結(jié)核分枝桿菌耐丙硫異煙胺相關(guān)基因研究進(jìn)展

譚旎，張泓

結(jié)核病是結(jié)核分枝桿菌感染引起的一種“古老”傳染病，而目前結(jié)核病仍是全球范圍內(nèi)最常見的傳染病［1］。盡管過去20年間人們?yōu)槎糁平Y(jié)核病流行做出了巨大努力，但耐藥結(jié)核病尤其是耐多藥結(jié)核?。∕DR-TB）、廣泛耐藥結(jié)核?。╔DR-TB）的出現(xiàn)為全球范圍內(nèi)結(jié)核病防控帶來了巨大挑戰(zhàn)。2018年世界衛(wèi)生組織（WHO）全球結(jié)核病調(diào)查報(bào)告顯示，2017年全球范圍內(nèi)新發(fā)結(jié)核病患者數(shù)量約為1 010萬(wàn)，其中我國(guó)新發(fā)結(jié)核病患者數(shù)量約占8.9%；2017年全球估算新發(fā)利福平耐藥結(jié)核病（RR-TB）患者數(shù)量約為55.8萬(wàn)例，其中82%為MDR-TB，而印度（24%）、中國(guó)（13%）和俄羅斯（10%）3個(gè)國(guó)家新發(fā)MDR-TB/RR-TB患者數(shù)量約占全球新發(fā)MDR-TB/RR-TB患者總數(shù)的47%；耐藥結(jié)核病治療成功率較低，全球平均耐藥結(jié)核病治療成功率約為55%［2］。

《2010年全國(guó)第五次結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查報(bào)告》［3］顯示，我國(guó)結(jié)核病患者對(duì)異煙肼（INH）耐藥率最高，為28.6%，對(duì)丙硫異煙胺（Pto）耐藥率為12.9%；肺結(jié)核患者耐藥率前5位藥物依次為INH、鏈霉素（SM）、對(duì)氨基水楊酸（PAS）、Pto、氧氟沙星（Ofx），其中初治肺結(jié)核患者耐藥率前5位藥物依次為INH、SM、PAS、Pto、Ofx，復(fù)治肺結(jié)核患者耐藥率前5位藥物依次為INH、利福平（RFP）、SM、PAS、Pto；由于初治肺結(jié)核患者耐藥率前5位藥物中包括3種二線抗結(jié)核藥物，因此我國(guó)肺結(jié)核患者耐藥形勢(shì)較嚴(yán)峻，需引起重視。

Pto是二線抗結(jié)核藥物之一，口服進(jìn)入人體后會(huì)被迅速吸收并廣泛分布于全身組織、體液，且各組織、腦脊液、血液藥物濃度較為接近。近年來，隨著結(jié)核分枝桿菌對(duì)Pto耐藥率升高，Pto耐藥機(jī)制研究尤其是耐藥基因研究備受關(guān)注。本文通過檢索國(guó)內(nèi)外參考文獻(xiàn)，綜述了結(jié)核分枝桿菌耐Pto相關(guān)基因，旨在為結(jié)核分枝桿菌對(duì)Pto的耐藥機(jī)制研究提供參考。

1 作用機(jī)制

MDR-TB指同時(shí)對(duì)INH和RFP耐藥的結(jié)核病，Pto、乙硫異煙胺（Eto）結(jié)構(gòu)與INH類似，均屬INH硫代酰胺類似物，可導(dǎo)致結(jié)核分枝桿菌失去耐酸性及合成霉菌酸的能力，因此治療MDR-TB時(shí)Pto與Eto可以互換［4］；此外，由于Pto與Eto具有良好的腦脊液滲透作用，因此二者常用于治療藥物敏感性結(jié)核性腦膜炎、粟粒狀結(jié)核病等［4-5］。

Pto是一種前體藥物，在結(jié)核分枝桿菌內(nèi)被單加氧酶ethA活化后與煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）結(jié)合形成Pto-NAD并抑制參與霉菌酸合成途徑的烯酰基載體蛋白（ACP）還原酶、中斷蛋白質(zhì)合成途徑，繼而阻斷霉菌酸生物合成并擾亂結(jié)核分枝桿菌細(xì)胞膜，最終達(dá)到抗結(jié)核分枝桿菌的目的［4］。

研究表明，ethA-ethR基因座編碼單加氧酶，其中ethR屬轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子TetR/CamR家族阻遏物，是一種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，ethR的結(jié)合域通過與ethA啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合而負(fù)調(diào)節(jié)ethA的表達(dá)，因此ethA-ethR基因座涉及Pto的活化并調(diào)控Pto的抗酸能力［6-7］。mshA基因編碼的糖基轉(zhuǎn)移酶參與霉菌生物合成及N-乙酰半胱氨酸葡糖胺肌醇（MSH）合成，而MSH可通過ethA促進(jìn)Pto活化并抑制結(jié)核分枝桿菌［4，8］。Ndh基因通過編碼還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸脫氫酶而調(diào)節(jié)還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）/氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）比例，在NAD+與Pto形成Pto-NAD過程中具有重要作用［9-11］。因此，調(diào)節(jié)單加氧酶的ethR基因、mshA基因、ndh基因?qū)Y(jié)核分枝桿菌耐Pto至關(guān)重要。此外，還有研究發(fā)現(xiàn)結(jié)核分枝桿菌中存在Pto生物活化的其他不依賴ethR基因的替代途徑如含黃素腺嘌呤二核苷酸（FAD）的單加氧酶mymA以劑量依賴方式保留結(jié)核分枝桿菌對(duì)Pto的敏感性［12］。

2 耐藥機(jī)制

目前，結(jié)核分枝桿菌的耐藥機(jī)制研究主要包括靶基因突變、細(xì)胞壁通透性變化、外排泵機(jī)制、藥物降解及失活酶等，其中靶基因突變是結(jié)核分枝桿菌對(duì)Pto耐藥的主要分子作用機(jī)制。由于過去幾十年多數(shù)研究集中于探討Eto而非Pto的耐藥機(jī)制，因此目前報(bào)道Pto耐藥相關(guān)的具有硫代酰胺抗性的基因僅有幾個(gè)［4］，而由于Eto與Pto顯示出高度交叉耐藥性，因此既往關(guān)于Eto的耐藥機(jī)制研究成為分析Pto耐藥機(jī)制研究的主要依據(jù)。目前，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，結(jié)核分枝桿菌對(duì)Pto耐藥主要與inhA基因、ethA基因、ethR基因、mshA基因、ndh基因、mymA基因突變有關(guān)［9，12-13］，其中ethA基因突變是結(jié)核分枝桿菌對(duì)Pto 耐藥的主要基因突變類型［14］。

3 耐藥基因

3.1 inhA基因 既往研究發(fā)現(xiàn)，Pto對(duì)INH高度耐藥的結(jié)核分枝桿菌有效，但對(duì)INH輕度耐藥的結(jié)核分枝桿菌的效果則較差。INH是治療結(jié)核病的有效藥物之一，而Pto是治療MDR-TB的二線抗結(jié)核藥物，INH與Pto均屬前體藥物，需不同的酶進(jìn)行活化，由于存在共同作用機(jī)制而導(dǎo)致二者交叉耐藥。MACHADO等［15］研究表明，inhA基因調(diào)控區(qū)域的突變組合效應(yīng)導(dǎo)致MDR-TB患者結(jié)核分枝桿菌對(duì)INH、Pto 均產(chǎn)生耐藥性；近期研究表明，INH耐藥通常是由katG基因、inhA基因、inhA基因啟動(dòng)子區(qū)域突變導(dǎo)致的［16］。katG基因突變常與INH高度耐藥有關(guān)，katG基因編碼的過氧化氫酶可將INH轉(zhuǎn)化為其活性形式，但由于katG基因不參與Pto的活化，因此Pto的作用不受katG基因突變影響，而由于Pto與INH具有相同的最終靶點(diǎn)，因此inhA基因突變可導(dǎo)致inhA基因編碼產(chǎn)物過表達(dá)或修飾而造成INH與Pto交叉耐藥［15，17］。inhA基因突變所致INH耐藥通常為低水平耐藥并可通過加大INH劑量而減輕INH耐藥，因此臨床常經(jīng)驗(yàn)性使用大劑量INH聯(lián)合Pto治療MDR-TB，而對(duì)大劑量INH耐藥且無inhA基因突變患者可選擇Pto代替INH［18-20］。除inhA基因突變外，Pto還與inhA基因啟動(dòng)子區(qū)域、inhA基因開放閱讀框突變［21］（見表1）有關(guān)，其可通過降低Pto與NAD的親和力而導(dǎo)致結(jié)核分枝桿菌對(duì)Pto耐藥［15］。

3.2 ethA基因與ethR基因 ethA基因也稱etaA基因（Rv3854c），其編碼的單加氧酶ethA是一種含F(xiàn)AD的NADPH特異性酶，能夠進(jìn)行Baeyer-Villiger氧化反應(yīng)［4，22-24］。Pto經(jīng)單加氧酶ethA激活后作用方式與INH非常相似，其活性形式與NAD+反應(yīng)產(chǎn)生Pto-NAD，進(jìn)而抑制inhA基因及霉菌酸生物合成［22-23，25-26］。TAN等［14］研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)Pto耐藥的結(jié)核分枝桿菌ethA基因突變頻率為51.4%（19/37），其中ethA基因第798位AGCAGG突變（絲氨酸266精氨酸）突變頻率為18.9%（7/37），被認(rèn)為是與結(jié)核分枝桿菌對(duì)Pto耐藥有關(guān)的最普遍的基因突變類型（見表1）。ethR基因是ethA基因表達(dá)的負(fù)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，ethR基因突變導(dǎo)致ethA基因過度表達(dá)時(shí)可導(dǎo)致結(jié)核分枝桿菌對(duì)Pto耐藥［6］。此外，ethA基因啟動(dòng)子區(qū)域或其負(fù)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子ethR基因結(jié)合域內(nèi)出現(xiàn)突變時(shí)可通過以下方式導(dǎo)致ethA基因表達(dá)下調(diào)：（1）獨(dú)立于ethR基因調(diào)節(jié)而直接降低ethA基因轉(zhuǎn)錄；（2）增加ethR基因轉(zhuǎn)錄而導(dǎo)致ethA基因表達(dá)受抑；（3）影響ethA基因與ethA基因啟動(dòng)子區(qū)域的結(jié)合［27］。

另有研究表明，ethA基因還可能通過不穩(wěn)定的氧化亞磺酸中間體活化硫代苯甲酰胺、硫代卡巴肽、硫代乙酰胺、硫代乙酮及其他硫代酰胺藥物，這可能是INH與Pto交叉耐藥的重要原因［28-29］。

3.3 mshA基因（Rv0486） 研究表明，對(duì)INH和Pto耐藥的結(jié)核分枝桿菌突變體均存在mshA基因突變，mshA基因編碼產(chǎn)物糖基轉(zhuǎn)移酶參與MSH的生物合成［8］。VILCHèZE等［30］研究發(fā)現(xiàn)，含有單個(gè)堿基對(duì)修飾的mshA基因突變體并導(dǎo)致氨基酸改變的8株結(jié)核分枝桿菌MSH含量從99.9%下降至83.0%，而對(duì)Pto的耐藥率升高4～8倍；此外，筆者還發(fā)現(xiàn)mshA基因的7個(gè)獨(dú)立的錯(cuò)義及移碼突變，其中4個(gè)mshA基因突變體具有單個(gè)氨基酸突變，即精氨酸273半胱氨酸、甘氨酸299半胱氨酸、甘氨酸356天冬氨酸、谷氨酸361丙氨酸［8］（見表1）。因此，mshA基因缺失、錯(cuò)義及移碼將導(dǎo)致結(jié)核分枝桿菌產(chǎn)生MSH減少及MSH通過ethA基因促進(jìn)Pto的活化減少，繼而造成結(jié)核分枝桿菌對(duì)Pto 耐藥。

ANG等［12］研究發(fā)現(xiàn)，單獨(dú)的mshA基因缺失所致Pto對(duì)結(jié)核分枝桿菌的半數(shù)最低抑菌濃度（MIC50）較ethA/ethR基因突變高，提示對(duì)于Pto殺滅作用的影響，mshA基因突變至少與ethA/ethR基因突變一樣。此外，mshA基因突變可導(dǎo)致敲除ethA/ethR基因的結(jié)核分枝桿菌對(duì)Pto完全耐藥，提示Pto殺滅作用中的MSH作用可以是獨(dú)立的，或者至少不限于其與ethA基因的相互作用，可能參與Pto生物激活的替代途徑，但仍需進(jìn)一步研究證實(shí)［12］。

表1 已知的Pto耐藥基因突變位點(diǎn)（類型）、核苷酸序列改變及氨基酸改變Table 1 Known drug resistance related gene mutation site（types）to prothionamide，changes of nucleotide sequences and amino acids

3.4 ndh基因（Rv1854c） ndh基因編碼產(chǎn)物為Ⅱ型還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸脫氫酶，而Ⅱ型還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸脫氫酶可通過將NADH氧化成NAD+而調(diào)節(jié)NADH/NAD比值。研究表明，ndh基因突變可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)NADH含量增加并競(jìng)爭(zhēng)性地抑制INH-NAD或Pto-NAD及INH或Pto的結(jié)合，繼而導(dǎo)致INH與Pto交叉耐藥［10-11］。TAN等［14］在46株對(duì)Pto耐藥的結(jié)核分枝桿菌中發(fā)現(xiàn)37株（80.4%）存在基因突變，基因突變類別包括19種，其中27株為單核苷酸突變，10株為雙核苷酸突變，而27株單核苷酸突變菌株中4株為ndh基因非同義突變，分別為S162T、L289R、G339A、S388N（見表1），證實(shí)ndh基因突變可導(dǎo)致結(jié)核分枝桿菌對(duì)Pto耐藥。

3.5 mymA基因 既往研究表明，結(jié)核分枝桿菌存在6種Baeyer-Villiger單加氧酶，而在這6種單加氧酶中ethA特征最為明顯，而mymA、ethA則具有最大的序列同源［26，31］。GRANT等［24］研究發(fā)現(xiàn)，單獨(dú)的mymA基因突變可導(dǎo)致結(jié)核分枝桿菌對(duì)Pto低度耐藥，而mymA基因與ethA基因可通過加成方式活化Pto，這可能是Pto活化及抗性的新分子作用機(jī)制。ANG等［12］研究發(fā)現(xiàn)，ethA/ethR基因刪除僅導(dǎo)致結(jié)核分枝桿菌對(duì)Pto耐藥性輕微升高，這可能與結(jié)核分枝桿菌存在mymA基因而保留其對(duì)Pto的易感性、劑量依賴性藥物反應(yīng)有關(guān)。

4 小結(jié)與展望

耐藥結(jié)核病為全球結(jié)核病防控工作帶來重大挑戰(zhàn)，鑒于新型抗結(jié)核藥物的研發(fā)及應(yīng)用所需時(shí)間較長(zhǎng)，因此提高現(xiàn)有藥物療效是一種不應(yīng)忽視的替代策略。目前，基于Pto耐藥機(jī)制研發(fā)的具有抗結(jié)核分枝桿菌作用的單加氧酶inhA、ethR抑制劑等Pto增效劑研究已取得一定成果，并有望為抗結(jié)核治療方案提供新的選擇［32-34］；Pto耐藥機(jī)制及相關(guān)基因突變研究已取得一定進(jìn)展，已發(fā)現(xiàn)多種耐藥遺傳機(jī)制，包括靶基因機(jī)構(gòu)改變、激活前體藥物所需酶功能喪失等，證實(shí)基因突變及基因轉(zhuǎn)錄改變是結(jié)核分枝桿菌對(duì)Pto耐藥的重要機(jī)制，但由于缺乏系統(tǒng)的全基因組轉(zhuǎn)錄對(duì)照，因此部分基因轉(zhuǎn)錄異常導(dǎo)致結(jié)核分枝桿菌對(duì)Pto耐藥的機(jī)制仍需進(jìn)一步深入研究。此外，目前已知的結(jié)核分枝桿菌對(duì)Pto耐藥相關(guān)突變基因及突變位點(diǎn)仍十分有限，可能還存在尚未發(fā)現(xiàn)的基因突變，相信隨著不斷的探索及新技術(shù)的應(yīng)用，必將逐步發(fā)現(xiàn)可能存在的基因突變及基因轉(zhuǎn)錄改變對(duì)結(jié)核分枝桿菌耐藥性的影響，繼而指導(dǎo)臨床制定科學(xué)、有效的抗結(jié)核治療方案。