiensisS.C.Chen et S.P.Yin）。

1.1.2 儀器與試劑

JK-300超聲波清洗器（金尼克）；SQ810C壓力滅菌器（YAMATO）；U3000高效液相色譜儀（（Thermo Fisher）；3300旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)光檢測器（Alltech）；MJX-160B-Z霉菌培養(yǎng)箱（博訊）；Veriti梯度PCR儀（ABI）；SW-CJ-ID 超 凈 工 作 臺(tái)（AIRTECH）；ACQUITY UPLC?BEH C18色譜柱（Waters）。貝母素甲和貝母素乙標(biāo)準(zhǔn)品購于成都普菲德生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 內(nèi)生真菌的分離與純化

取安徽貝母鱗莖部位，在無菌條件下將表面清洗干凈，晾干后用75%酒精浸泡1.5 min，無菌水沖洗1次，84消毒液浸泡5 min，無菌水沖洗1次，再用75%酒精浸泡30 s，無菌水沖洗干凈。將鱗莖切割成0.5*0.5 cm2的塊狀，截面向下置于含青霉素的馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基（Potato Dextrose Agar，PDA），最后一次沖洗液作為對(duì)照。28℃條件下培養(yǎng)，觀察期間菌落形態(tài)、顏色等特征，將形態(tài)、顏色不同的菌落轉(zhuǎn)接到新的固態(tài)培養(yǎng)基上，編號(hào)，28℃培養(yǎng)3-7天，放入4℃冰箱保存[3,15]。

1.2.2 內(nèi)生真菌發(fā)酵液及標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

將菌種于PDA培養(yǎng)基活化4天后，取直徑為6 mm的菌塊接種到PDA液體培養(yǎng)基中（100 mL 250 mL-1），置于26℃恒溫?fù)u床中130 r min-1培養(yǎng)7天。收集發(fā)酵液，60℃減壓濃縮至5 mL，加濃氨水調(diào)至pH 9-11，20 mL二氯甲烷萃取2-3次，收集油層，揮干，用0.5 mL甲醇定容，制得樣品制備液[15]。

取貝母素甲對(duì)照品和貝母素乙對(duì)照品，加三氯甲烷分別制成每1 ml各含0.2 mg和0.15 mg的混合溶液，作為對(duì)照品溶液。

1.2.3 薄層層析（Thin Layer Chromatography，TLC）檢測

吸取樣品制備液 10～20 μl、對(duì)照品溶液 10 μl，分別點(diǎn)于薄層板上，以乙酸乙酯-甲醇-濃氨試液（17∶2∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以稀碘化鉍鉀試液。

1.2.4 高效液相色譜-旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)光檢測器分析（High Performance Liquid Chromatography-Evaporative Light Scattering Detector，HPLC-ELSD）

色譜條件：色譜柱C18，100 ×2.1 mm，1.7 μm；流動(dòng)相：乙腈-水-二乙胺（70∶30∶0.03）；流速：0.2 mL·min-1。ELSD參數(shù)設(shè)置為霧化溫度65℃，蒸發(fā)管溫度70℃，氣體流速1.6 L?min-1。分別精密吸取對(duì)照品溶液10 μl、20 μl，供試品溶液5-15 μl，注入液相色譜儀，測定，用外標(biāo)兩點(diǎn)法對(duì)數(shù)方程分別計(jì)算貝母素甲、貝母素乙的含量。

1.2.5 形態(tài)學(xué)鑒定

將菌株接種于PDA培養(yǎng)基上，置于霉菌培養(yǎng)箱中，25℃培養(yǎng)15天，觀察菌落生長情況，記錄菌落的菌群特征，并于顯微鏡下觀察菌絲、分生孢子、分生孢子梗、產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)的形態(tài)特征，參照《真菌鑒定手冊》中的描述，對(duì)真菌進(jìn)行鑒定[15,16]。

1.2.6 分子生物學(xué)鑒定

以真菌通用引物ITS4，擴(kuò)增真菌的ITS序列測序委托測序公司完成。根據(jù)真菌的ITS序列，用MEGA 7構(gòu)建分子進(jìn)化樹，采用Neighbor-Joining法的Complete Deletion模式建樹，用Bootstrap進(jìn)行檢驗(yàn)，并重復(fù)1000次[17]。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)生物堿內(nèi)生真菌的篩選

從皖貝母的鱗莖中共分離得到6株內(nèi)生真菌。如圖1所示，利用TLC法對(duì)該6株內(nèi)生真菌樣品制備液進(jìn)行鑒定發(fā)現(xiàn)，菌株bm-2樣品制備液中出現(xiàn)一個(gè)斑點(diǎn)與貝母素甲的遷移率一致，Rf值為0.676。另有一處斑點(diǎn)與在貝母素乙標(biāo)準(zhǔn)品斑點(diǎn)附近，但不完全一致，Rf值為0.781。

2.2 內(nèi)生真菌bm-2產(chǎn)貝母生物堿分析

對(duì)bm-2菌株樣品制備液進(jìn)行HPLC-ELSD分析，最高峰出峰時(shí)間為3.803 min（圖2-A），貝母素甲標(biāo)準(zhǔn)溶液出峰時(shí)間為3.844 min（圖2-B），二者出峰時(shí)間非常接近，表明內(nèi)生真菌bm-2能夠產(chǎn)生與貝母素甲相同或者相似的化合物。在貝母素乙的出峰時(shí)間4.296 min附近（圖2-C），bm-2菌株粗提液并未出現(xiàn)峰值（圖2-A），這表明其中未發(fā)現(xiàn)與貝母素乙相同或相似的化合物。根據(jù)圖2-A峰面積，計(jì)算出bm-2菌株發(fā)酵液貝母素甲的產(chǎn)量為0.7353 mg?L-1。

2.3 形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果

bm-2菌株在平板上菌落形態(tài)：初期生長呈絨毛狀，白色或灰黑色。后期生長疏松，呈棉絮狀。顯微鏡觀察：分生孢子梗直接從菌絲上長出，與菌絲無明顯差異，在頂端形成分生孢子。分生孢子呈卵形，成串排列（圖3）。根據(jù)菌落形態(tài)和顯微特征，參照《真菌鑒定手冊》的特征描述，初步推斷其為極細(xì)鏈格孢菌（Alternaria tenuissima）。

2.4 分子生物學(xué)鑒定結(jié)果

如圖4所示，內(nèi)生真菌bm-2的ITS序列長度約在750 bp，其擴(kuò)增條帶清晰。經(jīng)ITS序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)bm-2的ITS序列與極細(xì)鏈格孢菌（Alternaria tenuissima）的同源度達(dá)到100%。由bm-2的ITS序列與其他相似度高且具代表性的序列，以親緣關(guān)系較近的忍冬黑痣菌（Rhytisma lonicerae）為外類群構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖5），結(jié)合形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果，將bm-2確認(rèn)為極細(xì)鏈格孢菌（Alternaria tenuissima）。

圖2 bm-2樣品制備液的HPLC分析

3 討論

為緩解貝母藥用資源的匱乏，研究者們嘗試從貝母中篩選鑒定具備藥用活性的內(nèi)生真菌。陳鵲等從甘肅貝母中分離出了一株具有抑菌活性的鐮刀菌屬接骨木鐮刀菌（Fusarium sambucinum）[15]，陳娟麗等從平貝母中篩選出了可產(chǎn)西貝母堿的頭孢霉屬真菌（Cephalosporium）[18]，潘峰等從瓦布貝母中分離出了一株能夠產(chǎn)貝母辛和貝母素乙的鐮刀屬真菌（Fusarium）[19]，但尚未發(fā)現(xiàn)從皖貝母中篩選分離活性內(nèi)生真菌的報(bào)道。

圖3 bm-2的顯微鏡鑒定

圖4 菌株bm-2的ITS-PCR擴(kuò)增電泳圖

圖5 菌株bm-2的rDNA-ITS生物分類系統(tǒng)進(jìn)化樹

本研究通過TLC法從皖貝母的鱗莖中篩選出1株真菌bm-2，其發(fā)酵液中含貝母素甲成分。rDNA-ITS序列分析與傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)鑒定相結(jié)合是目前鑒定真菌的主要手段[7，9]。rDNA-ITS序列分析結(jié)果顯示菌株bm-2與極細(xì)鏈格孢菌的同源度達(dá)到100%，同時(shí)菌株bm-2的形態(tài)學(xué)特征也與極細(xì)鏈格孢菌相吻合。綜合形態(tài)學(xué)鑒定和分子生物學(xué)鑒定結(jié)果，將菌株bm-2鑒定為極細(xì)鏈格孢菌（Alternaria tenuissima）。鏈格孢屬細(xì)菌是藥用被子植物內(nèi)生真菌的優(yōu)勢菌群[10]，彭三妹等也曾在浙貝母的鱗莖中分離出了交鏈孢霉屬（Alternaria）真菌[20]。楊宇等曾對(duì)皖貝母的內(nèi)生真菌進(jìn)行過初步探索，從皖貝母中分離出了被孢霉屬（Mortierella）和青霉屬真菌（Penicillium）[3]，與本研究并不相同，這可能是由于肉質(zhì)組織中的內(nèi)生真菌的密度和種類隨著植物生長發(fā)育環(huán)境的不同也有著很大的不同，在很大程度上表現(xiàn)出環(huán)境依賴性[7]。

和甘肅貝母、平貝母和瓦布貝母[17]中篩選分離出的產(chǎn)生物堿的內(nèi)生真菌相同，本研究中篩選獲得的極細(xì)鏈格孢發(fā)酵液中僅含產(chǎn)量很低的貝母素甲（0.7353 mg·L-1），不含貝母素乙，這種產(chǎn)量水平無法直接進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)。高楊等以產(chǎn)小檗堿的內(nèi)生真菌S6為出發(fā)菌株，采用多種單一或復(fù)合誘變措施對(duì)其菌絲體進(jìn)行誘變處理，最終篩選得到高產(chǎn)菌株s-nu-302，其小檗堿產(chǎn)量比出發(fā)菌株提高170%，達(dá)到12.28 mg?L-1[21]。殷紅等對(duì)s-nu-302的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，使該菌株的小檗堿得率提高了47.2%，菌體生物量提高了24%[22]。殷紅等還對(duì)平貝母鱗莖中內(nèi)生真菌菌株fu7的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，將菌絲干重和西貝素含量分別比在基本培養(yǎng)基中提高了約155%和77%[23]。除了人工誘變和優(yōu)化發(fā)酵條件以外，通過基因工程手段改造菌株也是提高活性物質(zhì)產(chǎn)量的可行途徑。

同時(shí)，內(nèi)生真菌離開植物體后，通過反復(fù)的繼代培養(yǎng)，合成次生代謝產(chǎn)物的能力會(huì)下降，這種退化現(xiàn)象普遍存在，也是限制其活性物質(zhì)產(chǎn)量穩(wěn)定的重要因素[8,24]。kusari等、li等都報(bào)道了內(nèi)生真菌的退化現(xiàn)象，這可能是由于在沒有宿州植物特定刺激的情況下，產(chǎn)物基因無法正常表達(dá)[25,26]。崔欣等在1株具有產(chǎn)西貝堿能力的平貝母內(nèi)生真菌的培養(yǎng)基中加入3%平貝母藥材，發(fā)現(xiàn)其發(fā)酵液中西貝堿產(chǎn)量可達(dá)到0.0563 mg?L-1，比出發(fā)菌株提高了21.9%，且具有良好的遺傳穩(wěn)定性[27]。然而kusari等通過將內(nèi)生真菌接種回宿主植物的方法，雖然恢復(fù)了菌株形態(tài)，但次生代謝產(chǎn)物量并未恢復(fù)[28]。因此，不同的內(nèi)生真菌或宿主植物其退化機(jī)理也不盡相同，探索有效的復(fù)壯手段前提是了解真菌合成宿主植物次生代謝產(chǎn)物的分子機(jī)制[8]。

由于植物源和微生物源的酶類的聯(lián)合作用，微生物的基因表達(dá)在植物體內(nèi)受植物生理環(huán)境的影響等原因，內(nèi)生真菌不僅能夠促進(jìn)宿主植物合成活性成分，還可自身合成新的藥物活性物質(zhì)[7,9]。這些化合物一般對(duì)病原物有抑制作用，在植物對(duì)病原物的能動(dòng)抗性中起到十分重要的作用[7]。kharwar等發(fā)現(xiàn)印度楝的一株內(nèi)生真菌可以產(chǎn)生能夠顯著抑制人類及植物病原菌的活性物質(zhì)——爪哇鐮菌素[29]。新化合物的合成往往需要微生物與宿主植物相互作用才能完成，微生物單獨(dú)或者植物單獨(dú)通常都不能合成[7]。因此，檢測鑒定皖貝母內(nèi)生真菌所產(chǎn)生的新型化合物及其藥理活性，也是進(jìn)一步深入研究的方向。如今，根據(jù)內(nèi)生真菌能產(chǎn)生與宿主相同或相似次生代謝產(chǎn)物的理論，人們還能將一些珍貴藥用植物的內(nèi)生真菌進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，提取生物活性次生代謝物，生產(chǎn)新型的大眾化保健飲料[9]。