環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)在百日咳鮑特菌檢測(cè)中應(yīng)用研究進(jìn)展

郄春花 綜述，吳紅章 審校

(天津市第二人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，天津 300192)

核酸擴(kuò)增技術(shù)是病原微生物檢測(cè)的重要武器，其中聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)已經(jīng)在臨床檢驗(yàn)中廣泛應(yīng)用。與PCR相比，環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增(LAMP)技術(shù)具有操作簡(jiǎn)便，快速靈敏，對(duì)儀器和樣本質(zhì)量要求低等優(yōu)點(diǎn)，尤其適合病原微生物的即時(shí)檢驗(yàn)。本文主要綜述了LAMP技術(shù)在百日咳即時(shí)檢驗(yàn)中應(yīng)用的研究進(jìn)展。

1 百日咳的流行病學(xué)

百日咳是由百日咳鮑特菌感染引起的一種嚴(yán)重急性呼吸道傳染病，人群普遍易感，其中尤以嬰幼兒多見(jiàn)，給嬰幼兒身體健康造成嚴(yán)重威脅。其臨床癥狀特征為陣發(fā)性痙攣性咳嗽，病程可遷延數(shù)月，常引起流行。家庭內(nèi)成人患者和潛在感染者是兒童百日咳的主要傳染源。人是百日咳鮑特菌的唯一宿主，由于疫苗產(chǎn)生的抗體滴度隨著年齡的增長(zhǎng)而降低，孕婦體內(nèi)的抗體傳送給胎兒很少，因此嬰兒對(duì)百日咳鮑特菌的抵抗力弱，加上未達(dá)到疫苗接種年齡，導(dǎo)致小于6個(gè)月齡的嬰兒百日咳的發(fā)病率明顯較其他年齡組高。近年來(lái)，兒童百日咳發(fā)病率逐年升高，并出現(xiàn)一些新的流行特征，已經(jīng)成為兒科臨床醫(yī)師廣泛關(guān)注的傳染性疾病。百白破聯(lián)合疫苗的使用有效降低了百日咳的發(fā)病率及病死率。盡管疫苗接種率很高，近年來(lái)在許多發(fā)達(dá)國(guó)家和發(fā)展中國(guó)家百日咳的發(fā)病率呈持續(xù)上升趨勢(shì)，在一些國(guó)家和地區(qū)甚至出現(xiàn)暴發(fā)流行，百日咳再現(xiàn)的現(xiàn)象引起了廣泛關(guān)注[1]。百日咳再現(xiàn)的主要原因是疫苗接種對(duì)年長(zhǎng)兒、青少年及成人覆蓋率不足，成人百日咳感染率增加，以致未接種疫苗或未完成全程疫苗接種的嬰幼兒發(fā)生百日咳感染[2]。自上世紀(jì)90年代以來(lái)，百日咳再現(xiàn)于疫苗覆蓋人群，產(chǎn)生這種現(xiàn)象的一部分原因是診斷技術(shù)的發(fā)展，醫(yī)生警惕性提高，人群免疫減弱和病原的選擇性。百日咳再現(xiàn)指出了建立快速、敏感、特異的實(shí)驗(yàn)室診斷方法的重要性[3]。

2 百日咳的實(shí)驗(yàn)室診斷現(xiàn)狀

目前對(duì)于百日咳的診斷主要是依靠臨床醫(yī)生對(duì)癥狀的判斷，但臨床醫(yī)生對(duì)非典型病例的認(rèn)識(shí)存在嚴(yán)重不足。 包括我國(guó)在內(nèi)，目前大多數(shù)國(guó)家和地區(qū)用于百日咳診斷的臨床標(biāo)準(zhǔn)中多數(shù)要求咳嗽時(shí)間至少在兩周以上，但是由于非典型病例的增多，部分病例會(huì)因此延誤診斷。因此，對(duì)于這些不典型的百日咳感染，尤其是青少年和成年人的隱性感染，需要結(jié)合可靠的實(shí)驗(yàn)室診斷方法來(lái)幫助確診[4]。

百日咳的主要實(shí)驗(yàn)室診斷方法包括細(xì)菌培養(yǎng)法、免疫學(xué)方法和基因檢測(cè)方法。尤其對(duì)于癥狀不典型的百日咳感染患者，實(shí)驗(yàn)室診斷方法是確診百日咳感染的重要手段。傳統(tǒng)的細(xì)菌培養(yǎng)法雖然是診斷百日咳的金標(biāo)準(zhǔn)，但是存在培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)、陽(yáng)性率低等缺點(diǎn)。本法檢測(cè)百日咳鮑特菌特異度高，但是靈敏度受到標(biāo)本運(yùn)送條件、標(biāo)本質(zhì)量、病程和抗菌藥物等多種因素限制。免疫學(xué)檢測(cè)是對(duì)病原微生物抗原抗體的檢測(cè)，容易出現(xiàn)假陽(yáng)性。其中以PCR為基礎(chǔ)的百日咳基因檢測(cè)方法的靈敏度好，陽(yáng)性率高，并且受抗菌藥物使用的影響小。但是百日咳普通PCR檢測(cè)方法還存在使用強(qiáng)烈致癌劑溴化乙錠作為染色劑、擴(kuò)增時(shí)間長(zhǎng)、依賴(lài)昂貴儀器、基層實(shí)驗(yàn)室無(wú)法開(kāi)展等一些不足。鑒于上述原因，研究新的快速、敏感、特異、便于操作的百日咳診斷技術(shù)就顯得十分必要。

3 LAMP技術(shù)概述

LAMP是一種新的核酸體外恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)[5]。LAMP技術(shù)主要通過(guò)一組特異性引物針對(duì)目的基因的6個(gè)特定區(qū)域，在恒溫?cái)U(kuò)增環(huán)境條件下(60～65 ℃)，依賴(lài)于一種具有鏈置換活性的Bst DNA聚合酶，高效率(30～60 min)地?cái)U(kuò)增目標(biāo) DNA。LAMP產(chǎn)物的檢測(cè)可根據(jù)反應(yīng)過(guò)程中產(chǎn)生的焦磷酸鎂白色沉淀，或在反應(yīng)系統(tǒng)中加入熒光染料，可以用肉眼或?qū)崟r(shí)檢測(cè)儀器判斷擴(kuò)增與否[6]。

與PCR技術(shù)相比，LAMP技術(shù)對(duì)標(biāo)本前處理要求不高。有些病原體可以用簡(jiǎn)單處理的標(biāo)本作為模板，例如甲型流感病毒LAMP檢測(cè)試劑盒對(duì)標(biāo)本處理要求是，只需把拭子標(biāo)本在核酸提取試劑中進(jìn)行簡(jiǎn)單攪拌即可完成標(biāo)本中DNA的抽取。甚至有研究顯示，省略標(biāo)本DNA提取步驟，不會(huì)影響LAMP擴(kuò)增的靈敏度[7-8]。LAMP方法不僅對(duì)核酸提取要求低，而且靈敏度高，可從極微量的標(biāo)本中擴(kuò)增出目的基因，其最低檢測(cè)限是傳統(tǒng)PCR的10～100倍[9-10]。

雖然LAMP技術(shù)是一種快速、簡(jiǎn)便的核酸擴(kuò)增方法，但該技術(shù)在結(jié)果呈現(xiàn)方面仍然表現(xiàn)出不足和缺陷。該方法在檢測(cè)過(guò)程的某些環(huán)節(jié)存在很多提升空間，LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物的可視化成為近年的研究熱點(diǎn)。LAMP-橫向流動(dòng)試紙條(LFD)技術(shù)是LAMP與LFD相結(jié)合的一種新技術(shù)，該技術(shù)將核酸恒溫?cái)U(kuò)增和可視化試紙條檢測(cè)有機(jī)地結(jié)合，使 LAMP 擴(kuò)增產(chǎn)物現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)可視化[11]。檢測(cè)過(guò)程中加入特異性探針，不僅提高了檢測(cè)的特異度，而且擺脫了對(duì)檢測(cè)儀器設(shè)備的依賴(lài)，而無(wú)需EB等有毒試劑。LFD技術(shù)結(jié)合了嚴(yán)格的堿基互補(bǔ)配對(duì)原則、抗原抗體反應(yīng)的高特異度和PCR的高靈敏度，并融合了免疫層析技術(shù)和分子生物學(xué)手段[12]。

LAMP-LFD技術(shù)在保留了LAMP優(yōu)點(diǎn)的基礎(chǔ)上，在產(chǎn)物可視化檢測(cè)方面又邁進(jìn)了一步，使檢測(cè)過(guò)程更加便捷，摒棄了昂貴儀器的依賴(lài)，大幅度降低了從核酸擴(kuò)增到結(jié)果展示過(guò)程中的儀器成本。LAMP-LFD技術(shù)在檢測(cè)的靈敏度和特異度方面具有特殊優(yōu)點(diǎn)，其作為一種終極模式在微生物的即時(shí)檢驗(yàn)方面具有無(wú)與倫比的優(yōu)勢(shì)。目前也有將LAMP-LFD技術(shù)用于麻疹病毒檢測(cè)的報(bào)道[13]。

4 LAMP在百日咳檢測(cè)中的應(yīng)用研究

自LAMP技術(shù)問(wèn)世以來(lái)，以其檢測(cè)的快速、敏感、低設(shè)備依賴(lài)性等優(yōu)點(diǎn)在微生物檢測(cè)方面得到了廣泛應(yīng)用。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，LAMP技術(shù)不斷應(yīng)用于百日咳鮑特菌基因快速檢測(cè)，這些報(bào)道大多針對(duì)百日咳基因的插入序列IS481、百日咳毒素(PT)和目的基因BP485基因等片段。

BROTONS等[14]建立了檢測(cè)百日咳鮑特菌基因的LAMP方法。該實(shí)驗(yàn)中LAMP擴(kuò)增可在12～30 min內(nèi)完成，檢測(cè)限可達(dá)2 CFU/mL，是實(shí)時(shí)PCR的2.5倍。用這個(gè)方法檢測(cè)百日咳的靈敏度為96.55%，特異度為99.46%，線性范圍為10～105CFU/mL，適合用于百日咳鮑特菌的即時(shí)檢驗(yàn)。KAMACHI等[15]建立了一種檢測(cè)百日咳鮑特菌的LAMP方法，其檢測(cè)結(jié)果與傳統(tǒng)PCR一致，且該LAMP法特異度高，與其他種屬鮑特菌無(wú)反應(yīng)。NAKAMURA等[16]用LAMP方法檢測(cè)一名出生28 d女?huà)氡茄适米雍蜌夤芪鲆褐械陌偃湛弱U特菌基因，這兩種標(biāo)本均發(fā)現(xiàn)擴(kuò)增信號(hào)。由于嬰幼兒百日咳的臨床癥狀不典型，LAMP方法對(duì)于嬰幼兒百日咳的診斷具有不可替代的優(yōu)勢(shì)。

5 展 望

綜上所述，LAMP法檢測(cè)百日咳鮑特菌核酸，準(zhǔn)確快速、操作簡(jiǎn)便、無(wú)需昂貴的實(shí)驗(yàn)設(shè)備、易于推廣使用。隨著LAMP技術(shù)不斷優(yōu)化，其在產(chǎn)物的可視化檢測(cè)方面也日趨完善。相信LAMP-LFD技術(shù)在百日咳的即時(shí)檢驗(yàn)方面將會(huì)有廣闊的應(yīng)用前景。