綿羊的超數(shù)排卵與胚胎移植

周曉霞，王自平 ，成述儒*

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，蘭州 730030；2.甘肅省隴西縣菜子畜牧技術(shù)服務(wù)站，定西 748100）

0 引言

超數(shù)排卵與胚胎移植技術(shù)（EMOT）是指對(duì)生產(chǎn)性能優(yōu)良和遺傳性穩(wěn)定的供體母畜進(jìn)行外源激素超數(shù)排卵處理，使母畜排出比自然狀態(tài)下多幾倍甚至十幾倍的卵子，配種后一定時(shí)間內(nèi)將受精卵取出，分別移植到其他母畜受體子宮內(nèi)，使之產(chǎn)出優(yōu)良后代的技術(shù)[1]。

超數(shù)排卵與胚胎移植技術(shù)可最大限度地發(fā)揮優(yōu)秀種畜的利用價(jià)值，加速動(dòng)物品種改良和育種速度。規(guī)?；B(yǎng)羊是我國(guó)羊產(chǎn)業(yè)發(fā)展的必然途徑 。人工輸精、超數(shù)排卵和胚胎移植技術(shù)是發(fā)展規(guī)?；B(yǎng)殖的重要措施，同期發(fā)情技術(shù)是人工輸精，胚胎移植技術(shù)的前提條件[2]。但在品種引進(jìn)中會(huì)遇到一些問(wèn)題，制約著畜牧業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。甘肅省被認(rèn)為是西北的主要的牛羊肉生產(chǎn)基地和供應(yīng)基地。隴西縣是甘肅省的肉羊大縣之一，為了快速擴(kuò)大優(yōu)質(zhì)種畜的數(shù)量，滿足全縣畜牧業(yè)發(fā)展的強(qiáng)勁的需求，在甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院等部門(mén)的支持下，在隴西縣進(jìn)行了奶牛冷凍胚胎移植和綿羊新鮮胚胎移植的試驗(yàn)和推廣，取得了可喜的成績(jī)。

盡管綿羊的冷凍胚胎已經(jīng)市場(chǎng)化，但冷凍對(duì)胚胎畢竟會(huì)造成一定的傷害，在有條件的情況下，新鮮胚胎移植還是最佳的選擇。牛的非手術(shù)胚胎移植法已經(jīng)在全國(guó)廣泛應(yīng)用，而綿羊的非手術(shù)胚胎移植法還需要解決一些實(shí)際問(wèn)題，目前腹腔鏡微創(chuàng)手術(shù)法是唯一可以推廣的可行的方法?，F(xiàn)將綿羊超數(shù)排卵與胚胎移植技術(shù)敘述如下，希望能夠與同行交流學(xué)習(xí)。

1 種公羊和供、受體母羊的選擇及飼養(yǎng)管理

種公羊與供體羊之比在1:4為宜。供體綿羊和受體綿羊之比在1:5為宜。

1.1 種公羊的選擇

選擇檢疫合格和有譜系的優(yōu)秀種羊。

1.2 優(yōu)秀供體綿羊的選擇

選擇遺傳性能穩(wěn)定、生產(chǎn)性能高、抗病力強(qiáng)、發(fā)情周期正常、無(wú)生殖道疾病，有1～2胎正常繁殖史的2～5歲的青壯年純種母羊作為供體。

1.3 受體母羊的選擇

選擇體格大、母性強(qiáng)、無(wú)婦科疾病、有正常繁殖史母羊作為供體。

1.4 飼養(yǎng)管理技術(shù)

提前驅(qū)蟲(chóng)、健胃和注射疫苗。需要有中上等膘情。避免產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)。

2 供體的超排及配種和受體的同期發(fā)情

綿羊的平均發(fā)情周期為17 d。做胚胎移植的最佳的季節(jié)是秋季。合理使用最佳的藥品，按羊的體格大小準(zhǔn)確掌握使用計(jì)量。FSH總劑量150～300 IU，LH總劑量100～150 IU，PG0.08～0.1 mg只／次，CIDR是商品化的孕激素T型硅膠陰道栓劑，按說(shuō)明書(shū)使用。

2.1 供體羊的超數(shù)排卵和配種

綿羊超數(shù)排卵常見(jiàn)方法有FSH＋PG法和孕激素（CIDR）＋FSH＋PG法等。下面主要介紹孕激素（CIDR）＋FSH＋PG＋LH法，這種方法模擬了自然周期過(guò)程，可提高采胚率和妊娠率。綿羊放入CIDR之日作為0 d，在第9 d換1個(gè)CIDR，在第13 d開(kāi)始3 d 6次遞減注射FSH，每次間隔12 h，在第15 d早晚同時(shí)注射FSH和PG，第5注射FSH時(shí)撤去第2個(gè)CIDR栓，在第16 d或第17 d確定供體羊發(fā)情時(shí)立即注射LH。用結(jié)扎輸卵管了的試情公羊試情，觀察并做記錄。采用本交和人工授精相互交替的方式進(jìn)行配種，每隔6h配1次。同時(shí)做好記錄。

2.2 受體羊的同期發(fā)情

目前綿羊的同期發(fā)情的方法主要采用孕酮陰道栓法和PG法。受體綿羊和供體綿羊同1 d放入CIDR之日作為0 d，在第9 d換1個(gè)CIDR，在第15天早晚各注射一次PG，第15天早上取出第二個(gè)CIDR，第16 d 注射LH。觀察并記錄發(fā)情情況。

3 胚胎的采集和移植

3.1 胚胎的采集

3.1.1 手術(shù)時(shí)間及術(shù)前準(zhǔn)備

輸卵管-子宮角雙沖法綿羊的手術(shù)采集胚胎的時(shí)間：以發(fā)情配種日為0 d ，在5～7 d從輸卵管-子宮角采集胚胎。在5～7 d采用此法可以把在輸卵管和子宮角的胚胎盡可能的全沖洗出來(lái)，可以得到最多的胚胎。

手術(shù)前禁食1d，限量飲水。常規(guī)消毒。將羊仰臥保定在自制可移動(dòng)的手術(shù)臺(tái)上，對(duì)術(shù)部剪毛、清洗，用5%的碘酊消毒。

3.1.2 輸卵管-子宮角雙沖法綿羊的手術(shù)采集胚胎

調(diào)節(jié)手術(shù)臺(tái):把手術(shù)臺(tái)根據(jù)術(shù)者的身高調(diào)節(jié)，讓羊前低后高位仰臥，不要超過(guò)45°，這樣可以降低腹內(nèi)壓便于操作，太高會(huì)引起胃內(nèi)容物流出，有可能引起異物性肺炎。

手術(shù)部位:手術(shù)部位選擇在乳房前和肚擠眼之間的腹中線上，乳房前2 cm處。

沖胚過(guò)程:鋪上創(chuàng)布，縱向切開(kāi)4 cm左右皮膚，鈍性分離皮下結(jié)締組織和肌肉層，腹膜層用鑷子輕輕夾住提起，用手術(shù)刀劃開(kāi)，盡量使其邊緣整齊，在整個(gè)過(guò)程中盡量不要讓出血，遇見(jiàn)血管用止血鉗止血再切開(kāi)。術(shù)者用食指和中指把子宮角牽引創(chuàng)口外，快速觀察和數(shù)出左側(cè)卵巢上黃體數(shù)，用腸鉗同時(shí)夾住子宮角分叉處與輸卵管漏斗部和輸卵管的壺腹部的交界處，不要傷及卵巢。用杜氏磷酸緩沖液20～30 mL（水浴加熱到30℃）由輸卵管漏斗部向子宮角分叉處沖洗，用19～20號(hào)針頭在子宮角分叉處扎一個(gè)小孔，然后將8～10號(hào)沖胚管從此空導(dǎo)入子宮角，給沖胚管氣囊充氣2～5 mL，拔出沖胚管內(nèi)芯。在輸卵管漏斗部和輸卵管的壺腹部的交界處用6～8號(hào)針頭扎入輸卵管，用50 mL注射器把20～30 mL（根據(jù)黃體數(shù)確定）把沖胚液注入，當(dāng)輸卵管和子宮角充盈時(shí)，放慢注射速度，用直徑為180 mm的表面皿接收沖胚液，等到全流完。快速把表面皿送入胚胎檢查室，迅速數(shù)出胚胎數(shù)，如果胚胎數(shù)與黃體數(shù)相差大就再?zèng)_一次。拔掉針頭和沖胚管，取掉腸鉗，輕輕按摩被腸鉗鉗的部位，促進(jìn)其血液循環(huán)，便于恢復(fù)。用同樣的方法沖右側(cè)。

縫合:沖胚完畢后，用含有甲硝唑的25～30℃的生理鹽水沖洗干凈子宮和卵巢，復(fù)位于腹腔。然后迅速轉(zhuǎn)位于縫合位置由縫合技術(shù)人員按分層依次縫合，在縫合前在腹部倒入適量加了青霉素和鏈霉素的溫?zé)嵘睇}水。縫腹膜和皮膚時(shí)一定要注意，腹膜縫不好引起腹疝，皮膚縫不好引起感染。縫皮膚的時(shí)候，針間距不要太大，0.5～1.0 cm左右為宜，線不要太緊，縫合完畢，把線頭和結(jié)全都整理在刀口的一側(cè)，把皮膚依次整理好，不要讓毛夾在皮膚之間，讓刀口外觀美麗平整，這樣有利于刀口愈合。

3.2 胚胎的檢查、鑒定和吸取

含有胚胎的沖胚液應(yīng)置于30℃的無(wú)菌箱中，最好在箱內(nèi)檢查，也可以在20～25℃的無(wú)菌操作室內(nèi)檢查，用2～3臺(tái)立體顯微鏡同時(shí)檢查，這樣可以縮短對(duì)胚胎進(jìn)行檢查和鑒定的時(shí)間。

在5～7 d的胚胎絕大多數(shù)是桑椹胚至擴(kuò)張囊胚。對(duì)胚胎發(fā)育階段與胚齡基本一致、結(jié)構(gòu)緊湊、分裂均勻、色調(diào)和透明度適中的一二級(jí)胚胎用吸胚器移入直徑為35 mm培養(yǎng)皿中，待移。把胚胎發(fā)育階段與胚齡不太一致、輪廓不清晰、色調(diào)變暗和變性細(xì)胞達(dá)30%～58%的三級(jí)胚胎用吸胚器移入另一個(gè)直徑為35 mm培養(yǎng)皿中，待移。一二級(jí)胚胎每只移1枚，三級(jí)胚胎每只移2枚。四級(jí)胚胎變性細(xì)胞占胚胎大部分不可用于移植廢棄。

吸取胚胎 用移植器依次吸一段保存液、一段空氣、一段含胚胎的保存液、一段空氣、一段保存液。

3.3 受體綿羊的胚胎移植

與供體羊一樣保定和消毒。手術(shù)部位不同，避開(kāi)兩條乳靜脈在在乳房前兩厘米左右微創(chuàng)移胚，左右各一個(gè)手術(shù)創(chuàng)，通過(guò)腹腔鏡觀察，把有黃體的一側(cè)子宮角拉出，用尖端磨鈍的16號(hào)針頭在子宮角尖處扎個(gè)小孔，把裝有胚胎的移植器從此孔插入，伸向子宮角尖，輕輕推出即可，堅(jiān)決不能回吸。移植完，與供體羊一樣處理。

4 術(shù)后的飼養(yǎng)管理和妊娠診斷

加強(qiáng)管理，不要突然改變飼喂方法，順其自然，不要引起應(yīng)激反應(yīng)。每天由飼養(yǎng)員在羊吃草時(shí)給傷口上噴碘酒消毒，不要強(qiáng)制抓羊。早期可以B超檢查是否妊娠，但這樣會(huì)引起應(yīng)激反應(yīng)，增加流產(chǎn)頭數(shù)。在實(shí)際的生產(chǎn)中以飼養(yǎng)員觀察是否發(fā)情為主，兩個(gè)情期不發(fā)情視為以懷孕。

5 改進(jìn)思路與前景預(yù)測(cè)

子宮和子宮角在盆腔里具有可移動(dòng)性。有一種自制的微創(chuàng)去勢(shì)手術(shù)刀，刀尖端有點(diǎn)像針灸針中的三棱針，稍微寬一點(diǎn)點(diǎn)，刀柄有一個(gè)半月牙很光滑的鉤鉤，可以往外挑子宮角，這種工具很好用，過(guò)去的老獸醫(yī)大夫常用，現(xiàn)在基本見(jiàn)不到了。這樣就避免了供體羊腹中線的手術(shù)部位，縮小了創(chuàng)傷面積，供體羊只需要一側(cè)有手術(shù)創(chuàng)，減少了一個(gè)手術(shù)創(chuàng)，并且不需要給腹腔打氣了，術(shù)后會(huì)減少術(shù)后粘連和感染的機(jī)會(huì)。

在術(shù)中不用腹腔鏡，腹腔鏡太貴了，畜牧技術(shù)人員只能在最低的成本下去推廣技術(shù)。在術(shù)部局麻處理后，切開(kāi)2～4 cm切口，鈍性分離肌肉層，切開(kāi)腹膜層，在切口的靠背側(cè)用拇指垂直于地面的方向用力一壓（要求術(shù)者拇指的力量可以撐起自己的重量），就像去勢(shì)一樣充分利用動(dòng)物的腹壓，擠出卵巢，然后四指墊在下面，同時(shí)用手背壓腹壁，用拇指輕輕向懷里方向摸，兩側(cè)的卵巢、子宮角和子宮體都會(huì)暴露在術(shù)者面前，動(dòng)作一定要輕而果斷，如果萬(wàn)一卵巢擠不出來(lái)，只要術(shù)者輕輕深入中指或食指摸到子宮角或者卵巢貼著腹壁輕輕向外撫摸叫可以順利進(jìn)行了，如果萬(wàn)一術(shù)者手感差不能準(zhǔn)確區(qū)分腸管和子宮角的區(qū)別，千萬(wàn)不要在腹腔亂摸，避免造成不必要的傷害，這種情況下清洗外陰后，找一個(gè)末端鈍性光滑的圓棒棒，套上避孕套，慢慢插入生殖道，當(dāng)?shù)竭_(dá)子宮頸的時(shí)候輕輕向手術(shù)部位方向頂，術(shù)者同時(shí)伸入手指去摸，既可以摸到子宮體、子宮角和卵巢，引出術(shù)口即可，我把這種迫不得已的方法稱(chēng)為順藤摸瓜法，不要沖洗生殖道，因?yàn)樯车烙凶詢(xún)艄δ?，沖洗反而破壞了它的微環(huán)境。把子宮牽拉出體外后，關(guān)閉創(chuàng)口，上蓋用溫?zé)嵘睇}水浸泡過(guò)的敷料，將子宮、子宮角和卵巢放于敷料上。

通過(guò)腹腔鏡速度快，但手術(shù)部位肌肉也被切斷，并且兩側(cè)都有創(chuàng)口口，增加了感染的機(jī)會(huì)。這樣采胚胎或者輸胚胎對(duì)羊的傷害比去勢(shì)的傷害程度還要小，推廣就更容易了。這樣就大大降低了新鮮胚胎移植的成本，把一個(gè)復(fù)雜的事變得更簡(jiǎn)單了，才有利于它產(chǎn)業(yè)化。

通過(guò)腹腔鏡速度快，但手術(shù)部位肌肉也被切斷，并且兩側(cè)都有創(chuàng)口，增加了感染的機(jī)會(huì)。這樣采胚胎或者輸胚胎對(duì)羊的傷害比去勢(shì)的傷害程度還要小，推廣就更容易了。這樣就大大降低了新鮮胚胎移植的成本，把一個(gè)復(fù)雜的事變得更簡(jiǎn)單了，才有利于它產(chǎn)業(yè)化。

我們可以在人醫(yī)中去學(xué)習(xí)，將羊的無(wú)痛非手術(shù)法胚胎移植變成現(xiàn)實(shí)是我們技術(shù)人員需要解決的實(shí)際問(wèn)題。

總之，胚胎移植技術(shù)為純種擴(kuò)繁最佳的手段，通過(guò)這種技術(shù)能夠讓非繁殖季節(jié)的誘導(dǎo)發(fā)情、超數(shù)排卵及鮮胚移植成為了現(xiàn)實(shí)[3]。新鮮胚胎和冷凍胚胎的移植必將會(huì)有機(jī)結(jié)合，像人工授精一樣會(huì)得到廣泛的應(yīng)用，推動(dòng)我國(guó)的畜牧產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展，增強(qiáng)國(guó)際競(jìng)爭(zhēng)力。

參考文獻(xiàn)

[1] 朱化彬，王皓宇，杜衛(wèi)華，等.我國(guó)胚胎生物技術(shù)進(jìn)展及其在良種牛擴(kuò)繁中的應(yīng)用[J].中國(guó)畜牧雜志，2014（2）:61-67.

[2] 包花拉，莫德日樂(lè)吐，王海軍，等.同期發(fā)情處理綿羊發(fā)情規(guī)律探討[J].畜牧與飼料科學(xué)，2015（11）:51-54+75.

[3] 王偉.綿羊的胚胎移植與高頻繁殖技術(shù)分析[J].北京農(nóng)業(yè)，2015（35）:124-125.