食品微生物能力驗證的重要因素

◎ 雷蘭蘭

（陜西省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗研究院，陜西 西安 710048）

能力驗證（Proficiency Testing）是利用實(shí)驗室間比對來判定實(shí)驗室和檢查機(jī)構(gòu)能力的活動，也是認(rèn)可機(jī)構(gòu)加入和維持國際相互承認(rèn)協(xié)議（MRA）的必要條件之一。對于已經(jīng)獲得或者申請CNAS認(rèn)可的實(shí)驗室，參加能力驗證活動是強(qiáng)制性的，CNAS-AL07-CNAS《能力驗證領(lǐng)域和頻次表》中要求食品微生物領(lǐng)域每年至少參加一次能力驗證，談?wù)剠⒓邮称肺⑸飳W(xué)能力驗證的體會。

1 樣品前處理

1.1 制訂檢驗方案

收到樣品后，先按照說明將樣品在適當(dāng)?shù)臈l件下進(jìn)行存放，一般微生物樣品多是冷藏和冷凍保存。再指定人員編寫該樣品考核的檢驗方案，方案中需包括進(jìn)行檢驗的具體時間和結(jié)果上報的時間，以及人、機(jī)、料、法、環(huán)、測6個要素，即進(jìn)行檢驗的人員、用到的設(shè)備儀器、試劑耗材及其數(shù)量、具體標(biāo)準(zhǔn)方法、進(jìn)行檢驗的具體實(shí)驗室和檢驗過程的具體操作。對于作業(yè)指導(dǎo)書有說明的部分，嚴(yán)格按照作業(yè)指導(dǎo)書的規(guī)定進(jìn)行操作，對于作業(yè)指導(dǎo)書沒有規(guī)定的操作，則按照本實(shí)驗室通過認(rèn)可的現(xiàn)行有效的常用標(biāo)準(zhǔn)規(guī)范進(jìn)行操作。

1.2 樣品復(fù)溶

使用作業(yè)指導(dǎo)書規(guī)定的稀釋劑，按照規(guī)定進(jìn)行復(fù)溶和轉(zhuǎn)移以及潤洗，并且在規(guī)定的時間內(nèi)完成該過程。由于有些細(xì)菌繁殖速度較快，20 min即可增殖一代，所以要在規(guī)定的時間內(nèi)完成樣品復(fù)溶及第一梯度稀釋液的制備。同時，將剩余的復(fù)溶液以及第一梯度稀釋液保存在4 ℃左右的冰箱中，以便于第一次檢驗結(jié)果出現(xiàn)問題不能計數(shù)時能夠進(jìn)行第二次檢驗。建議復(fù)溶過程由兩人進(jìn)行，一人操作，另外一人監(jiān)督，若發(fā)現(xiàn)問題，及時糾正。

1.3 定量檢驗

對于定量樣品，最重要的一點(diǎn)是做好稀釋度的選擇。稀釋度越高，檢驗人員的工作量越大；但是，稀釋度太低，則可能出現(xiàn)所有平板上的菌落數(shù)多不可計，最終無法報告結(jié)果。對于國內(nèi)的能力驗證和盲樣考核，如果作業(yè)指導(dǎo)書上沒有建議稀釋度的選擇，那么一般稀釋到10-5即可，如果作業(yè)指導(dǎo)書上有建議稀釋度，那么就至少要稀釋到指定稀釋度。例如，本實(shí)驗室曾經(jīng)做過大腸菌群的盲樣考核，作業(yè)指導(dǎo)書上建議稀釋至10-7，實(shí)際操作時，本實(shí)驗室檢驗人員稀釋至10-8。結(jié)果表明，在合理計數(shù)范圍內(nèi)的稀釋度為10-6。每一個樣品，保證至少由兩人同步檢驗，最后綜合比對兩人的結(jié)果，以減少人員誤差。每一個項目，除標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定所用到的培養(yǎng)基之外，盡量同步使用測試片或者其他等效培養(yǎng)基進(jìn)行檢驗，用來作為計數(shù)參考，但是最終報告結(jié)果時，還是應(yīng)以標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定培養(yǎng)基上的結(jié)果為準(zhǔn)。由于玻璃平皿可能存在不平整的情況或者玻璃不夠純凈進(jìn)而影響平板計數(shù)，建議使用一次性的塑料平皿，但是同一個樣本盡量使用不同包裝中的平皿，防止平皿中抑菌物質(zhì)殘留而影響菌落生長。

2 菌落總數(shù)

標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定是在培養(yǎng)至（48±2）h進(jìn)行計數(shù)，但是在實(shí)際檢驗過程中，如果樣品中添加的菌株在兩種以上，其中一種生長繁殖速度快且有蔓延趨勢，另外一種生長繁殖速度慢。在培養(yǎng)至48 h進(jìn)行計數(shù)時，發(fā)現(xiàn)其中一種菌落蔓延重疊，且覆蓋另外一種菌落，導(dǎo)致無法完全計數(shù)平板上的菌落。對于這種情況，則應(yīng)該在培養(yǎng)至12、24、36、48 h分別查看平板上的菌落生長情況和數(shù)量并記錄，以防止菌落蔓延和生長差異導(dǎo)致不能正確計數(shù)。如本實(shí)驗室在做菌落總數(shù)能力驗證時，發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)至12 h時，一種菌落直徑已達(dá)到2～3 mm，培養(yǎng)至48 h時，該種菌落直徑已達(dá)到5～10 mm；而另外一種菌落生長繁殖速度慢，培養(yǎng)至12 h時，不能觀察到任何菌落痕跡，培養(yǎng)至48 h時，可以觀察到直徑不到1 mm的細(xì)小菌落[1]。

2.1 大腸菌群

目前，大腸菌群的能力驗證或盲樣考核多為平板計數(shù)法，對于大腸菌群的檢驗，還需要注意的是BGLB驗證的過程，標(biāo)準(zhǔn)中說明選取平板菌落數(shù)在15～150 CFU的平板，挑取典型和可疑菌落共計10個 BGLB進(jìn)行發(fā)酵驗證試驗，但是并未說明每個平板挑取10個還是兩個平板總共挑取10個。故提出這樣的建議，如果平板上菌落形態(tài)單一，則兩個平板總共挑取10個進(jìn)行驗證，若平板上菌落形態(tài)差異較大，則最好是每個平板上挑取10個菌落進(jìn)行驗證，并且對典型和可疑菌落按照比例挑取驗證，最終計算結(jié)果時，還需要分別計算典型菌落的陽性率和可疑菌落的陽性率。

2.2 霉菌和酵母菌

無論是食品還是化妝品，或者是食品包材，對于霉菌和酵母菌都是同一種培養(yǎng)基進(jìn)行同步檢驗，報告結(jié)果時就需要按照作業(yè)指導(dǎo)書的規(guī)定，兩個項目分開報兩個結(jié)果，或者兩個項目合計最終報告一個結(jié)果。在檢驗的過程中，由于霉菌生長速度較快，最好在培養(yǎng)第二天開始，每天查看平板上的菌落數(shù)并記錄，以防止個別霉菌生長太快而最終覆蓋平板影響計數(shù)結(jié)果。在觀察平板上的菌落數(shù)時，盡量不要拿動平板，以防止霉菌孢子飛散。

2.3 金黃色葡萄球菌和蠟樣芽孢桿菌

目前，對金黃色葡萄球菌和蠟樣芽孢桿菌這兩個項目的考核，多為平板計數(shù)法，檢驗方法也類似，都是平板涂布法，加入平板的樣液分別為0.3、0.3、0.4 mL。需要注意的是，涂布用的平板在制備凝固之后，最好放在超凈工作臺上，打開皿蓋，開啟風(fēng)機(jī)，吹上2～4 h，讓平板盡量干燥，加入樣液后也才能更好地吸收。

3 定性檢驗

定性檢驗過程一般分為樣品復(fù)溶、前增菌、選擇性增菌、平板分離、染色鏡檢以及生化鑒定。在樣品復(fù)溶后，取規(guī)定數(shù)量的復(fù)溶液加入增菌液中進(jìn)行增菌以及后續(xù)試驗。由于一般定性檢驗的樣品中會加入一種或者幾種與目標(biāo)菌相似的干擾菌，有的干擾菌在增菌液中生長旺盛，甚至超過目標(biāo)菌而成為增菌液中的優(yōu)勢菌，最后導(dǎo)致平板劃線不能分離到目標(biāo)菌。建議在將復(fù)溶液加入增菌液中按照標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定步驟進(jìn)行增菌及后續(xù)試驗時，用接種環(huán)從剩余的復(fù)溶液中挑取菌液，劃線于分離平板進(jìn)行培養(yǎng)，若發(fā)現(xiàn)可疑菌落，則可直接進(jìn)行后續(xù)鑒定。

3.1 平板劃線分離

平板劃線分離是定性檢驗的一個關(guān)鍵步驟，好的平板劃線操作能夠分離出足夠的單菌落，用于后續(xù)的檢驗，平板劃線不過關(guān)的話，甚至可能導(dǎo)致不能分離出單菌落，結(jié)果漏檢。因此，每位參加微生物定性檢驗的人員在需要進(jìn)行平板劃線操作時，一定要謹(jǐn)慎操作，務(wù)必保證通過劃線操作分離出足夠的單菌落。

3.2 分離用瓊脂平板

在標(biāo)準(zhǔn)規(guī)范和實(shí)驗室能力允許的條件下，盡量使用兩種或以上的選擇性瓊脂平板來劃線分離可疑菌落，以保證不漏檢。同時，最好將顯色培養(yǎng)基作為分離平板之一，雖然顯色培養(yǎng)基成本較高，但是其中含有針對目標(biāo)菌的特異性成分，因此對目標(biāo)菌均具有良好的分離效果，能夠很容易判定是否有目標(biāo)菌存在，減少檢驗員的工作量。

3.3 生化鑒定

通過平板劃線操作分離到可疑菌落時，則需要進(jìn)行鑒定。有些檢驗方法標(biāo)準(zhǔn)也規(guī)定除了傳統(tǒng)的生化鑒定外，可以使用微生物全自動生化鑒定系統(tǒng)。但是，需要注意的是，全自動生化鑒定系統(tǒng)的數(shù)據(jù)庫里的數(shù)據(jù)有限，有時候并不能識別出某種細(xì)菌，因此建議還是要以標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定的傳統(tǒng)生化鑒定為鑒定依據(jù)。在進(jìn)行傳統(tǒng)的生化鑒定時，最好先將可疑菌落接種至相應(yīng)的營養(yǎng)瓊脂或胰酪胨大豆蛋白瓊脂等非選擇性瓊脂平板上進(jìn)行純化培養(yǎng)。一方面，可以對可疑菌增殖；另一方面，因為選擇性平板一般含有選擇性抑菌成分，甚至也會對目標(biāo)菌造成傷害，受到傷害的目標(biāo)菌再拿去進(jìn)行生化鑒定，其生化特征便沒有代表性，結(jié)果可能是假陰性而導(dǎo)致漏檢，而純化培養(yǎng)可以使菌的活性與特性得到恢復(fù)，以便得到更準(zhǔn)確的生化鑒定結(jié)果。

3.4 對照菌株

在進(jìn)行考核樣品檢驗的同時，還需要準(zhǔn)備好陽性對照菌株和陰性對照菌株，以備在染色鏡檢和生化鑒定時作為對照參考。

3.5 血清學(xué)試驗

有少量的檢驗標(biāo)準(zhǔn)中將血清學(xué)鑒定試驗作為必做項目，如GB 4789.4-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗 沙門氏菌檢驗》規(guī)定對生化鑒定符合沙門氏菌特征的可疑菌還需進(jìn)行多價菌體抗原（O）和多價鞭毛抗原（H）。在進(jìn)行血清學(xué)試驗時，除了選擇質(zhì)量可靠的血清產(chǎn)品，還應(yīng)該對每批次血清產(chǎn)品進(jìn)行技術(shù)性驗收，同時使用陰性菌和陽性菌做好對照試驗。對于待測菌，也應(yīng)該選擇標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定的特定瓊脂培養(yǎng)物來進(jìn)行血清學(xué)試驗。

4 報告結(jié)果

檢驗完成后則是分析數(shù)據(jù)，報告檢驗結(jié)果。不管是定量檢驗還是定性檢驗，除了按照標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，還應(yīng)該按照能力驗證所附的結(jié)果報告單的要求報告結(jié)果。填好結(jié)果報告單后，校核人員需要仔細(xì)查看，防止錯誤出現(xiàn)。

5 結(jié)語

目前看來，現(xiàn)在能力驗證的難度越來越高，檢驗的時間也越來越少，基本上就是按照標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的一個檢驗周期再加上兩三天的時間。而這額外的兩三天時間里，前期準(zhǔn)備大概需要一兩天時間，報告結(jié)果需要一天時間。因此，需要參加能力驗證的實(shí)驗室，工作人員一定要提前備好相關(guān)設(shè)備、試劑和耗材，保證實(shí)驗室所參加的能力驗證能夠正常進(jìn)行。