新型輪狀病毒反向遺傳學(xué)系統(tǒng)的開發(fā)及應(yīng)用

葛 雨，冉旭華，聞曉波

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，黑龍江 大慶 163319）

輪狀病毒（rotavirus，RV）是呼腸孤病毒科輪狀病毒屬重要成員，是導(dǎo)致嬰幼兒和幼齡動(dòng)物腹瀉的主要病原體之一。RV的基因組由11個(gè)獨(dú)立片段的dsRNA組成，編碼6種結(jié)構(gòu)蛋白（VP1、VP2、VP3、VP4、VP6、VP7）和5/6種非結(jié)構(gòu)蛋白（NSP1、NSP2、NSP3、NSP4、NSP5/NSP6）。人們對(duì)RV 11個(gè)基因片段功能、作用機(jī)制研究并不透徹，且不同毒株之間，重配、重排事件的不斷發(fā)生，很難有目的地、精確定位地改造基因的精細(xì)結(jié)構(gòu)以確定這些變化對(duì)表型性狀的直接影響。由于缺乏完全基于質(zhì)粒的反向遺傳學(xué)系統(tǒng)，阻礙了對(duì)RV復(fù)制和發(fā)病機(jī)制的深入研究。

反向遺傳系統(tǒng)是指直接從生物的遺傳物質(zhì)入手來闡述生物生命發(fā)生的本質(zhì)現(xiàn)象[1]?？梢栽O(shè)計(jì)個(gè)別病毒基因中的特定突變，產(chǎn)生感染性病毒顆粒并探索其表型。RNA病毒的反向遺傳系統(tǒng)涉及在cDNA基礎(chǔ)上操作其基因組，需要將cDNA轉(zhuǎn)染后，拯救具有感染性的活的子代病毒（野生型或突變型）。在最初的研究中使用了輔助病毒的共感染或雙重感染。但是，由于攜帶工程化基因組的病毒顆粒可能很難從輔助病毒中分離出來，因此最終目的是創(chuàng)建僅含質(zhì)?；騼H含RNA的反向遺傳學(xué)系統(tǒng)，無需輔助病毒，它可以將工程化突變的表型變化精確表現(xiàn)。1990年有人提出開發(fā)RV反向遺傳系統(tǒng)，經(jīng)過20多年的研究[2]，如今已成功建立了僅RV 11個(gè)片段質(zhì)粒的反向遺傳系統(tǒng)，現(xiàn)將最新研究進(jìn)展及其應(yīng)用作以綜述。

1 輪狀病毒反向遺傳系統(tǒng)的研究進(jìn)展

1.1 模板依賴性體外R V R N A復(fù)制系統(tǒng)建立1990年，首次確定RV SA11株全基因組核苷酸序列[3]后有研究人員提出克隆用于測(cè)序的cDNA，并希望從克隆的cDNA中獲得具有感染性的病毒粒子，進(jìn)行RV反向遺傳系統(tǒng)的開發(fā)。1994年Chen D等[4]建立了“模板依賴性體外RV RNA復(fù)制系統(tǒng)”，該系統(tǒng)在RV正鏈模板RNA上啟動(dòng)并合成全長(zhǎng)雙鏈RNA。許多研究者推測(cè)RV反向遺傳學(xué)系統(tǒng)將會(huì)很快成功。然而，接下來的數(shù)年世界各地的研究者們雖然進(jìn)行了深入的嘗試，卻沒有利用這個(gè)系統(tǒng)獲得任何重組輪狀病毒。

1.2 輔助病毒驅(qū)動(dòng)的反向遺傳學(xué)系統(tǒng)的建立2006年，Komoto等[5]根據(jù)輪狀病毒在體內(nèi)的復(fù)制周期，提出一個(gè)理論：“應(yīng)當(dāng)識(shí)別并復(fù)制源自cDNA（已感染野生型輪狀病毒）的正鏈RNA，通過RNA依賴的RNA聚合酶（RdRp）產(chǎn)生dsRNA，獲得來自cDNA具有感染性的輪狀病毒。這為反向遺傳系統(tǒng)的研究提供了一個(gè)理論基礎(chǔ)。2010年Troupin等報(bào)道了基于重排基因片段的優(yōu)先包裝RV的反向遺傳學(xué)方法，該方法是通過利用輔助病毒來分離單基因替換的重組RV。2013年Richards等[6]在此基礎(chǔ)上使用獨(dú)立的選擇機(jī)制產(chǎn)生了含有NSP2基因片段的重組病毒。在輔助病毒驅(qū)動(dòng)的反向遺傳學(xué)系統(tǒng)中獲得了重組的RV[7-8]。雖然這種反向遺傳系統(tǒng)在技術(shù)上是有限的，只能拯救部分片段的感染性，拯救效率也并不高，且需要輔助病毒的參與，重組的病毒難以區(qū)分開輔助病毒和輪狀病毒，且在之后試驗(yàn)研究中也并沒有用此方法再次獲得重組病毒。但在此項(xiàng)試驗(yàn)中改變了輪狀病毒基因組，獲得了含有由cDNA衍生的VP4[9]、NSP2[10-11]和NSP3[10]基因片段的重組RV。這一成果為RV的基因工程研究打開了大門。

1.3 輔助質(zhì)粒驅(qū)動(dòng)的反向遺傳系統(tǒng)的建立2017年Yuta Kanai等[12]在前人研究基礎(chǔ)上開發(fā)了完全基于質(zhì)粒的RV反向遺傳系統(tǒng)，針對(duì)已建立的呼腸弧病毒科病毒反向遺傳學(xué)系統(tǒng)，做了2個(gè)重要的修改，加入病毒融合的相關(guān)小跨膜蛋白（FAST）和減毒痘病毒（VV）加帽酶（D1R和D12L[13-15]）。FAST是唯一已知的未包膜病毒融合體[16]，可在體內(nèi)促進(jìn)病毒復(fù)制[17]。另外，由于RV mRNA 3'末端不是聚腺苷酸化的，將VV加帽酶用于重組的RV[18-20]中，T7pol轉(zhuǎn)錄物被VV加帽酶有效地封閉在細(xì)胞質(zhì)中，從而提高翻譯效率。Kanai等將RV的11個(gè)基因區(qū)段，以及編碼FAST和VV加帽酶D1R和D12L的14個(gè)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，獲得了重組病毒。在試驗(yàn)中為了排除與親代病毒污染的可能性，在NSP1-NSP4基因區(qū)段設(shè)計(jì)了獨(dú)特的酶切位點(diǎn)（作為遺傳標(biāo)記），排除了親代病毒可能性。對(duì)RTPCR產(chǎn)物的直接測(cè)序，證實(shí)rSA11是來自cDNA的重組病毒，且其電泳型與天然SA11的電泳型無差別。病毒的復(fù)制動(dòng)力學(xué)和峰值滴度測(cè)試結(jié)果也表明天然和重組病毒具有類似的復(fù)制特征[12]。同時(shí)Kanai等利用新開發(fā)的反向遺傳學(xué)系統(tǒng)獲得的重配病毒rSA11/KU VP6，和天然SA11的病毒表現(xiàn)出相似的復(fù)制動(dòng)力學(xué)。獲得的重配病毒是未曾報(bào)道過的，是從此次反向遺傳系統(tǒng)中獲得的獨(dú)特遺傳組合[12]。

1.4 無需輔助質(zhì)粒的 R V的反向遺傳系統(tǒng)建立2017年Komoto等[21]開發(fā)的完全基于質(zhì)粒的RV反向遺傳學(xué)系統(tǒng)已經(jīng)取得了巨大的進(jìn)步，但后續(xù)的研究發(fā)現(xiàn)VV加帽酶（D1R和D12L[13-15]）兩種表達(dá)的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染對(duì)于獲得重組病毒不是必需的，因此2018年Komoto等[22]將此方法進(jìn)行了優(yōu)化。在共轉(zhuǎn)染時(shí)將其中一個(gè)片段的質(zhì)粒相對(duì)其他質(zhì)粒的3倍進(jìn)行轉(zhuǎn)染進(jìn)行對(duì)比，發(fā)現(xiàn)分別在NSP2和NSP5的轉(zhuǎn)染量增加時(shí)，病毒滴度增加?；谶@個(gè)發(fā)現(xiàn)又將NSP2質(zhì)粒和NSP5質(zhì)粒轉(zhuǎn)染量進(jìn)行倍數(shù)增加對(duì)比，發(fā)現(xiàn)在NSP2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染量增加3倍和NSP5質(zhì)粒轉(zhuǎn)染量增加5倍時(shí)重組病毒的拯救效率較好，成功建立了不需要輔助質(zhì)粒的RV的反向遺傳系統(tǒng)。該系統(tǒng)僅用RV的11個(gè)基因片段的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染BHK-T7細(xì)胞，獲得源自cDNA的重組RV。雖然NSP2質(zhì)粒和NSP5質(zhì)粒轉(zhuǎn)染量增加提高了病毒拯救效率，但其機(jī)制仍不清楚，需要進(jìn)一步的研究。

2 RV反向遺傳系統(tǒng)的應(yīng)用

2.1 R V反向遺傳系統(tǒng)在 R V致病機(jī)制研究中的應(yīng)用

2.1.1 研究RV NSP1 C端區(qū)域功能在RV中NSP1可以通過促進(jìn)IFN調(diào)節(jié)因子3（IRF3）的降解來拮抗干擾素（IFN）信號(hào)[23]，可利用反向遺傳傳系統(tǒng)分析C-末端截短的NSP1突變病毒在先天性免疫應(yīng)答中的作用。2017年Kanai等利用基于14質(zhì)粒的反向遺傳系統(tǒng)，分別構(gòu)建重組NSP1（rSA11）的RV和C-末端截短的NSP1突變體（rSA11-dC103），證明了NSP1的C-末端區(qū)域是其通過拮抗IRF3來抑制IFN信號(hào)傳導(dǎo)所必須的[23-25]。

2.1.2 研究RV NSP6在病毒復(fù)制中的作用RV非結(jié)構(gòu)蛋白NSP6存在于絕大多數(shù)輪狀病毒毒株中，因此一些研究人員認(rèn)為NSP6蛋白有利于增加病毒的復(fù)制。然而，在病毒復(fù)制周期中沒有直接的證據(jù)能表明其功能及其必要性。2017年Komoto等[21]利用基于14質(zhì)粒的RV反向遺傳學(xué)系統(tǒng)獲得重組的RV（rSA11）和NSP6缺陷型重組病毒，以研究NSP6在病毒復(fù)制周期中的功能。通過病毒生長(zhǎng)曲線發(fā)現(xiàn)RV NSP6缺陷型病毒復(fù)制周期比rSA11慢，但是最終可以達(dá)到一個(gè)相近的病毒滴度。噬斑形成結(jié)果表明NSP6缺陷型病毒形成的斑塊較小。證實(shí)了雖然NSP6蛋白可以有效地促進(jìn)病毒生長(zhǎng)，但NSP6蛋白對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)中的病毒復(fù)制不是必需的。

2.2 用于外源基因的表達(dá)

2.2.1 輔助質(zhì)粒驅(qū)動(dòng)的反向遺傳系統(tǒng)在外源片段表達(dá)中的應(yīng)用2001年P(guān)atton等研究發(fā)現(xiàn)，NSP1基因片段對(duì)病毒復(fù)制沒有顯著影響。在此基礎(chǔ)上，2017年Yuta Kanai等[12]在基于14質(zhì)粒的反向遺傳系統(tǒng)中，利用分裂綠色熒光蛋白系統(tǒng)GFP（48 bp）標(biāo)記NSP1，用以確定是否能夠利用反向遺傳系統(tǒng)拯救表達(dá)了外源小片段的RV。GFP包括GFP1-10檢測(cè)器片段和GFP11標(biāo)簽片段通過自動(dòng)組裝能力來恢復(fù)完全熒光信號(hào)[26]。在重組NSP1 ORF的C-末端引入GFP11片段結(jié)果表明在細(xì)胞中表現(xiàn)出與重組病毒類似的復(fù)制動(dòng)力學(xué)；觀察GFP信號(hào)，GFP1-10與NSP1-GFP11仍有高效互補(bǔ)產(chǎn)生特定的GFP信號(hào)的功能[12]。rNSP1-GFP11蛋白分散在感染細(xì)胞的核周區(qū)域，與天然NSP1的分布相同[12]，證明NSP1基因片段對(duì)病毒復(fù)制沒有顯著影響，與前人研究一致[27-29]。GFP的成功表達(dá)，說明小片段的插入對(duì)重組病毒并沒有影響，可將其應(yīng)用于深入探討RV結(jié)構(gòu)特征的研究。

在進(jìn)行小片段插入成功后，又進(jìn)行了較大片段的插入嘗試，在重組RV NSP1片段上插入NanoLuc螢光素酶（NLuc）（516 bp），成功拯救了表達(dá)NLuc的重組病毒（rSA11-NLuc）。試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，rSA11-NLuc可在細(xì)胞中連續(xù)傳5代保持不變，這種遺傳穩(wěn)定性可應(yīng)用于RV感染時(shí)體內(nèi)的追蹤。Smee等[30]還用已知的RV抑制劑利巴韋林對(duì)rSA11-NLuc進(jìn)行抗病毒篩選。在有效劑量?jī)?nèi)細(xì)胞無病理變化，在小劑量使用時(shí)，發(fā)現(xiàn)利巴韋林對(duì)rSA11-NLuc有劑量依賴性抑制，該研究表明rSA11-NLuc可用于新型抗病毒藥物的篩選[12]。

2.2.2 無需輔助質(zhì)粒的RV反向遺傳系統(tǒng)在外源片段表達(dá)中的應(yīng)用2018年Komoto等[22]在基于無需輔助質(zhì)粒的反向遺傳系統(tǒng)上，進(jìn)行外源片段的插入，利用該系統(tǒng)獲得重組的SA11（rSA11），將來自豬瘟病毒具有自我切割功能的2A肽序列（幫助病毒翻譯、復(fù)制）和NanoLuc螢光素酶（NLuc）連接獲得2A-NLuc，替換NSP1 ORF的N-末端獲得rSA11-2A-NLuc重組RV病毒，并確定了2A-NLuc替換NSP1 ORF的N-末端不會(huì)阻斷病毒的復(fù)制但復(fù)制效率略低，噬斑尺寸較??；同時(shí)rSA11-NLuc和rSA11在細(xì)胞中連續(xù)10傳代，通過PAGE和熒光素酶分析，確定了rSA11-NLuc對(duì)NLuc表達(dá)的遺傳穩(wěn)定性是保持不變的。rSA11-2A-NLuc的成功拯救，證明了無需輔助質(zhì)粒的反向遺傳系統(tǒng)也可應(yīng)用于外源片段的表達(dá)?；谶@一發(fā)現(xiàn)，Komoto等嘗試在NSP1插入更長(zhǎng)的外源基因片段（EGFP和mCherry），其重組NSP1片段的大小分別為1 994 bp和1 982 bp，在感染細(xì)胞中連續(xù)傳代10次仍能檢測(cè)到，再次證實(shí)其穩(wěn)定的遺傳性。這為RV分子生物學(xué)的研究、開發(fā)新疫苗、構(gòu)建載體作了重要的補(bǔ)充。

3 展望

RV反向遺傳學(xué)系統(tǒng)，自1994年有人提出開發(fā)起，經(jīng)過數(shù)十年的研究，在2018年終于成功建立一種無需輔助病毒、無需輔助質(zhì)粒且高效、簡(jiǎn)化RV反向遺傳系統(tǒng)，在新的抗RV病毒藥物的篩選、新型活疫苗的開發(fā)等具有巨大的應(yīng)用價(jià)值；并且可以解決RV的基本分子生物學(xué)問題，如“定做”的遺傳變化引起的表型變化、宿主范圍限制、病毒致弱等方面都具有重要意義。該新型RV的反向遺傳操作系統(tǒng)是研究RV的細(xì)胞侵入、病毒基因和蛋白合成、病毒釋放以及致病機(jī)制的強(qiáng)有力“武器”，將極大地加快RV相關(guān)領(lǐng)域的研究步伐。但是，利用該項(xiàng)反向遺傳系統(tǒng)的工作機(jī)制仍不清楚，例如雙鏈RNA的合成，是否與藍(lán)舌病的反向遺傳系統(tǒng)具有相似之處；對(duì)于來自不同群的RV基因片段的反向遺傳拯救工作仍未成功；另外，提高NSP2和NSP5質(zhì)粒轉(zhuǎn)染量為什么就不需要輔助質(zhì)粒參與就可以完成RV拯救，這一機(jī)制尚不清楚，仍需要進(jìn)一步的研究。