曲美他嗪干預氣虛血瘀證心衰大鼠心肌線粒體蛋白質組學研究＊

李琪琳，胡元會，霍艷明，劉瑞華，吳華芹，王 歡

（1.中國中醫(yī)科學院望京醫(yī)院 北京 100102；2.中國中醫(yī)科學院廣安門醫(yī)院 北京 100053）

心力衰竭是一組常見的臨床綜合征，是大多數心血管疾病發(fā)展的最終歸宿。隨著現代人口老齡化進程的加快和高血壓、冠心病等發(fā)病人數增多，心力衰竭發(fā)病率和病死率逐年上升，已成為人類健康的重大挑戰(zhàn)之一[1]。近年來，代謝療法在心衰治療中越來越受重視。作為一種新型改善心肌能量代謝的藥物，曲美他嗪可以抑制心肌脂肪酸氧化，增加葡萄糖氧化，穩(wěn)定缺血心肌線粒體功能，改善心肌能量供給，增強心肌收縮功能，從而達到對受損心肌的保護作用[2]。線粒體蛋白質組學是研究線粒體在生理、病理過程中的功能變化及其與疾病發(fā)生發(fā)展關系和機制的重要方法，目前已越來越受到醫(yī)學界的重視和廣泛關注。本實驗采用雙向凝膠電泳和基質輔助激光解吸離子質譜技術，以心肌線粒體為切入點，研究曲美他嗪對氣虛血瘀證心衰大鼠心肌線粒體蛋白質組學的影響，探討其可能的作用機制，以期為尋找治療心衰的新靶點提供思路。

1 材料與儀器

1.1 實驗動物

正常雄性SD大鼠30只（體質量200±20 g），購自北京維通利華實驗動物有限公司（許可證號：SCXK(京)2012-0001），飼養(yǎng)于中國中醫(yī)科學院廣安門醫(yī)院SPF級動物房。

1.2 主要儀器

HP5500彩色多普勒超聲顯像儀（PHILIPS，USA）；HX-300S動物呼吸機（成都泰盟科技有限公司，中國）；MultiphorⅡ多功能電泳系統(tǒng)(Amersham，USA）；ProteanⅡXi cell垂直電泳槽（Bio-Rad，USA）；PowerLook 2100XL膠圖掃描儀（UMAX，USA）；4700 MALDI-TOF/TOF質譜儀（AB SCIEX，USA）；Imagemaster2D凝膠分析軟件（Amersham Biosciense,USA）；Gel Doc XR+凝膠成像分析系統(tǒng)（Bio-Rad，USA）。

表1 等點聚焦程序設置

1.3 主要試劑

固相PH梯度干膠條（IPG strip pH3-10L 18 cm）、IPG緩沖液（pH3-10）購自美國Bio-Rad公司；溴酚藍、乙二胺四乙酸（EDTA）購自美國Sigma公司；十二烷基硫酸鈉（SDS）、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、瓊脂糖購自美國Promega公司；考馬斯亮藍、標準蛋白標志物購自美國Amersham pharmacia公司；胰蛋白酶（Trypsin）、甘氨酸（USB）購自美國Fisher公司；轉印膜（PVDF膜）購于美國Millipore公司；無水醋酸鈉、無水碳酸鈉、戊二醛、乙醇等為國產分析純。

1.4 藥物

曲美他嗪（中國遠大醫(yī)藥有限公司，批號：12070404）。

1.5 抗體

一抗：Anti-GRP75 antibody、Anti-ATP5A antibody、Anti-Nucleophosmin antibody購自美國Abcam公司；二抗：羊抗兔、羊抗小鼠購自北京中杉金橋公司。

2 方法

2.1 動物模型

參照Pfeffer[3]報導的方法，結扎冠脈左前降支，制備心梗后心衰大鼠模型，術后連續(xù)3天注射20萬單位青霉素抗感染。假手術組制備：僅在冠脈前降支起始點下約2-3 mm穿線而末結扎，余步驟與動物模型制備方法相同。

2.2 氣虛血瘀證評價標準

從術后第2天開始，每天觀察各組動物活動量、毛色、精神狀況、唇舌、爪甲和飼料消耗等情況，每兩周測定心率及呼吸頻率變化。參照《慢性心力衰竭中醫(yī)診療專家共識》[4]有關心衰氣虛血瘀證診斷標準（主癥：氣短、喘息、乏力、心悸。次癥：倦怠懶言，活動易勞累，自汗，語聲低微，面色、口唇紫暗。舌脈：舌質紫暗(或有瘀斑、瘀點或舌下脈絡迂曲青紫)，舌體不胖不瘦，苔白，脈沉、細或虛無力。具備主癥2項，次癥2項，結合舌脈，即可診斷），結合本實驗研究，模型大鼠心率加快相對應地反映心悸癥狀，呼吸急促反映氣短、喘息等癥狀，活動減少、精神萎靡、毛發(fā)枯黃和抓起反抗減輕等一般狀況反映神疲乏力、少氣懶言等癥狀，口唇、舌質及爪甲紫暗反應血瘀證表現。

2.3 實驗分組及給藥

分組：隨機分為假手術組與造模組，假手術組8只，造模組22只。造模組按模型制備方法造模，術后第2周對模型大鼠行心臟超聲檢測，以EF減損＞15%為模型組入選標準。將入選模型大鼠隨機分為模型組、曲美他嗪組，每組大鼠不少于6只。給藥：①假手術組：生理鹽水4.0 mL·kg-1灌胃；②模型組：同假手術組；③曲美他嗪組：10 mg·kg-1溶于生理鹽水中灌胃。連續(xù)灌胃給藥8周，每天1次。

2.4 心肌線粒體分離

采用差數離心法提取心肌線粒體。造模后第8周末，麻醉大鼠后開胸取出心臟，PBS緩沖液洗凈，稱取100 mg心肌，加入1.5 mL勻漿介質，冰浴勻漿。4℃1300 r?min-1離心15 min，保留上清，重復該步驟2次；取上清液于另一離心管中，4℃17000 r?min-1離心15 min，棄上清，沉淀用0.2 mL勻漿介質懸浮，重復該步驟2次，棄上清，所得沉淀即為線粒體。

2.5 線粒體蛋白提取

于心肌線粒體樣品中加入1 mL裂解液，渦旋振蕩破碎，冰浴中靜置4 min，4℃ 40000 r?min-1離心1 h，棄沉淀，上清液即為線粒體蛋白。采用Bradford法測蛋白含量，-80℃保存。

2.6 雙向凝膠電泳

取蛋白樣品0.8 mg，加泡脹緩沖液稀釋至350μl，充分混勻；于泡脹盤中加入上述樣品混合液，將膠條放入泡脹盤，水化12 h。水化完畢后，將膠條于等點聚焦儀內聚焦電泳，溫度為20℃，程序設置如表1。聚焦結束，將膠條取出，在平衡液I中平衡15 min，然后換平衡液II中平衡15 min。將平衡后的膠條放到SDS-PAGE凝膠上端，用0.5%的瓊脂糖封嚴，并將膠板固定于電泳槽內。加入電泳緩沖液，接通電源，至溴酚藍前沿距離凝膠底0.5 cm時停止電泳。每次同時運行3個蛋白樣品，每個蛋白樣品重復電泳3次。電泳結束后，行考馬斯亮藍染色。

圖1 雙向凝膠電泳圖

2.7 圖像掃描與分析

凝膠通過UMAX PowerLook 2100XL掃描儀透射掃描獲取圖像。掃描后采用Imagemaster2D Platinum 5.0軟件對膠圖進行蛋白點的檢測、背景扣除、標準化及人工校對處理，尋找差異蛋白質點。

2.8 差異蛋白質點的膠內酶解

將差異蛋白點切下，用NH4HCO3溶液脫色30 min，重復2-3次，脫色后離心干燥20 min，再加入6 ml胰蛋白酶液，4℃放置30 min，后加入20 ml胰酶覆蓋液，置于37℃水浴箱酶解20 h。在膠塊內加入15 ul 5%TFA，37℃溫育30 min，吸取上清，然后加入15 ul 5%TFA/50%ACN，37℃溫育30 min，吸取上清與上一次吸取液合并，再加入15 ul 100%ACN，室溫靜置5 min，吸取上清與上兩次吸取液合并，離心干燥。用3 ul含0.5%TFA溶液溶解肽段，即可用于質譜分析。

2.9 質譜分析及數據庫檢索

采用AB 4700型MALDI-TOF/TOF質譜儀進行質譜檢測。用l mL標準品與基質混合肽作為外標進行校正，獲得相應的肽質量指紋圖。根據質荷比（M/Z）用Mascot軟件在線檢索SwissProt數據庫(http：//www.matrixscience.com）以確定結果。

2.10 Western blot驗證

采用差數離心法提取大鼠心肌線粒體蛋白。取蛋白樣品50 μg，加入等體積樣品緩沖液，混勻，100℃變性5 min；12%SDS-PAGE電泳，結束后半干轉至PVDF膜。搖床上封閉2h；雜交一抗，4℃過夜，洗膜，雜交二抗，室溫搖床上2 h，洗膜。用ECL發(fā)光劑浸膜5 min，取出后置曝光匣中曝光。掃描曝光片后，應用Gel Doc凝膠成像系統(tǒng)分析底片的目的條帶。

2.11 統(tǒng)計分析

各計量數據以均數±標準差（x±s）表示。模型組與假手術組、曲美他嗪組與模型組灰度值相比大于2或小于0.5的蛋白點定義為差異蛋白點（大于2為表達上調，小于0.5為表達下調）。PMF圖譜分析以Mascot Score得分＞55為鑒定成功蛋白。

3 結果

3.1 雙向凝膠電泳結果

各組雙向凝膠電泳圖譜如圖1所示。圖像經Imagemaster軟件分析，假手術組可分辨蛋白點為698±35，模型組為712±42，曲美他嗪組為703±23，電泳各組重復3次，每組分別將其中的一塊分辨率高、質量好的凝膠定為參考膠，進行組內3塊膠間的蛋白質點匹配。

3.2 差異蛋白點質譜鑒定結果

模型組與假手術組相比有差異而曲美他嗪可使差異趨勢逆轉的蛋白點為18個，對這18個蛋白點進行MALDI-TOF-MS分析，獲得18張PMF圖譜（圖2為459號點PMF圖），PMF圖譜經SwissProt數據庫檢索,成功鑒定出10個蛋白（表2）。其中曲美他嗪組上調的蛋白為鳥氨酸轉氨酶（Ornithine aminotransferase）、過氧化氫酶（Catalase）、ATP合成酶α亞基（ATP synthase subunit alpha）、α-烯醇酶（Alpha-enolase）、3-磷酸甘油脫氫酶（Glycerol-3-phosphate dehydrogenase）、丙酮酸激酶同工酶M1/M2（Pyruvate kinase isozymes M1/M2），下調的蛋白為線粒體應激蛋白70（Stress-70 protein）、角蛋白18（Keratin，type I cytoskeletal 18）、核內不均一核糖核蛋白 A2/B1（Heterogeneous nuclear ribonucleoproteins A2/B1）、核仁磷酸蛋白（Nucleophosmin）。根據功能分類，這10個蛋白主要與能量代謝、應激反應、氧化損傷、細胞骨架、細胞分化增殖等功能相關。

圖2 459號點PMF圖

表2 10個鑒定成功蛋白

圖3 Western blot驗證結果

3.3 部分差異蛋白回復性驗證結果

與假手術組比較，模型組Stress-70、Nucleophosmin表達明顯升高，ATP-α表達明顯降低；與模型組比較，曲美他嗪組Stress-70、Nucleophosmin表達明顯降低，ATP-α表達明顯升高（圖3）。

4 討論

通過結扎大鼠冠狀動脈左前降支造成心梗后心衰是復制氣虛血瘀證心力衰竭動物模型的方法之一。中醫(yī)學認為，氣虛血瘀既是心衰基本病機，又是發(fā)病的關鍵環(huán)節(jié)，并貫穿于心衰發(fā)生發(fā)展的始終。從本實驗結果看，模型組大鼠心率加快相對應地反映心悸癥狀，呼吸急促反映氣短、喘息等癥狀，活動減少、精神萎靡、毛發(fā)枯黃和抓起反抗減輕等一般狀況反映神疲乏力、少氣懶言等癥狀，口唇、舌質及爪甲紫暗反應血瘀證表現。因此，該心衰模型較好地反映了氣虛血瘀的相關證候特點，能夠作為氣虛血瘀證心衰動物模型進行研究。我們觀察到，經曲美他嗪干預治療后，模型大鼠心率減慢，呼吸急促、活動減少情況及精神狀態(tài)明顯改善，進食量增加，口唇、舌質及爪甲紫暗情況明顯減輕，但未對干預后氣虛血瘀證改善情況進行科學的統(tǒng)計分析，這是本實驗不足和尚待完善之處。

能量代謝在心衰的發(fā)病機制中起著重要作用。作為能量代謝的重要場所，線粒體與心衰的發(fā)生發(fā)展關系密切。研究發(fā)現，無論心衰的基礎原因是血流動力學異常、神經體液過度激活、功能性心肌喪失還是瓣膜異常等，均伴有線粒體結構和功能的改變[5-7]。近年來，通過調節(jié)底物進行代謝干預的方法在心衰的治療中已開始廣泛應用。藥理研究表明，曲美他嗪對心肌的代謝性保護作用主要是通過以下途徑實現：抑制脂肪酸β氧化，增加葡萄糖氧化，改善糖酵解與糖氧化耦聯(lián)，維持ATP的產生和缺血心肌細胞能量代謝及收縮功能；降低細胞內Na+、Ca2+超載，減輕細胞內酸中毒；減少氧自由基的生成；促進游離脂肪酸參與細胞膜的構建，影響心肌細胞的動作電位以及類似于局麻藥的作用[8-9]。目前，有關曲美他嗪對心肌線粒體蛋白質組學影響基礎及臨床研究尚未有報道，本實驗采用雙向凝膠電泳和基質輔助激光解吸離子質譜技術，首次研究曲美他嗪對氣虛血瘀證心衰大鼠心肌線粒體蛋白質組學的影響，探討其可能的作用機制。

實驗結果表明，模型組與假手術組相比有差異而曲美他嗪可使差異趨勢逆轉的蛋白點共有18個，經質譜分析成功鑒定出10個蛋白，其中5個與能量代謝相關，1個與應激反應相關，1個與氧化損傷相關，1個與細胞骨架相關，2個與細胞分裂增殖相關。

4.1 與能量代謝相關蛋白

心力衰竭時，心肌能量代謝模式發(fā)生改變，表現為脂肪酸有氧氧化降低，葡萄糖無氧酵解增強，ATP生成明顯下降[10-11]。本實驗結果表明，與假手術組比較，參與氧化磷酸化的關鍵酶ATP-α在模型組表達下調，經曲美他嗪治療后ATP-α表達上調，說明曲美他嗪可保護受損心肌氧化磷酸化。同時，我們也發(fā)現參與糖酵解的關鍵酶3-磷酸甘油脫氫酶、丙酮酸激酶同工酶M1/M2、α-烯醇酶在曲美他嗪組表達均上調，考慮其原因可能與曲美他嗪抑制脂肪酸氧化、增加葡萄糖氧化、改善糖酵解與糖氧化偶聯(lián)有關。

此外，本實驗還發(fā)現曲美他嗪組鳥氨酸轉氨酶表達上調，說明其可調節(jié)模型動物出現的氨基酸代謝失衡。

4.2 與應激反應相關蛋白

結扎冠脈致心梗后心衰，可誘導心肌細胞發(fā)生內質網應激(ERS)，同時RAAS和SNS被激活。應激蛋白70家族又名熱休克蛋白70家族（HSP70），在防止應激引起的細胞損害和修復受損細胞中發(fā)揮著重要作用。研究發(fā)現，在心衰犬心肌中，HSP70升高[12]。更有研究提示，HSP70血漿濃度越高，心力衰竭越嚴重[13]。本實驗結果發(fā)現模型組應激蛋白70較假手術組表達上調，曲美他嗪治療后表達下調，說明曲美他嗪可能參與了減輕ERS反應水平、阻斷RAAS系統(tǒng)、抑制SNS活性，從而起到了保護受損心肌的作用。

4.3 與氧化損傷相關蛋白

研究發(fā)現，心力衰竭動物模型中氧自由基明顯增加，當氧自由基生成過多或抗氧自由基物質活性降低，引起氧自由基堆積，可導致氧化損傷[14]。體內自由基的清除依靠過氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GPX)等抗氧化酶系統(tǒng)，測定它們的活性可反映心肌內抗氧化能力。本實驗中，與假手術組比較，模型組CAT表達下調，曲美他嗪組表達上調，表明曲美他嗪可減輕模型動物氧化損傷，分析其機制可能與維持自由基清除系統(tǒng)平衡有關。此前有研究證實，曲美他嗪能增加心衰大鼠心肌細胞SOD表達，改善心肌細胞病理和超微結構，并可改善大鼠心功能[15]，這與本研究結果相仿。

4.4 與細胞骨架相關蛋白

研究證實，缺血缺氧可直接導致心肌細胞骨架的損傷[16]。角蛋白是細胞骨架的重要組成成分，對線粒體形態(tài)結構可起到保護作用。本實驗結果表明，曲美他嗪能下調模型組上調的角蛋白18，提示曲美他嗪可在一定程度上保護細胞骨架免于受損裂解，但其保護機制尚不明確。

4.5 與細胞分化增殖相關蛋白

核內不均一核糖核蛋白A2/B1(hnRNPA2/B1)是一種重要的RNA連接蛋白，與細胞有絲分裂、分化及凋亡的調節(jié)相關。核仁磷酸蛋白（NPM）是一種多功能核仁磷酸化蛋白，參與中心體的復制、有絲分裂、DNA修補等生命活動。研究發(fā)現，以上兩種蛋白與腫瘤等增殖性疾病的發(fā)病密切相關[17,18]，與心血管疾病關系報道較少。本實驗結果提示，模型組hnRNPA2/B1和NPM表達上調，曲美他嗪組兩者均下調，推測曲美他嗪可能參與了調節(jié)心肌細胞分化增殖、減緩細胞凋亡、修復損傷心肌。

本實驗采用Western blot技術，從蛋白水平驗證線粒體Stress-70、ATP-α、Nucleophosmin在各組的表達水平，實驗結果表明，模型組Stress-70、NPM表達上調，ATP-α表達下調，曲美他嗪組Stress-70、NPM表達下調，ATP-α表達上調，此結果與蛋白質組學變化趨勢一致，說明采用雙向凝膠電泳和質譜技術研究曲美他嗪對氣虛血瘀證心衰大鼠心肌線粒體蛋白質組學的影響，結果真實可靠。