一例豬鏈球菌與藍耳病病毒混合感染的實驗室診斷

陶巍夫，李 超，王浩先，黃培鑫，倪宏波

（黑龍江八一農(nóng)墾大學動物科技學院，黑龍江 大慶 163000）

隨著我國養(yǎng)殖行業(yè)的快速發(fā)展，各種疾病給豬場的發(fā)展造成了嚴重的制約。同時人們對食品及生命安全提出了更高的要求，也為養(yǎng)殖行業(yè)敲響了警鐘，養(yǎng)殖場更應該注意養(yǎng)殖方式的合理化和規(guī)范化，給人們更多的保障。本文根據(jù)被送檢的病豬，運用臨床診斷、病理學剖檢、細菌學和PCR技術(shù)進行診斷，確診為鏈球菌和藍耳病病毒混合感染，現(xiàn)將診斷過程匯總?cè)缦隆?/p>

1 材料與方法

1.1 病料的采集安達市某規(guī)?；B(yǎng)豬場送檢的患病仔豬，無菌條件下采集病死豬的肝臟、肺、脾臟、腎及小腸和淋巴結(jié)組織等病料進行后續(xù)診斷。

1.2 試驗材料Marker DL 2000購自大連寶生生物工程有限公司，TIANamp Genomic DNA Kit DNA提取試劑盒購自TIANGEN公司，PCR Master Mix緩沖液，RNeasy Plus Mini Handbook RNA提取試劑盒購自QIAGEN公司，RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自MBI公司。其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 引物設(shè)計根據(jù)GenBank中已發(fā)表的豬普通藍耳?。≒RRS）和鏈球菌的基因序列及相關(guān)文設(shè)計特異引物。

表1 引物序列Table 1Peimer sequence

1.4 細菌分離培養(yǎng)無菌條件下采集仔豬肝、肺，在無菌臺中取肝、肺部病變組織，均勻涂在血液營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中，37℃下培養(yǎng)24 h后觀察培養(yǎng)基中菌落形態(tài)。將滅菌的載玻片取出，擦干，隨后滴加1滴生理鹽水，挑取單菌落并使其在生理鹽水中均勻分布，用酒精燈加熱玻璃片背面并余熱烘干，用革蘭氏染色液進行染色，油鏡觀察。從培養(yǎng)基中挑取單菌落涂在另一個血液營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24 h后觀察培養(yǎng)基中菌落形態(tài)，查看污染情況。取2個試管分別加入5 mL LB液體培養(yǎng)基，用10培養(yǎng)槍頭從血液營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中挑取單個菌落加入其中一個試管中，另一個作為對照組，放在搖床中，37℃培養(yǎng)24 h后，觀察試管變化情況。

1.5 核酸的提取與 P C R鑒定

1.5.1 組織DNA和RNA提取按照TIANamp Geomic DNA Kit操作進行提取DNA；按照RNeasy Plus Mini Handbook RNA提取盒進行RNA提取，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.2 RNA反轉(zhuǎn)錄和PCR擴增按RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit反轉(zhuǎn)錄盒說明書操作步驟將病毒提取的RNA進行反轉(zhuǎn)錄，得到的cDNA在-20℃進行保存?zhèn)溆?。用得到的DNA和cDNA為模板，豬圓環(huán)病毒（PCV）、豬普通致病性豬藍耳病（PRRS）等特異性引物進行PCR反應擴增，取10 μL的擴增產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.6 藥敏試驗將鑒定為豬普通致病性豬藍耳病和鏈球菌混合感染的純培養(yǎng)物用接種棒均勻涂布在鮮血培養(yǎng)基上，將藥敏紙片（慶大霉素、卡那霉素、恩諾沙星等10種藥物）分別貼于平皿中，37℃培養(yǎng)24 h，測定抑制菌圈直徑大小，根據(jù)檢測標準判定結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 病理變化新生仔豬出現(xiàn)大量死亡，部分妊娠母豬出現(xiàn)部分流產(chǎn)，偶見木乃伊胎，感染后的母豬體溫上升，新生仔豬則出現(xiàn)呼吸困難、生長緩慢、日漸消瘦、站立不穩(wěn)、耳廓呈現(xiàn)紫藍色出血斑點、皮膚蒼白并有小皰疹，病豬四肢呈現(xiàn)八字形外張、站立不穩(wěn)等臨床癥狀。剖檢時主要的病理變化有脾腫大、彌漫性間質(zhì)性肺炎。病豬剖檢可見腹腔積液、腸壁黏膜變薄出血、全身淋巴結(jié)腫大出血。病豬的皮膚多處出現(xiàn)紫紅色的出血斑點。

2.2 細菌分離結(jié)果將小塊肺臟組織均勻涂在血液營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，培養(yǎng)出的菌落為連續(xù)鏈狀的菌落，挑取單菌落到血液營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中純化出單一菌落見圖3，革蘭氏染色后油鏡下觀察到革蘭氏陽性球菌，其形態(tài)見圖4。

圖1 肺臟纖維樣病變Fig.1Pulmonary fibrosis

圖2 脾臟出血、腫大Fig.2The spleen is bleeding and swollen

圖3 血液營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基菌落形態(tài)Fig.3Blood nutrition AGAR medium colony morphology

圖4 革蘭氏染色鏡檢結(jié)果Fig.4Results of gram stain microsco py

2.3 P C R檢測結(jié)果

2.3.1 以細菌的DNA為模板，選用鏈球菌特異性引物進行PCR鑒定。PCR結(jié)果經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析見圖5，顯示第3泳道條帶為659 bp，與鏈球菌目的條帶大小相符。

圖5 細菌擴增結(jié)果Fig.5Bacterial amplification results

2.3.2 以患豬病毒的基因為模板，選用豬瘟病毒、圓環(huán)病毒以及藍耳病病毒的特異性引物進行PCR鑒定。結(jié)果藍耳病病毒為陽性，其余均為陰性。藍耳病病毒PCR結(jié)果經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析見圖6，第4泳道的條帶為373 bp，與藍耳病病毒的目的條帶相符。

圖6 病毒擴增結(jié)果Fig.6V irus amplification results

2.4 藥敏試驗結(jié)果

表2 藥敏試驗結(jié)果Table 2The results of drug susceptibility

3 討論

3.1 豬藍耳病，別名豬神秘病、豬不孕與呼吸綜合征、豬流產(chǎn)與呼吸綜合征、豬繁殖與呼吸障礙綜合征[1]。本病于1987年首次在美國的北卡羅來納州、明尼蘇達州、艾奧瓦州、印第安納州的豬群中暴發(fā)流行。1991年6月荷蘭學者首先從病料中分離出了病毒，并稱其為Lelystad毒株。1996年，我國郭寶清等首次從我國流產(chǎn)胎豬中分離出藍耳病病毒。由于該病原具有很強的致病性，藍耳病被列為二類動物疫病，2008年，高致病性藍耳病被我國農(nóng)業(yè)部列為一類動物疫病。豬藍耳病病毒易變異，具有遺傳異質(zhì)性，是全球豬健康和福祉最有負擔的病原體[2]。藍耳病不論什么品種、年齡、性別的豬，均可發(fā)病，其中妊娠母豬和1月齡內(nèi)的仔豬尤為易感，本病呈地方流行性，無季節(jié)性[3]。豬藍耳病一般傳播方式為空氣傳播、性傳播、血液接觸以及垂直傳播[4]。該病還可與其他豬病混合或繼發(fā)感染發(fā)病。均為急性傳染病，臨床癥狀主要為新生仔豬大量死亡、體溫升高、食欲廢退、呼吸系統(tǒng)損傷。母豬妊娠后期發(fā)生流產(chǎn)、產(chǎn)木乃伊胎等病癥。同時還可能引發(fā)高致病性的藍耳病。高致病性豬藍耳病是由豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒變異株引起的一種急性高致死性疫病，也是一種免疫抑制病［5］。高致病性藍耳病還有發(fā)病率極高、傳播迅速、發(fā)病急、發(fā)病時間長等特點。目前，針對此病尚無有效的治療藥物，通過免疫接種以及對癥治療等方法防控此類病癥，還可以通過使用抗生素減少繼發(fā)感染，以達到減少養(yǎng)殖行業(yè)的損失以及保障我們的人身安全。

3.2 豬鏈球菌病是由多種致病性鏈球菌混合感染引起的一種人畜共患病。早在1968的荷蘭和丹麥就有報道人感染豬鏈球菌的病例，目前全球已有400多余例人感染病例。我國在1998年的江蘇以及2005年的四川曾出現(xiàn)多例病例，嚴重的甚至導致死亡?，F(xiàn)在每年還存在散發(fā)病例。鏈球菌的易感宿主較多，雞、兔、豬、馬、牛、羊等均為常見宿主。豬不論其品種、性別和年齡均可感染。鏈球菌病發(fā)病有時會呈現(xiàn)明顯的季節(jié)性，但臨床豬發(fā)病則不呈現(xiàn)明顯的季節(jié)性，在持續(xù)高溫時會出現(xiàn)大面積發(fā)病的情況。同時鏈球菌病的發(fā)病需要經(jīng)諸多因素的誘導，其中不僅有環(huán)境因素、人為因素，還有遺傳因素。當飼養(yǎng)條件差或溫度忽高忽低時，動物免疫力下降就可能造成此病的爆發(fā)。該病可通過種群的直接或間接接觸發(fā)病，發(fā)病急，難以控制。其中，主要傳染源為患病和病死動物。鏈球菌病的臨床表現(xiàn)多樣，可表現(xiàn)為各種化膿創(chuàng)或敗血癥，也可表現(xiàn)為各種局部感染，同時伴有一些常見的臨床癥狀。如患有急性敗血癥的病豬會出現(xiàn)觸之尖叫、皮膚呈現(xiàn)藍紫色、流鼻液、便秘或倒地不起等癥狀?；加心X膜炎的病豬臨床癥狀有食欲減退、精神萎靡、出現(xiàn)轉(zhuǎn)圈運動、觸碰身體時發(fā)生抽搐、口吐白沫、四肢呈游泳狀滑動等。當患有亞急性或最急性型時會患關(guān)節(jié)炎、乳房炎等?；加嘘P(guān)節(jié)炎的仔豬出現(xiàn)步態(tài)僵硬、肌肉震顫、四肢猛烈滑動死亡。淋巴結(jié)膿腫的豬則出現(xiàn)呼吸困難、體溫升高、頸部等處觸之堅硬、有熱痛等癥狀，并可能伴有神經(jīng)癥狀。由于本病的發(fā)病特點，抗菌類的藥物可以有效地針對本類病進行治療，但是細菌的耐藥性不斷增強，為本病的治療增加了難度。鏈球菌病具有一定的傳染性，所以給現(xiàn)在的行業(yè)增添了風險，針對此病應該盡早發(fā)現(xiàn)，盡早確診，盡早治療，以降低養(yǎng)殖中的風險。

3.3 雖然至今還沒有治療豬繁殖與呼吸障礙綜合征的有效藥物，但是致病性豬藍耳病滅活疫苗已被研制出，且經(jīng)過大量的試驗證明該疫苗安全有效，疫苗的防護效率可以達到80%左右[6]。為避免境外傳入，引進豬種時有關(guān)部門要嚴格進行檢疫，并進行隔離觀察，拒絕從發(fā)生過藍耳病的豬場購買豬種。如果發(fā)生高致病藍耳病，應立刻上報疫情，盡快封鎖豬場，對患病豬進行全面撲殺、銷毀，控制疾病的擴散和蔓延。嚴格執(zhí)行全進全出、自繁自養(yǎng)的管理制度，對畜舍經(jīng)常清掃消毒，保持通風，增加環(huán)境舒適度，并且要對飼養(yǎng)工具進行常態(tài)消毒處理。

3.4 目前，國內(nèi)外已經(jīng)研究出弱毒疫苗以及滅活疫苗。國內(nèi)的變異毒株藍耳病疫苗包括JXA1-R、TJMF92和Hu-F112，經(jīng)典的毒株主要有CH1-a和R98等，弱毒疫苗可產(chǎn)生體液免疫以及細胞免疫，效果明顯，能夠保證不出現(xiàn)嚴重臨診癥狀。對于健康的豬群應及時接種疫苗，提高抵抗力。目前市面的疫苗種類多樣，要根據(jù)區(qū)域流行毒株進行正確選擇[7]，由于藍耳病傳播迅速，流行范圍廣，并且該病的病毒抗原多樣，因此該病不能完全依賴疫苗注射。一般情況下對病畜進行緊急的疫苗接種是有效的，尤其是發(fā)病早期并準確診斷時，但不能長期依賴緊急的免疫措施，要做好綜合的防范措施和預防免疫。免疫是預防的關(guān)鍵，防止豬圓環(huán)病毒、豬瘟病毒、藍耳病病毒等病毒性疾病與巴氏桿菌、大腸桿菌、鏈球菌等細菌性疾病的混合感染[8]。

3.5 預防鏈球菌病的常規(guī)措施，包括平時對飼養(yǎng)環(huán)境的全面消毒、科學飼喂、建立良好舒適的飼養(yǎng)環(huán)境，并加以適當?shù)倪\動。平時要注意牲畜全進全出、自繁自養(yǎng)的模式。提高動物的抗病能力，防止并發(fā)及繼發(fā)感染，可以有效地預防該病的傳播[9]。

3.6 在疾病流行的季節(jié)要提前做好免疫，制定健全的管理制度，科學執(zhí)行，以免疾病爆發(fā)流行。預防鏈球菌病應采如下取措施。

3.6.1 做出正確診斷，制定相應的防護措施以及預防辦法，對病畜進行緊急隔離。禁止疫畜動物群體的活動，緊急上報相關(guān)的部門及臨近的縣、鄉(xiāng)。

3.6.2 對病豬所用的飼養(yǎng)工具進行全面的消毒處理，避免病毒的傳播，并將病畜的糞污進行合理處理等。

3.6.3 對豬圈要進行嚴格、徹底的清毒，這樣可控制傳染源，避免養(yǎng)殖場出現(xiàn)較大的疫情[10]。對全體動物進行全面的檢疫，如發(fā)現(xiàn)有臨床癥狀的病畜緊急進行隔離或淘汰。

4 結(jié)論

將被送檢的病豬，運用實驗室檢查、臨床診斷、病理學解剖、細菌學和PCR技術(shù)進行診斷，確診為豬鏈球菌和藍耳病病毒混合感染，確診之后對該疾病進行仔細分析，并給出了相應的治療方案以及預防措施。