潼白蒺藜藥對(duì)調(diào)節(jié)高脂血癥模型大鼠血脂作用及機(jī)制研究＊

楊愛玲，樊 華，王佑華＊＊，彭瓏萍，周 莉，湯 諾，鄧 兵，周 端

（1.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院心內(nèi)科 上海 200032；2.上海市徐匯區(qū)中心醫(yī)院中醫(yī)科 上海 200031）

高脂血癥在心腦血管疾病和發(fā)展過程中起著重要作用，人群血脂水平的大幅度提升是我國(guó)冠心病發(fā)病率和死亡率增加的最主要致病性因素[1,2]。調(diào)節(jié)血脂代謝紊亂，降低血脂水平可明顯降低冠狀動(dòng)脈硬化性心臟病和中風(fēng)的發(fā)生率[3,4]；有效地控制高脂血癥是預(yù)防心腦血管疾病的關(guān)鍵。從中醫(yī)藥中尋找更多安全、有效的調(diào)脂藥物是醫(yī)藥學(xué)界關(guān)注的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。

藥對(duì)又稱對(duì)藥，是臨床中藥配伍中相對(duì)固定的兩味藥物的搭配形式。藥對(duì)體現(xiàn)了中醫(yī)遣方用藥的特色優(yōu)勢(shì)，具有內(nèi)在的組合變化規(guī)律，發(fā)揮著協(xié)同增效或配伍減毒等作用[5,6]。潼蒺藜、白蒺藜藥對(duì)是臨床常用藥對(duì)，名醫(yī)施今墨先生即善用潼白蒺藜藥對(duì)治療心血管在內(nèi)的諸多疾病[7]。白蒺藜以升為主，潼蒺藜以降為要。二藥伍用，一升一降，肝腎同治，平肝滋腎之功益彰，兼以祛瘀瀉濕，適用于高脂血癥的治療。我們以潼白蒺藜藥對(duì)制成潼白顆粒，臨床收到較好效果。本研究采用高脂血癥大鼠模型，觀察潼白顆粒對(duì)高脂血癥大鼠血脂水平調(diào)節(jié)的作用及機(jī)制，報(bào)道如下。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康雄性SD大鼠48只，SPF級(jí)，6-8周齡，體質(zhì)量180±20 g，購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)：SCXK（京）2015-0001。飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，飼養(yǎng)環(huán)境溫度在24±2℃之間，濕度為40%±5%，定期更換墊料，自由采食、飲水，每天給予光照與黑夜時(shí)間各12 h。

1.2 藥物及試劑

潼蒺藜及白蒺藜藥材藥材飲片及購(gòu)自上海華濟(jì)藥業(yè)有限公司，批號(hào)：16113004，藥物經(jīng)我院藥劑科制備成水提物顆粒，4℃冷藏備用。辛伐他汀片購(gòu)于杭州默沙東制藥有限公司；甘油三酯（TG）試劑盒、膽固醇（TC）試劑盒、高密度脂蛋白（HDL-C）試劑盒及低密度脂蛋白（LDL-C）試劑盒購(gòu)于南京建成生物有限公司；Real time PCR（RT-PCR）試劑盒及Trizol購(gòu)于TaKaRa公司；全部引物由上海生物工程股份有限公司合成；BCA蛋白定量測(cè)定試劑盒、SDS-PAGE凝膠配置試劑盒購(gòu)自碧云天公司；二抗辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG，一抗兔抗鼠HMGCR、CYP7A1、LDL-R均購(gòu)自美國(guó)Abcam有限公司。

1.3 儀器

Olympus AU27oo全自動(dòng)生化分析儀（日本）；L720R-3低溫離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司）；電子分析天平（沈陽龍騰電子稱量?jī)x器廠），Rt2100c酶標(biāo)檢測(cè)儀（中國(guó)Rayto公司），QuantStudio Real-Time PCR儀（美國(guó)ABI公司），ChemiDoc MP成像儀（Biorad）。

1.4 飼料

正常大鼠飼料組成：蛋白質(zhì)（14%），脂肪（10%）和碳水化合物（76%）。高脂飼料組成：標(biāo)準(zhǔn)的大鼠飼料輔以膽酸（1%），膽固醇（3%）和花生油（5.5%），購(gòu)于上海中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。

2 方法

2.1 動(dòng)物分組及喂養(yǎng)

適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，將大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組，模型組，辛伐他汀組、白蒺藜組、潼蒺藜組及潼白蒺藜組，每組各8只。參照文獻(xiàn)[8]制備高脂血癥大鼠模型，正常對(duì)照組飼喂基礎(chǔ)飼料，其余各組大鼠均用高脂飼料喂養(yǎng)，周期共6周。

表1 各基因引物序列

2.2 給藥劑量及方法

在造模的同時(shí)給予預(yù)防性灌胃給藥，按等效臨床劑量及體表面積公式計(jì)算，辛伐他汀組給予辛伐他汀7.5 mg·kg-1·d-1，白蒺藜組給予白蒺藜水提物600 mg·kg-1·d-1，潼蒺藜組給予潼蒺藜水提物600 mg·kg-1·d-1，潼白蒺藜組給予潼白蒺藜藥對(duì)水提物（潼蒺藜：白蒺藜=1∶1）600 mg·kg-1·d-1，正常對(duì)照組及模型組灌以等劑量的蒸餾水，給藥容積為10 mL·kg-1·d-1，每天1次，共持續(xù)6周。

2.3 血液及組織樣本采集

于給藥第6周末，各組大鼠均禁食12 h，不禁水，于次日上午稱體質(zhì)量后用乙醚全麻，腹主動(dòng)脈取血，收集血漿2 mL，靜置30 min，于低溫離心機(jī)4℃，3000 r·min-1，離心5 min，分離血清，-20℃冰箱保存待測(cè)。解剖大鼠，快速取出肝、腎、心等臟器組織，稱取質(zhì)量，計(jì)算臟器指數(shù)[臟器指數(shù)（%）=臟器質(zhì)量（mg）/體質(zhì)量（g）×100%]；將肝組織部分迅速置于非凍型組織RNA保存液中，部分保存于-20℃冰箱中，待測(cè)。

2.4 血脂測(cè)定

在全自動(dòng)生化分析儀上，用酶法測(cè)定TC、TG含量。免疫比濁法測(cè)定LDL-C、HDL-C含量。

2.5 肝組織中HMGCR、CYP7A1、LDL-R mRNA表達(dá)水平的測(cè)定

Trizol處理各組肝臟組織，提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，設(shè)定PCR反應(yīng)條件，用SYBER Green試劑盒，以18sRNA為內(nèi)參，應(yīng)用RT-PCR法檢測(cè)待測(cè)基因的mRNA水平，循環(huán)條件為：95℃ 2 min，95℃ 15 s，60℃20 s，72℃30 s（40個(gè)循環(huán)）。各基因引物序列如表1。

2.6 肝組織中HMGCR、CYP7A1、LDLR蛋白表達(dá)水平的測(cè)定

蛋白裂解液提取各組肝臟組織蛋白，利用BCA（Bicinchoninic acid）法對(duì)蛋白進(jìn)行定量。以30 μg蛋白/泳道上樣，經(jīng)SDS-PAGE電泳后，用濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)印置于甲醇活化后的PVDF膜上，blocking buffer室溫封閉30 min后，進(jìn)行一抗（濃度為1∶1000）4℃孵育過夜（≥12 h），并與β-actin作為內(nèi)參抗體。孵育完畢后，磷酸鹽緩沖液（Phosphate Buffered Saline，PBST）漂洗10 min×4次后進(jìn)行HRP偶聯(lián)的二抗（濃度為1 3000）室溫孵育1 h，PBST漂洗5 min× 3次后在Biorad ChemiDoc MP顯影儀中用ECL發(fā)光液進(jìn)行化學(xué)發(fā)光顯影。

表2 各組體重及臟器指數(shù)比較

表3 各組血脂比較

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

RT-PCR結(jié)果采用相對(duì)定量-△△Ct法分析。蛋白灰度值采用Biorad公司Image Lab?軟件進(jìn)行定量分析，所有實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用SPSS21.0軟件進(jìn)行檢驗(yàn)，用x±s表示，其中多組間均數(shù)比較采用單因素方差（one-way ANOVA）分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

4.1 各組體重及臟器指數(shù)比較

如表2所示，造模四周后各組大鼠體重、腎指數(shù)及心指數(shù)沒有明顯變化（P均＞0.05），與正常組相比，模型組肝指數(shù)顯著增加，與模型組比較，辛伐他汀組、潼蒺藜組、白蒺藜組及潼白蒺藜組肝指數(shù)有顯著降低（P＜0.05或P＜0.01），各藥物之間肝指數(shù)沒有明顯變化。

4.2 各組血脂比較

如表3所示，與正常對(duì)照組相比，模型組血清CHOL，TG，LDL-C均明顯升高，而血清HDL-C明顯降低（P均＜0.01），說明高脂血癥大鼠模型成功建立。與模型組相比：辛伐他汀組TG、TC及LDL-C明顯下降（P＜0.05或P＜0.01）。HDL-C沒有明顯變化。白蒺藜組TG、TC及LDL-C明顯下降（P＜0.05或P＜0.01）。HDL-C沒有明顯變化。潼蒺藜組TG、TC及LDL-C明顯下降（P＜0.01），HDL-C明顯上升（P＜0.05），潼白蒺藜藥對(duì)組TG、TC及LDL-C明顯下降（P＜0.01），HDL-C明顯上升（P＜0.01），其中以潼白蒺藜藥對(duì)組降脂作用更加明顯。

4.3 各組肝組織中HMGCR、CYP7A1、LDLR mRNA相對(duì)表達(dá)水平比較

如表4所示，與正常對(duì)照組比較，模型組HMGCR、CYP7A1、LDLR mRNA表達(dá)水平明顯下降（P＜0.01）。而與模型組相比，辛伐他汀組、白蒺藜組、潼蒺藜組、潼白蒺藜組HMGCR、CYP7A1、LDLR mRNA表達(dá)水平均明顯上升（P＜0.01）。其中潼白蒺藜組CYP7A1、LDLR mRNA表達(dá)變化更為明顯。

4.4 各組肝組織中HMGCR、CYP7A1、LDLR蛋白表達(dá)水平比較

如圖1所示，與正常組比較，模型組HMGCR、CYP7A1、LDLR蛋白表達(dá)水平明顯下降（P＜0.01）。與模型組相比，辛伐他汀組、白蒺藜組、潼蒺藜組、潼白蒺藜組HMGCR、CYP7A1、LDLR表達(dá)水平均明顯上升（P＜0.05或P＜0.01）。其中潼白蒺藜組CYP7A1、LDLR表達(dá)變化更為明顯。

5 討論

中醫(yī)學(xué)多把高脂血癥歸屬于痰濁、血瘀、胸痹、眩暈、肥胖、污血、中風(fēng)等范疇，認(rèn)為與肝脾腎等臟相關(guān)。肝失條達(dá)，肝脾失調(diào)，氣血失和，脾胃運(yùn)化受納和升清降濁失常，致膏脂轉(zhuǎn)運(yùn)輸布不利，久則脂濁滯留于營(yíng)血，停于血脈，形成高梁之疾。此外，腎為先天之本，主津液。腎精虧耗則水不涵木，肝木失其疏泄，則脂質(zhì)代謝失調(diào)，發(fā)展為高脂血癥。刺蒺藜功在疏肝解郁、祛風(fēng)明目、散結(jié)祛瘀，潼蒺藜則著重于補(bǔ)益肝腎、明目固精，二者為臨床常用藥對(duì)，二藥一升一降，肝腎同治，升降調(diào)和，理氣散瘀，平補(bǔ)肝腎之功增強(qiáng)。清代名醫(yī)施今墨常以刺蒺藜與潼蒺藜藥對(duì)共伍，治療包括高脂血癥在內(nèi)的諸多心血管病證肝腎不足者，二藥合參，一散一補(bǔ)，一平肝陽以治上，一補(bǔ)腎陰以治下，腎氣得充，肝得疏泄，氣血通暢，發(fā)揮治療作用。

圖1 各組HMGCR、CYP7A1、LDLR mRNA相對(duì)表達(dá)水平比較

圖2 各組肝組織中HMGCR、CYP7A1、LDL-R蛋白表達(dá)水平比較

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)表明，高脂血癥是指血清中脂質(zhì)成分過剩的狀態(tài)，是由于脂肪代謝或運(yùn)轉(zhuǎn)異常所導(dǎo)致。血清總膽固醇TC、甘油三酯TG、低密度脂蛋白膽固醇LDL-C、高密度脂蛋白膽固醇HDL-C是反映機(jī)體脂質(zhì)代謝的主要指標(biāo)[9,10]。而肝臟是體內(nèi)脂質(zhì)代謝的重要器官，研究發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)期飼喂高膽固醇飲食后，會(huì)引起肝腫大[11]。另外，TC合成、吸收、代謝在高脂血癥發(fā)生發(fā)展中具有重要作用。一方面，在合成過程中，TC受其限速酶HMG的調(diào)節(jié)[12]，而HMGCR的濃度亦受TC的反饋調(diào)節(jié)，TC濃度升高會(huì)導(dǎo)致HMGCR蛋白水平降低，進(jìn)而使TC的生物合成減少，達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡。故通過調(diào)節(jié)HMGCR蛋白水平可以起到減少TC生成的作用。另一方面，在TC的代謝過程中，合成膽汁酸是TC代謝的一個(gè)重要途徑，而CYP7A1是膽汁酸合成的限速酶[13]，它的表達(dá)量和活性對(duì)膽汁酸的合成起關(guān)鍵作用。當(dāng)發(fā)生高脂血癥時(shí)，CYP7A1活性表達(dá)下降，使TC代謝受阻，此時(shí)TC不能轉(zhuǎn)變?yōu)槟懼?，沉積體內(nèi)，導(dǎo)致TC增高；同時(shí)，LDL-R是另一條維持機(jī)體血漿LDL-C水平及血脂代謝的重要途徑，血漿中90%的膽固醇通過LDL-R途徑清除[14]。LDL-R是細(xì)胞表面的一種糖蛋白，主要在肝臟中合成，當(dāng)LDL-R的數(shù)量、結(jié)構(gòu)及功能異常時(shí)，會(huì)導(dǎo)致TC含量升高，并在組織內(nèi)沉積，進(jìn)而導(dǎo)致各種心血管疾病的發(fā)生[15]。而高TC反過來影響肝細(xì)胞表面LDL-R受體,使其活性減弱，肝細(xì)胞攝取、轉(zhuǎn)化及排泄LDL-C減少，進(jìn)一步引起血中TC和TG升高[16]。

以往研究報(bào)道潼蒺藜、白蒺藜具有降脂作用[17-19]，但其機(jī)制尚未明確，潼白蒺藜作為藥對(duì)使用對(duì)高脂血癥的作用機(jī)制亦鮮有報(bào)道。本研究結(jié)果顯示，高脂飼料喂養(yǎng)后大鼠血清TG、TC、LDL-C明顯增加，HDL-C明顯降低，大鼠肝指數(shù)顯著升高，表明高脂模型建立成功。潼蒺藜、白蒺藜及潼白蒺藜藥對(duì)干預(yù)后，明顯降低大鼠血清TG、TC、LDL-C及肝指數(shù)，明顯升高HDL-C，提示潼蒺藜和白蒺藜具有降低血脂，保護(hù)肝臟的作用，與既往研究一致。且與單用潼蒺藜或白蒺藜相比，潼白蒺藜藥對(duì)組降低TC與LDL-C的效果更加顯著。提示應(yīng)用潼白蒺藜藥對(duì)治療高脂血癥，或有協(xié)同增效的作用。同時(shí)，PCR及Western blot結(jié)果顯示白蒺藜組、潼蒺藜組及潼白蒺藜藥對(duì)組可明顯提高HMGCR、CYP7A1、LDL-R mRNA及蛋白表達(dá)水平，且與單用潼蒺藜，白蒺藜相比，潼白蒺藜藥對(duì)升高CYP7A1、LDLR蛋白水平的效果更加顯著。提示潼白蒺藜藥對(duì)可能通過調(diào)節(jié)HMGCR表達(dá)進(jìn)而減少TC生成，同時(shí)促進(jìn)CYP7A1、LDL-R的表達(dá)，既促進(jìn)TC轉(zhuǎn)化為膽汁酸，又增加TC的逆轉(zhuǎn)運(yùn)，從而降低血清TC水平起到降脂的作用。

綜上所述，潼白蒺藜藥對(duì)可通過調(diào)節(jié)HMGCR的表達(dá)來減少TC的生成，并通過提高CYP7A1、LDLR活性及表達(dá)來促進(jìn)TC的代謝，進(jìn)而降低血漿血漿TC含量，對(duì)高脂血癥具有一定的治療作用并且發(fā)揮協(xié)同作用。本研究為臨床應(yīng)用潼白蒺藜藥對(duì)治療高脂血癥提供了重要的參考意義，其具體的作用機(jī)制及潼白蒺藜配伍應(yīng)用的獨(dú)特療效仍需進(jìn)一步研究。