壬基酚提取及檢測研究進(jìn)展*

羅 婭綜述，許 潔審校（遵義醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院，貴州遵義563099）

壬基酚（NP）作為環(huán)境內(nèi)分泌干擾物（EEDs）的典型代表主要應(yīng)用于化工業(yè)，其對環(huán)境的污染極為廣泛。NP的化學(xué)結(jié)構(gòu)與雌二醇相似，具有擬雌激素作用，可以通過不同途徑，如胎盤、乳汁、污染的水源、食物或經(jīng)皮膚吸收進(jìn)入機(jī)體，產(chǎn)生毒性反應(yīng)[1-3]。目前，食品、環(huán)境樣品、生物樣品等中NP的提取方法包括液-液萃取、液-固萃取、固相萃取等，檢測方法主要有氣相色譜-質(zhì)譜連用（GC-MS）、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS）和高效液相色譜熒光檢測法（HPLC-FLD）[4-8]。本文對國內(nèi)外學(xué)者關(guān)于NP在食品、環(huán)境樣品、生物樣品等常用的提取和檢測方法進(jìn)行綜述，分析文獻(xiàn)中不同實驗條件下NP提取和檢測結(jié)果產(chǎn)生差異的原因，提出NP檢測方法研究的展望。

1 NP的提取方法

1.1 液-液萃取

1.1.1 有機(jī)萃取 液-液萃取是利用溶液系統(tǒng)中各組分在其溶劑中的溶解度不同來分離混合物的單元操作。液-液萃取無須特殊裝置，是NP研究中用得最多的提取方法。

萃取劑為NP溶解度較高的有機(jī)溶劑。肖全偉等[9]用乙酸-乙酸銨緩沖液和正己烷-乙醚混合溶劑提取血清中的NP；曹燕花等[10]用正己烷-乙醚作為提取液提取大鼠組織和血清中的NP；蘆軍萍等[11]和喬麗麗等[12]僅用正己烷對血清中的NP進(jìn)行提取。葉欣[13]用二氯甲烷-乙腈（1∶2）提取地表水中的4種酚類物質(zhì)。王茜等[14]用正己烷和丙酮提取淤泥和土壤中的雙酚A、NP和辛基酚，樣本回收率為83.7%～115.6%。王世玉等[15]和郭新東等[16]用二氯甲烷作為提取液萃取化妝品中的NP。郭宗敏等[17]用無水乙醇提取植物油中的NP，樣品與提取劑體積在1∶10左右時，回收率可達(dá)80%。王曉燕等[18]用分散液-液微萃取法（DLLME）提取小體積環(huán)境水樣中酚類化合物。DLLME法所需萃取劑少、萃取速度較快、效率和富集倍數(shù)較高、操作簡便，因此，DLLME是酚類化合物的常用提取方法。

1.1.2 溶劑浮選法 溶劑浮選法是最近20多年來發(fā)展起來的一種新型分離富集技術(shù)，由于其具有同時完成分離與富集的優(yōu)點，因此在水中痕量物質(zhì)的分離富集及檢測方面應(yīng)用較多[19-22]。朱俐等[23]以正辛醇作為溶劑對水樣中雙酚A、辛基酚和NP進(jìn)行浮選，即在溶劑浮選過程中，雙酚A、辛基酚和NP有疏水親氣特性，聯(lián)通一定速率的氮氣，浮選體系中就會產(chǎn)生氣-液界面，所以水相中的雙酚A、辛基酚和NP可被大量氣泡所產(chǎn)生“氣-液”界面吸附，并隨氣泡上升至浮選柱上部，氣泡破裂后，待分離物質(zhì)就自動溶解于上層有機(jī)相中。溶劑浮選法要求待分離水樣酸度為pH3，氮氣流量速率在60 mL/min左右，浮選效率達(dá)到最佳，此方法的回收率為95.0%～100.5%。

1.1.3 濁點萃取法（CPE） 早在1976年，WANTANABE等首次提出了“濁點萃取”的概念[24-25]，是近年來才應(yīng)用的一種液-液萃取技術(shù)，其原理是以表面活性劑溶于水中形成的膠束，其增溶性和濁點現(xiàn)象為基礎(chǔ)，通過改變實驗環(huán)境參數(shù)（如溫度、酸堿度、壓力、電解質(zhì)等）引發(fā)相分離，從而使親水性物質(zhì)與親油性物質(zhì)分離，并實現(xiàn)一定的富集倍數(shù)，其不使用揮發(fā)性有機(jī)溶劑，不影響環(huán)境。目前，濁點萃取法已廣泛應(yīng)用于分離和純化金屬螯合物、生物大分子，甚至環(huán)境樣品的預(yù)處理。丁一等[26]采用CPE，使用表面活性劑對牛奶樣品實現(xiàn)破乳及萃取牛奶中的NP和又酚A，NP回收率為71.3%～73.3%。與傳統(tǒng)的萃取方法相比，CPE具有揮發(fā)性有機(jī)溶劑用量少、操作簡單快速、無須特殊裝置、實驗成本低等優(yōu)點，因而是一種環(huán)境友好型樣品前處理方法。

1.2 固-液萃取 固-液萃取，也稱浸取，即用液體分離固體混合物中的組分，是一個化學(xué)實驗，但其操作過程并不造成被萃取物質(zhì)化學(xué)成分的改變，所以固-液萃取其實是一個物理過程。固-液萃取在NP提取試驗中用得較少，鄧琴等[27]用二氯甲烷索氏裝置對土壤樣本中的NP進(jìn)行提取，此方法操作簡便，不需要衍生化，加標(biāo)回收率為98.73%～101.78%。

1.3 固相萃取（SPE） SPE技術(shù)是將固-液萃取和液相色譜技術(shù)結(jié)合起來，可用于樣品的分離、凈化和富集[28-30]。SPE在液-固相色譜理論之上，運(yùn)用選擇性的吸附和洗脫方式對樣品進(jìn)行預(yù)處理，包括富集、分離、凈化過程，是一種液相和固相共存的物理萃取過程，也可認(rèn)為是一種簡單的色譜過程。SPE有高效、環(huán)保、選擇性強(qiáng)、不容易乳化等優(yōu)點，但缺點較明顯，具有操作步驟煩鎖、富集效率波動較大、樣品預(yù)處理耗時較長等缺點。楊錨等[31]應(yīng)用SPE技術(shù)對小白菜和土壤中NP殘留降解的研究，進(jìn)一步優(yōu)化了小白菜樣品基質(zhì)中NP快速檢測技術(shù)。王萍等[32]利用Pro Elut CARB-NH2柱和重力作用原理，用正己烷活化、丙酮洗脫對化妝品中的NP進(jìn)行提取。該方法對樣品萃取條件進(jìn)行了改進(jìn)，正己烷提取完成后直接過柱，簡化了實驗步驟，減少了固相萃取活化劑用量，改變了洗脫劑種類并且減少了用量，縮短了實驗時間，降低了實驗成本。肖晶等[33]用OASIS HLB固相萃取柱濃縮、富集和凈化尿液，用二氯甲烷和甲醇混合溶液洗脫SPE柱，分離尿液中的雙酚A、辛基酚和NP，回收率為76.13%～109.11%。陳素清等[34]將香煙過濾嘴的預(yù)富集圓形柱內(nèi)置于傳統(tǒng)的高效液相色譜（HPLC）注射管作為進(jìn)樣環(huán)，用于在線固相萃取，利用流動注射，克服了SPE樣品處理時間長等缺點。此方法操作簡單、快速，能有效排除基體成分干擾，樣品用量少，有毒物質(zhì)的產(chǎn)生及樣品的消耗較低。楊蘊(yùn)嘉等[35]采用在線固相萃取柱（Waters Direct Connect HP）對飲用水中的NP進(jìn)行提取檢測，該方法樣品不需前處理，飲用水樣可直接進(jìn)樣并在線富集，自動洗脫至分析柱。該方法為飲用水中內(nèi)環(huán)境分泌干擾物的檢測分析提供了一個快捷簡便的新途徑。

2 NP的檢測

2.1 HPLC HPLC也稱為“高效液相色譜”“高速液相色譜”“高分離度液相色譜”“近代柱色譜”等，分為正相HPLC和反相HPLC。在化學(xué)和生化分析領(lǐng)域中，HPLC是目前較為精確的分析方法。HPLC以液體為流動相，采用高壓輸液系統(tǒng)，將樣品通過流動相泵入有固定相的色譜柱，在柱內(nèi)各組被分離后，進(jìn)入檢測器，從而實現(xiàn)對樣品的分析檢測[36]。適用于分析高沸點、相對分子質(zhì)量大、不易揮發(fā)、極性不同的有機(jī)化合物。

正相HPLC是檢測NP的主要方法，該方法有檢測限低、檢出精度高等優(yōu)點，但對樣品的前處理和流動相的選擇要求較高，樣品未處理好，容易引起色譜柱堵塞、污染，而流動相未選擇恰當(dāng)，分離效果不好，檢測結(jié)果就不準(zhǔn)確。反相HPLC為由極性固定相和弱極性流動相所組成的液相色譜體系，葉欣[13]以乙腈-水為流動相體系、反相Waters ACQUITY UPLCTM BEH HILIC色譜柱及熒光檢測器測定了地表水和水性涂料中雙酚A、辛基酚、NP和辛基酚聚氧乙烯醚的含量，檢出限（LOD）為 0.4～0.5 mg/kg，方法簡單、快速，顯著降低了雜質(zhì)的干擾，提高了定量的準(zhǔn)確性。

2.2 LC-MS/MS LC-MS儀是液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)合應(yīng)用的儀器，其將液相色譜儀分離優(yōu)點（分離高沸點和熱不穩(wěn)定性化合物）與質(zhì)譜儀的優(yōu)點（強(qiáng)組分鑒定）結(jié)合起來。LC能夠有效分離待測樣品中的有機(jī)物，而MS能夠?qū)ζ浞珠_的有機(jī)物逐一分析，得出相對分子質(zhì)量、結(jié)構(gòu)和濃度等信息，是一種分離分析復(fù)雜有機(jī)混合物的有效手段。楊錨等[36]采用Agilent ZORBAX Rx-C18柱，以甲醇-乙酸銨-為流動相，梯度洗脫分離后，在LC-MS/MS多反應(yīng)監(jiān)測模式下對正、負(fù)離子同時掃描，定性與定量分析EEDs，包括辛基酚、NP和短鏈NP聚氧乙烯醚降解產(chǎn)物，對NP的檢出限為0.6 μg/kg，回收率為62%～113%。該方法具有準(zhǔn)確、簡單、靈敏度高，克服了背景干擾等優(yōu)點，可用于農(nóng)產(chǎn)品和食品包裝材料中NP的檢測。

2.3 GC-MS GC是利用不同物質(zhì)在固定相和載氣中的分配系數(shù)不同，從而使化合物從色譜柱流出的時間不同，達(dá)到分離化合物的目的。MS是利用帶電粒子在磁場或電場中的運(yùn)動規(guī)律，按其質(zhì)荷比（m/z）實現(xiàn)分離分析，測出離子質(zhì)量及強(qiáng)度分布，得到化合物的相對分子質(zhì)量、元素組成、分子式和分子結(jié)構(gòu)信息，具有定性專屬性、靈敏度高、檢測快速等特點[37]。GC-MS儀兼?zhèn)淞松V的高分離能力和質(zhì)譜的強(qiáng)定性能力。王世玉等[15]對環(huán)境中有NP同分異構(gòu)體進(jìn)行了檢測，優(yōu)化了氣相色譜-質(zhì)譜條件用氣相色譜-火焰離子化檢測器，確定了各同分異構(gòu)體的質(zhì)量比，采用內(nèi)標(biāo)法對含量較高的12種同分異構(gòu)體進(jìn)行定量分析，各同分異構(gòu)體的方法檢出限為 9.01～41.14 ng/L，回收率為 69.4%～129.0%，該方法靈敏度高。

2.4 免疫層析快速檢測 NP免疫層析法利用的是毛細(xì)管作用原理，NP樣品在條狀纖維制成的膜上泳動，NP與玻璃膜上結(jié)合有金粒子的抗體反應(yīng)后繼續(xù)向前泳動，因競爭作用，結(jié)合金粒子的抗體與檢測線處包被原（NP-OVA）的結(jié)合率會隨樣品中NP含量增加而減低，線的顏色也會逐漸變淡直至不顯色，在繼續(xù)向前泳動過程中會和噴涂在質(zhì)控線處的羊抗兔抗體發(fā)生非特異結(jié)合，膠體金粒子被攔截而顯色。杜志輝等[38]研制的NP免疫層析快速檢測試紙條，操作簡單，10 min即可出結(jié)果，可用于特殊環(huán)境，尤其是突發(fā)事件中NP的快速檢測。其缺點是試紙條保留時間較短，且檢測限高，僅對NP污染做定性檢測，該方法還在改進(jìn)。

2.5 酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA） ELISA是將可溶性的已知酶[辣根過氧化物酶（HRP）、堿性磷酸酶（AP）]標(biāo)記的抗原或抗體結(jié)合到聚苯乙烯等固相載體上，利用抗原抗體結(jié)合專一性的特點進(jìn)行免疫反應(yīng)，從而進(jìn)行定性和定量檢測的方法，可用于檢測大分子抗原和特異性抗體等。該技術(shù)國內(nèi)尚未見報道，國外MART′IANOV等[39]用ELISA對污水中的NP進(jìn)行檢測，NP的檢測極限大約10 ng/mL，且該方法與色譜數(shù)據(jù)具備良好的相關(guān)性（r=0.94），具有快速、靈敏、簡便、載體易于標(biāo)準(zhǔn)化等優(yōu)點。

2.6 電化學(xué)分析方法 電化學(xué)分析法是應(yīng)用電化學(xué)的基本原理和實驗技術(shù)，利用物質(zhì)的化學(xué)性質(zhì)來測定物質(zhì)組成及含量的分析方法。按照不同的參數(shù)分類，電化學(xué)分析方法可分為電化學(xué)傳感器法、電位分析法和伏安分析法等多個類型。常見用于NP檢測的電化學(xué)分析是傳感器法。鄭巧利等[40]通過制備金納米粒子/碳納米管修飾玻碳電極，建立了靈敏的NP電化學(xué)方法。黃穎等[41]等用氫氧化銅納米線和乙炔黑制備了一種新型的復(fù)合修飾碳糊電極，對測定水樣和土壤樣品中的NP效果較好，檢測限值達(dá)到1.26×10-8mol/L。

3 結(jié) 語

隨著國內(nèi)外工業(yè)的發(fā)展，NP作為化工行業(yè)的中間體，用量越來越大，對環(huán)境的污染也越來越嚴(yán)重。關(guān)于環(huán)境樣品、生物樣品等樣品中NP預(yù)處理和測定方法已取得許多進(jìn)展，從液-液萃取到固相在線處理，從傳統(tǒng)的色譜法到生物分析法，在各位研究者的推動下，提取和檢測方法一直不斷地向高效、精確、成本低等方向改進(jìn)和提升。檢測方法可能會因所研究領(lǐng)域和樣品的不同要求而各有千秋，但生物分析法因其高特異性、高靈敏性、定性定量檢測的優(yōu)勢，可能仍然會成為NP檢驗技術(shù)的研究熱點。

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