食品中罌粟殼殘留分析的研究進(jìn)展

◎ 王毅梅，楊 希

（鷹潭市綜合檢驗(yàn)檢測中心，江西 鷹潭 335000）

罌粟殼是罌粟科植物罌粟干燥成熟后的果殼，內(nèi)含嗎啡等20多種生物堿，具有斂肺、澀腸、止痛等功效，可用于治療久咳、久瀉、脫肛、脘腹[1]。但經(jīng)常食用會產(chǎn)生依賴性，長期食用會出現(xiàn)興奮、煩躁不安、乏力、出虛汗、犯困、面黃肌瘦等癥狀，嚴(yán)重時(shí)甚至對腎臟、神經(jīng)系統(tǒng)、消化系統(tǒng)造成損害，危害人體健康[2]。不法商販利用其成癮性，在食品中非法添加罌粟殼，使食物鮮美并讓消費(fèi)者成癮，牟取暴利。

衛(wèi)生部、公安部和國家工商行政管理局于1991年聯(lián)發(fā)《關(guān)于查處在食品中使用罌粟殼（籽）等違法行為的通知》，并組織各地依法進(jìn)行了查處。2008年，衛(wèi)生部規(guī)定在食品中禁止添加罌粟殼，并下發(fā)《食品中可能違法添加的非食用物質(zhì)和易濫用的食品添加劑品種名單（第一批）》的通知，且于2011年將罌粟殼禁用的產(chǎn)品類別范圍擴(kuò)大為火鍋底料及小吃類食品。

1 罌粟殼殘留分析現(xiàn)狀

1991年，各地依據(jù)衛(wèi)生部衛(wèi)監(jiān)發(fā)（1992）第21號文件《食品中阿片生物堿成分測定方法（暫行）》分析食品中罌粟殼殘留，包括薄層色譜法和高效液相色譜法。1997年之后，按照《麻醉藥品管理辦法》管理?xiàng)l例，以及公安部行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)GA/T 104-1995《鴉片毒品中嗎啡、可待因、蒂巴因、罌粟堿、那可汀的定性分析及嗎啡、可待因的定量分析方法》分析食品中罌粟殼殘留，包括氣相色譜法和薄層層析法。隨后關(guān)于食品中的罌粟殼殘留分析的研究相繼報(bào)道，包括薄層色譜法[3]、化學(xué)法與電化學(xué)法[4-5]、分光光度法[6]、示波極譜法[7]、酶聯(lián)免疫法[8-9]、液相色譜法[10-13]和氣相色譜法[14-15]等。近年來，隨著質(zhì)譜儀的普及，高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法成為食品中罌粟殼殘留的主要分析方法。2010年上海市食品藥品監(jiān)督管理局率先頒布了《火鍋食品中罌粟堿、嗎啡、那可丁、可待因和蒂巴因的測定液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》的地方性標(biāo)準(zhǔn)。2018年4月，市場監(jiān)管總局發(fā)布了《食品中嗎啡、可待因、罌粟堿、那可丁和蒂巴因的測定》補(bǔ)充檢驗(yàn)方法，該方法為高效液相色譜-質(zhì)譜法。

罌粟殼中主要的生物堿有嗎啡、那可汀、可待因、罌粟堿、蒂巴因5種，而嗎啡在食品中易形成乙基嗎啡。目前，大多罌粟殼殘留分析主要從嗎啡、乙基嗎啡、那可汀、可待因、罌粟堿和蒂巴因中選擇1～6種生物堿為分析對象。祝偉霞等[16]研究了罌粟殼中主要的幾種生物堿，檢出嗎啡、那可汀、可待因、罌粟堿、蒂巴因和原阿片堿的含量分別為50.2%、35.5%、8.6%、5.0%、0.5%和0.2%，并選擇了含量較高的嗎啡、那可汀、可待因、罌粟堿和蒂巴因這5種生物堿作為火鍋料中罌粟殼殘留分析的特征標(biāo)志物。

根據(jù)食品監(jiān)管實(shí)際需要，目前食品中罌粟殼殘留分析主要包括現(xiàn)場快速檢測方法和實(shí)驗(yàn)室確證分析方法。近年來，實(shí)驗(yàn)室確證分析方法中，關(guān)于高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法的報(bào)道較多，尤其是高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法。以上方法的分析對象均為各種生物堿。熒光PCR技術(shù)和LAMP技術(shù)在近年也被研究應(yīng)用于調(diào)味品中罌粟殼殘留分析。

2 現(xiàn)場快速檢測方法

現(xiàn)場檢驗(yàn)中，酶聯(lián)免疫法因其快速、高靈敏、高通量和高特異性等優(yōu)點(diǎn)，較化學(xué)法等其他現(xiàn)場快速檢測法更具優(yōu)勢。酶聯(lián)免疫法主要以嗎啡或罌粟堿為分析對象。

2.1 嗎啡類免疫試紙

嗎啡免疫膠體金試紙的應(yīng)用最初也主要用于吸毒者尿液的初篩檢驗(yàn)，而在用于分析火鍋底料、調(diào)味品和鹵制品等食品中的罌粟殼殘留時(shí)，常因食品中脂肪、蛋白質(zhì)等雜質(zhì)含量過高使得試紙擴(kuò)散難進(jìn)行。但若先加水浸泡和提取再測定，嗎啡的提取率不高，可能檢出假陰性結(jié)果。

鄭向梅等[17]用酸性水處理樣品，并加入少量乙醇以增大嗎啡溶解度，采用嗎啡免疫膠體金試紙做食品中罌粟殼殘留初篩檢驗(yàn)，回收率為92.3%～101%，并針對6份可疑樣品（包括鹵湯、調(diào)料和火鍋底料）、2份陰性樣品和2份陽性樣品，與高效液相色譜法相比較，結(jié)果一致。

2.2 罌粟堿類免疫試紙

鈕偉民等[18]以特異性抗罌粟堿為抗體，罌粟堿-辣根過氧化物酶結(jié)合物為抗原，研制了ELISA法檢測罌粟堿的試劑盒，其檢測限為0.1 μg/kg，檢測范圍為0.1～20 μg/kg，回收率為81.7%～113%。張冬升等[19]以罌粟堿多克隆抗體和酶標(biāo)結(jié)合物建立了酶聯(lián)免疫法快速檢測火鍋底料及調(diào)料中罌粟堿的方法，該方法最低檢出濃度為1.0 μg/kg，回收率為73.7%～95.5%。

張銀志等[20]以1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽（EDC·HCl）方法合成罌粟堿完全抗原作為競爭抗原，以納米金溶膠標(biāo)記罌粟堿多克隆抗體作為分析探針，構(gòu)建分析體系，制備罌粟堿納米金快速試劑條，建立罌粟堿快速的納米金溶膠標(biāo)記免疫層析檢測方法，靈敏度達(dá)到10 μg/L。

3 實(shí)驗(yàn)室確證分析方法

實(shí)驗(yàn)室確證分析方法在儀器分析前，均需將樣品制成組分較少的濃縮溶液進(jìn)行分析，因此樣品前處理效果對分析結(jié)果的影響也較大。

3.1 樣品前處理方法

目前前處理方法包括溶劑提取法、固相萃取法、QuChERS法、液液萃取法、雙水相萃取法和分散液相微萃取法等等。液液萃取法操作繁瑣，乳化嚴(yán)重，萃取率較低；雙水相萃取法則是指把1種聚合物與1種鹽的水溶液或者2種聚合物混合一起，由于聚合物與鹽之間或者2種聚合物與聚合物之間的不相溶性而形成兩相的萃取方法，樣品僅限水溶性樣品。分散液相微萃取法由液液萃取演化而來，是基于目標(biāo)化合物在小體積萃取劑和樣品溶液之間的平衡分配，萃取溶劑的種類有限，對基質(zhì)復(fù)雜樣品適用性差。較常用的是溶劑提取法和固相萃取法及QuChERS法。

3.1.1 溶劑提取法

由于罌粟殼中的生物堿在酸性條件下溶于水而在堿性條件下溶于有機(jī)溶劑，溶劑提取法包含2種。①將溶液調(diào)至酸性后，用乙醇水的混合液提取，如張靖等[21]用酸性乙醇提取罌粟堿、嗎啡和可待因的檢出限分別為0.3、0.8、3.0 μg/L。這種方法操作較簡便，但雜質(zhì)去除不徹底，因此一般會與固相萃取法結(jié)合使用。②在酸性溶液中用有機(jī)溶劑去除雜質(zhì)，再將酸性水溶液調(diào)至堿性，用有機(jī)溶劑反萃取，多選用混合有機(jī)溶劑萃取，如張艷萍等[22]采用三氯甲烷-異丙醇（4∶1）溶液提取。這種方法油脂去除較好，但有機(jī)溶劑用量較大，提取蒸干操作較繁瑣。

3.1.2 固相萃取法

固相萃取法是利用吸附劑將樣品中的目標(biāo)化合物吸附后，再用洗脫液或加熱解吸，使目標(biāo)化合物得到分離和富集，其中吸附劑主要是固體吸附劑，也出現(xiàn)新型的磁性液體吸附劑。常用的有HLB柱、MCX柱、PCX柱和WCX柱。祝偉霞等[16]比較了WCX、HLB和MCX小柱的凈化效果，受樣品基質(zhì)影響，采用MCX小柱凈化，生物堿的回收率較其他柱子高，為73.8%～94.3%。劉曉茂等[23]比較了PXC與MCX兩種固相萃取柱對火鍋底料樣品凈化效果，結(jié)果表明PXC凈化效果較好，并將PSA和PXC固相萃取柱串聯(lián)凈化，測定的5種生物堿檢出限為0.033～1.5 μg/kg，回收率為96.0%～112.5%。

李艷等[24]使用聚合離子液體包裹Fe3O4的方式合成磁性聚合離子液體材料作為磁固相萃取吸附劑，對罌粟堿樣品進(jìn)行萃取，再結(jié)合氣相色譜進(jìn)行測定，建立了火鍋底料中罌粟堿的檢測方法，檢出限為0.01 μg/mL，回收率為93.3%～106.8%。

3.1.3 QuChERS法

QuChERS法是用有機(jī)溶劑（乙酸乙酯或丙酮、乙腈）萃取高濕的樣品，后加入鹽（硫酸鎂、氯化鈉或緩沖試劑）促使有機(jī)溶劑和水分離，用分散固相萃取劑（C18或SPA）凈化離心后的上層溶液，再離心分析上層溶液。李航等[25]將樣品用QuChERS法提取凈化后采用液相色譜-質(zhì)譜法分析火鍋調(diào)料中罌粟殼（粉）殘留，5種生物堿的檢測限為0.21～10.37 μg/kg，回收率78.4%～100.6%。

3.2 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法

沈平等將樣品提取凈化后，經(jīng)過衍生[26]或直接[27]用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法測定食品中罌粟殼提取物的可待因、嗎啡、蒂巴因、罌粟堿和乙基嗎啡含量，未經(jīng)衍生檢出限為0.03～0.1 μg/mL，經(jīng)過衍生的檢出限為0.01～0.03 μg/mL。凈化衍生后，比直接測定大幅度提高了靈敏度和檢出率。

張百樂等[28]針對GC-MS檢測樣品需衍生化使操作較繁瑣的問題，采用實(shí)時(shí)直接分析串聯(lián)質(zhì)譜（DART-MS/MS）快速篩查火鍋底料、牛肉面湯及調(diào)味料中嗎啡、那可汀、可待因、罌粟堿、蒂巴因5種罌粟殼生物堿。實(shí)時(shí)直接分析是新型原位電離新技術(shù)，離子化不受鹽類、基質(zhì)、溶劑等的影響。樣品不需處理或簡單處理即可分析，能充分實(shí)現(xiàn)幾秒內(nèi)的快速、高通量的樣品分析。

3.3 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法

近年來，液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法分析食品中罌粟殼殘留，其中色譜部分主要涉及非極性色譜柱（如C18柱）和親水性極性色譜柱（如BEH HILIC 柱），質(zhì)譜部分主要包括多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）、全掃描和平行反應(yīng)監(jiān)測（PRM），定量方法由外標(biāo)法趨向于內(nèi)標(biāo)法。

范忠剛、李興根等[29-30]以C18柱為分析柱，在正離子MRM模式下，用外標(biāo)法定量建立液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法分析摻罌粟殼的熟肉制品、火鍋底料中罌粟殼生物堿殘留，5種生物堿檢出限為0.9～4.5 μg/kg，回收率為70%～110%。

簡龍海等[31]以BEH HILIC柱為分析柱，采用正離子MRM模式，用內(nèi)標(biāo)法定量，建立快速測定食品中的罌粟殼殘留生物堿的分析方法，5種生物堿的檢出限分別為3.8～10 μg/kg，回收率為85.4%～95.8%。宋娟等[32]用新型材料EMR Lipid凈化管凈化樣品，以BEH HILIC柱為分析柱，采用正離子MRM模式，用內(nèi)標(biāo)法定量建立UPLC-ESI-MS/MS法分析火鍋底料中罌粟殼生物堿殘留，5種生物堿檢出限為0.05～2 μg/kg，回收率為82.0%～100.8%。

孫珊珊等[33]將樣品用QuEChERS方法提取和凈化，以BEH HILIC柱為分析柱，采用正離子MRM檢測模式檢測，火鍋食品中罌粟殼成分，并且高分辨質(zhì)譜分析同時(shí)采用全掃描和PRM模式進(jìn)行監(jiān)測，對檢測結(jié)果出現(xiàn)的假陽性判斷和確證進(jìn)行詳細(xì)分析。結(jié)果麻椒、花椒、草果樣品中檢出與罌粟堿標(biāo)品保留時(shí)間接近、豐度比相差較大的干擾峰；從白胡椒、蓽撥樣品提取蒂巴因定量離子也出現(xiàn)類似干擾峰情況；香葉樣品中檢出與那可丁標(biāo)品保留時(shí)間與標(biāo)準(zhǔn)品一致且豐度比相近的干擾峰，應(yīng)采用高分辨質(zhì)譜進(jìn)行確證。

4 其他新型分析方法

實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)是通過熒光染料或熒光標(biāo)記的特異性的探針，對PCR產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記跟蹤，實(shí)現(xiàn)定量檢測。劉洋等[34]針對罌粟物種特異基因設(shè)計(jì)引物，建立了復(fù)合調(diào)味粉中罌粟殼殘留分析的實(shí)時(shí)熒光PCR方法，該方法檢出限為0.1%，靈敏度達(dá)到10 pg。

LAMP技術(shù)是利用2條特異性內(nèi)引物和2條特異性外引物來識別靶基因上的6個(gè)區(qū)域，其DNA聚合酶具有鏈置換活性，在65 ℃下進(jìn)行核酸快速擴(kuò)增，短時(shí)間內(nèi)即可完成。楊柳等[35]根據(jù)罌粟堿的特異性基因序列設(shè)計(jì)引物，建立調(diào)味粉中罌粟堿LAMP檢測方法，并研制出配套試劑盒。該法檢測最低濃度達(dá)70 pg/μL，敏感性是PCR檢測的10倍。

5 展望

盡管食品中罌粟殼殘留的分析方法很多，目前的分析方法主要是基于高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法，靈敏度高，可準(zhǔn)確定性精確定量，但這些儀器設(shè)備昂貴、運(yùn)行維護(hù)成本高、環(huán)境要求極高、檢測周期較長；而酶聯(lián)免疫法較其他方法簡便快速、高通量、高靈敏，但易出現(xiàn)假陽性；因此可將酶聯(lián)免疫法作為現(xiàn)場快速檢測方法進(jìn)行初篩，再用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法或氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法作為實(shí)驗(yàn)室確證分析，現(xiàn)場快速檢測和實(shí)驗(yàn)室確證分析相結(jié)合，應(yīng)是較符合食品安全監(jiān)管實(shí)情且較有利于推廣實(shí)行。

酶聯(lián)免疫法、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用等方法的分析對象僅為各種生物堿，而不能對罌粟物種來源進(jìn)行明確定性。熒光PCR技術(shù)和LAMP技術(shù)具有更強(qiáng)特異性，目前僅見應(yīng)用于調(diào)味品中的報(bào)道。而食品種類繁多，熒光PCR技術(shù)和LAMP技術(shù)具有廣闊的研究空間。