蠅蛆抗菌肽對小鼠金黃色葡萄球菌性乳腺炎治療效果的研究

黃春鳳 ，申紅 *，夏歡 ，張雪 ，張玉棟 ，王俊剛 ，曾獻(xiàn)存

（1石河子大學(xué)動物科技學(xué)院，新疆 石河子 832003；2石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院，新疆 石河子 832003）

乳腺炎一直是奶牛疾病研究的熱點，乳腺炎常見的致病菌為金黃色葡萄球菌和大腸桿菌，但由于抗生素長期、大量的使用，導(dǎo)致這兩個病原菌的耐藥菌株產(chǎn)生，使奶牛乳腺炎難治愈、易復(fù)發(fā)，加大了奶牛乳腺炎的治療難度，為了解決這些難題，學(xué)者們通過大量復(fù)制乳腺炎動物病理模型，對乳腺炎的致病機制和治療藥物的開發(fā)進(jìn)行研究，但是奶牛作為大型經(jīng)濟(jì)動物，使用奶牛作為動物病理模型進(jìn)行研究不僅試驗費用過高、操作困難、個體差異大且無法進(jìn)行實驗室標(biāo)準(zhǔn)化管理，很難作為乳腺炎動物病理模型進(jìn)行大量試驗。1970年，Chandler使用老鼠作為試驗動物，成功建立了金黃色葡萄球菌性小鼠乳腺炎病理模型[1]，此后小鼠乳腺炎病理模型被廣泛應(yīng)用于大腸桿菌、無乳鏈球菌和金黃色葡萄球菌等乳腺內(nèi)感染的病理生理學(xué)及致病機理的研究[2]。小鼠已經(jīng)成為國內(nèi)外很多研究的病理模型，相較于奶牛等動物，小鼠具有成本低、操作方便、個體差異小、繁殖力強、利于控制試驗條件和適合標(biāo)準(zhǔn)化管理等優(yōu)點，小鼠屬于嚙齒類動物，雖然與奶牛乳腺在形態(tài)學(xué)上存在顯著差異，但卻是乳腺發(fā)育最典型的代表[3]，因此小鼠乳腺炎病理模型適合進(jìn)行大量試驗，為研發(fā)治療奶牛乳腺感染的新藥品提供研究基礎(chǔ)。小鼠的乳腺一共有5對，其中第4對乳腺最大、最易收集和觀察，因此學(xué)者們一般選用小鼠的第四對乳腺建立小鼠乳腺炎病理模型[4]。小鼠乳腺炎病理模型建立后，通過制備病理組織切片、測定乳腺組織內(nèi)細(xì)菌數(shù)和TNF-α含量對其進(jìn)行鑒定。目前，通過建立小鼠乳腺炎模型來研究奶牛乳腺炎的發(fā)病機制、免疫機制及治療方法依然是最常用、最有效的方法。近年來，國內(nèi)外學(xué)者們應(yīng)用不同病原菌成功建立小鼠乳腺炎病理模型并取得顯著地研究成果。Xiaowei Liu等[5]應(yīng)用小鼠乳腺炎病理模型，研究抗菌肽DP7-C對乳腺炎的治療效果；Demon等[6]應(yīng)用小鼠乳腺炎病理模型評估新型抗生素AIC102827對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和鏈球菌的抗菌效果；劉萍等[7]用金黃色葡萄球菌成功誘導(dǎo)小鼠乳腺炎病理模型。

蠅蛆抗菌肽作為機體防御肽，具有非特異性的抗細(xì)菌、真菌、病毒等作用，且不破壞機體正常細(xì)胞，抑菌活性強，較低濃度即可抑制大部分細(xì)菌生長。

本試驗用金黃色葡萄球菌誘導(dǎo)蠅蛆，從蠅蛆中提取抗菌肽并測定其濃度和對金黃色葡萄球菌的抑菌活性及最小抑菌濃度，并用于治療小鼠金黃色葡萄球菌性乳腺炎，綜合分析蠅蛆抗菌肽對小鼠金黃色葡萄球性乳腺炎的治療效果，為蠅蛆抗菌肽的開發(fā)應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

金黃色葡萄球菌由石河子大學(xué)動物科技學(xué)院傳染病實驗室從某牛場患有奶牛乳房炎患牛的乳樣中分離、純化、鑒定和保存。

1.1.2 試驗動物

BALB/C雌鼠120只，雄鼠60只，購自石河子大學(xué)實驗動物中心。雌∶雄=2∶1分籠飼養(yǎng)，恒溫、恒濕條件下飼喂全價日糧，自由采食和飲水，飼養(yǎng)至雌鼠分娩。

1.1.3 主要試劑

TNF-α 檢測試劑盒（e Bioscience公司），蘇木精、曙紅、氯化鈉、酵母、瓊脂、蛋白胨、酚紅、普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（LB）和高鹽甘露醇鑒別培養(yǎng)基，由石河子大學(xué)動物科技學(xué)院生理實驗室常規(guī)配置。

1.1.4 主要儀器

ZGZ-1000A恒溫培養(yǎng)箱（上海丙林科技有限公司），組織搗碎勻漿機（海門市天龍器材試驗廠），UVmini1240分光光度計（日本島津公司），超低溫冰箱（德國Thermo公司），酶標(biāo)儀（美國BIOTEK公司），DP2-BSW多功能圖像采集系統(tǒng)（日本OLYMPUS公司）。

1.2 方法

1.2.1 金黃色葡萄球菌菌液的制備

將-80℃保存的金黃色葡萄球菌接種到LB液體培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)至對數(shù)期，取10 ml菌液8000 r/min離心5 min，棄去上清，用滅菌的生理鹽水重懸菌體，8000 r/min離心5 min，棄去上清，再以滅菌的生理鹽水重懸菌體（算出菌體的重量，每毫克菌體加入100 μL生理鹽水稀釋），混懸均勻后用平板計數(shù)法計數(shù)并計算細(xì)菌濃度，根據(jù)計數(shù)結(jié)果分別配制濃度為103CFU/50 μL的細(xì)菌懸液，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 提取蠅蛆抗菌肽

參照陸婕等[8]方法。收集經(jīng)過誘導(dǎo)處理的蠅蛆并棄去死蛆，自來水反復(fù)沖洗8~10次，無菌水沖洗3次，用0.1%高錳酸鉀溶液消毒，無菌水沖凈蛆體表面殘留高錳酸鉀溶液，無菌濾紙吸干蛆體體表水分并稱重。按蠅蛆M(mg)∶提取液V(mL)=1∶3加入現(xiàn)配的蠅蛆抗菌肽提取液，將蛆體剪碎使其與粗提液充分混合，放入高速組織勻漿機中充分搗碎，于-20℃冰箱浸提過夜。取出勻漿液解凍，高速冷凍離心機4℃、12000 r/min離心30 min，取上清液重復(fù)離心3次，取上清液并在沸水浴中攪拌加熱5 min后置于冰上迅速冷卻10 min，高速冷凍離心機4℃、12000 r離心30 min，取上清液裝入超濾離心管（截留分子量為3 kDa），濃縮液（抗菌肽粗提液）置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 蠅蛆抗菌肽粗提液濃度測定

牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液的配置：稱取100m g牛血清蛋白，溶于100 mL的蒸餾水中。

考馬斯亮藍(lán)G-250的配置：稱取100 mg考馬斯亮藍(lán) G-250，加入 90%乙醇 50 mL，85%磷酸 100 ml，用蒸餾水定容至1000 mL。

蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：取7支10 mL干凈的試管，分別加入 0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液在一次加入 1.0、0.8、0.6、0.4、0.2、0 mL的蒸餾水，最后加入5 mL的考馬斯亮藍(lán)G-250，充分混勻10 min中內(nèi)測定光密度OD595 nm并制作標(biāo)準(zhǔn)蛋白曲線。

蠅蛆抗菌肽濃度的測定：另取2支試管，加入蠅蛆抗菌肽粗提0.1 mL，加入5 mL的考馬斯亮藍(lán)G-250，充分混勻10 min中內(nèi)測定光密度OD595 nm。

1.2.4 藥敏試驗

根據(jù)美國國家臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化委員會（2004，NCCLS）標(biāo)準(zhǔn)推薦的 Kirby-Bauer法(K-B法)，使用藥敏紙片法測定蠅蛆抗菌肽的抑菌活性。分別取濃度為 1×108CFU/mL的金黃色葡萄球菌 20 μL接種于LB固體培養(yǎng)基上，無菌干燥藥敏紙片（直徑為6 mm）于抗菌肽粗提液中充分浸泡，取出藥敏片晾干后分別貼在涂有金黃色葡萄球菌的培養(yǎng)基上，每種藥敏紙片三個重復(fù)，恒溫培養(yǎng)箱中37℃ 培養(yǎng)24 h，用游標(biāo)卡尺測量抑菌圈的直徑（Φ）大小。

判定標(biāo)準(zhǔn)：Φ≤12 mm為低敏；13<Φ<14 mm為中敏；Φ≥15 mm為高敏。

1.2.5 金黃色葡萄球菌性小鼠乳腺炎模型的建立

參照王亨等[9]方法。將 120只產(chǎn)后6~98 d雌鼠隨機分為空白對照、生理鹽水治療組、蠅蛆抗菌肽治療組和抗生素（環(huán)丙沙星）治療組，每組30只?？瞻讓φ战M不做任何處理，乙醚麻醉后保定，第4對乳頭用75%的酒精進(jìn)行消毒，然后用小鑷子輕輕夾起雌鼠乳頭，用微量進(jìn)樣器從小鼠第4對乳房的乳頭旁插入，輕挑針尖平行于乳腺上方，邊退邊注射，每對乳腺分別注入50 μL含菌量為103CFU/50 μL的細(xì)菌懸液。

乳腺炎發(fā)病的臨床判斷標(biāo)準(zhǔn)：參考周曉菲等[10]評價標(biāo)準(zhǔn)，攻菌后24 h檢查小鼠的乳房腫脹程度、小鼠的精神狀態(tài)、被毛情況及活動量變化，如果小鼠出現(xiàn)精神沉郁、活動量減少、被毛雜亂，則判為發(fā)病，上述癥狀不明顯則判為不發(fā)病。

小鼠乳腺炎治愈標(biāo)準(zhǔn)：參考周曉菲等[10]治愈標(biāo)準(zhǔn)，治療7 d后，小鼠精神狀態(tài)、飲食量和飲水量恢復(fù)正常，乳腺組織中金黃色葡萄球菌數(shù)＜102/g。

1.2.6 給藥方案

小鼠金黃色葡萄球菌性乳腺炎病理模型建立成功后，抗生素治療組、生理鹽水治療組、蠅蛆抗菌肽治療組分別灌胃1 g/Kg/BW環(huán)丙沙星、1.5 g/Kg/BW生理鹽水和1.5 g/Kg/BW蠅蛆抗菌肽提取液，連續(xù)給藥7 d，每天2次，空白對照組不做任何處理。

1.2.7 臨床癥狀觀察

觀察治療后 3、5、7 d各組小鼠的精神狀態(tài)與飲食情況。

1.2.8 樣品處理

分別于治療3、5、7 d后，每組脫頸處死10只小鼠，迅速剪開腹中線，觀察乳腺及周圍組織的病理變化。分離第四對乳腺，一側(cè)乳腺組織用10%中性甲醛固定24 h，制作石蠟切片，另一側(cè)乳腺組織按1∶9（W/V）加入滅菌生理鹽水，于冰上剪碎并研磨成勻漿，取勻漿液0.1 mL涂布于高鹽甘露醇鑒別培養(yǎng)基上，37℃過夜培養(yǎng)后用平板計數(shù)法測定乳腺組織中金黃色葡萄球菌數(shù)，將剩余的勻漿液以12 000 r/min高速離心15 min，取上清液-80℃冰箱保存。ELISA檢測乳腺組織中的腫瘤壞死因子（TNF-α），具體操作按照試劑盒說明書進(jìn)行ELISA結(jié)果用Bio-RAD 550型酶標(biāo)儀測定D450 nm值。

1.3 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)統(tǒng)計結(jié)果用 SPSS 20.0軟件對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 蠅蛆抗菌肽的濃度

考馬斯亮藍(lán)法測定蠅蛆抗菌肽的濃度的結(jié)果（表1），對照組蠅蛆抗菌肽濃度為 22.23 μg/mL，經(jīng)金黃色葡萄球菌產(chǎn)生的抗菌肽的濃度為25.36 μg/mL，金黃色葡萄球菌誘導(dǎo)組蠅蛆抗菌肽濃度顯著高于對照組（ <0.05）。

表1 各組抑菌圈直徑Tab.1 Diameter of inhibition zone at different groups

2.2 蠅蛆抗菌肽的抑菌活性

K-B紙片擴散法測定蠅蛆抗菌肽的抑菌活性的結(jié)果（表1），經(jīng)金黃色葡萄球菌誘導(dǎo)產(chǎn)生的蠅蛆抗菌肽、未經(jīng)誘導(dǎo)的蠅蛆抗菌肽、抗生素（環(huán)丙沙星）對金黃色葡萄球菌均有抑制作用，金黃色葡萄球菌誘導(dǎo)組和抗生素（環(huán)丙沙星）組的抑菌圈直徑顯著大于未誘導(dǎo)組（ <0.05），抗生素組的抑菌圈直徑顯著大于金黃色葡萄球菌誘導(dǎo)組（ <0.05）。

2.3 小鼠臨床癥狀觀察

在治療過程中，空白對照組小鼠精神良好，生理鹽水治療組小鼠精神萎靡不振、眼角有大量黃色分泌物、被毛凌亂，食欲、飲水量慢慢減少并于治療第4 d食欲廢絕，于第5 d早上出現(xiàn)老鼠死亡情況，下午老鼠全部死亡；抗菌肽治療組和抗生素（環(huán)丙沙星）治療組小鼠精神狀態(tài)、飲食量、飲水量逐漸恢復(fù)。

2.4 病理組織學(xué)觀察

小鼠乳腺組織使用HE染色制作病理組織切片，結(jié)果如圖1所示。A1、A2、A3為空白對照組小鼠乳腺組織病理切片，乳腺組織結(jié)構(gòu)完整；B1、B2為生理鹽水組小鼠乳腺組織病理切片，乳腺腺泡分布不均勻，腺泡壁破裂，組織間隙有大量紅細(xì)胞和炎性細(xì)胞浸潤，乳腺結(jié)構(gòu)坍塌，模糊一片，腺泡崩解、壞死；C1、C2、C3 分別為使用蠅蛆抗菌肽治療 3、5、7d的小鼠乳腺組織病理切片，C1乳腺組織腺泡分布不均勻，腺泡壁破裂，組織間隙有大量紅細(xì)胞和炎性細(xì)胞浸潤，乳腺結(jié)構(gòu)坍塌，模糊一片，腺泡崩解、壞死，C2乳腺組織結(jié)構(gòu)破損，有炎性細(xì)胞和紅細(xì)胞浸潤，C3乳腺組織結(jié)構(gòu)比較完整，有少量炎性細(xì)胞和紅細(xì)胞浸潤；D1、D2、D3分別為使用抗生素（環(huán)丙沙星）治療 3、5、7d的小鼠乳腺組織病理切片，D1乳腺組織結(jié)構(gòu)完整，有炎性細(xì)胞和紅細(xì)胞浸潤，D2、D3乳腺組織結(jié)構(gòu)完整，有少量炎性細(xì)胞和紅細(xì)胞浸潤。

圖1 乳腺組織病理變化Fig.1 Pathological changes in breast tissue

2.5 乳腺組織中TNF-α含量的測定結(jié)果

各試驗組小鼠乳腺組織中TNF-α含量的檢測結(jié)果顯示（表2），在治療過程中，抗菌肽治療組和抗生素治療組小鼠乳腺組織中TNF-α含量呈下降趨勢，與生理鹽水治療組相比，小鼠乳腺組織中的TNF-α含量極顯著下調(diào)（ ＜0.01），但是治療結(jié)束后后，抗菌肽治療組與抗菌素治療組小鼠乳腺組織中的TNF-α含量仍顯著高于空白對照組（ ＜0.05），說明蠅蛆抗菌肽對TNF-α有一定的抑制作用。

表2 乳腺組織中TNF-α含量Tab.2 Breast tissue TNF-α content

2.6 乳腺組織中金黃色葡萄球菌含量的測定結(jié)果

蠅蛆抗菌肽治療小鼠金黃色葡萄球菌性乳腺炎的過程中，平板計數(shù)法檢測各試驗組小鼠乳腺組織中金黃色葡萄球菌數(shù)并挑取平板中的單個菌落進(jìn)行革蘭氏染色，圖2的結(jié)果證明小鼠乳腺炎是由金黃色葡萄球菌引起的，表3的結(jié)果顯示在治療過程中，生理鹽水組小鼠乳腺組織中的金黃色葡萄球菌數(shù)量呈增長趨勢，抗菌肽治療組和抗生素治療組小鼠乳腺組織中金黃色葡萄球菌數(shù)呈下降趨勢，且治療的第3、5 d小鼠乳腺組織中金黃色葡萄球菌數(shù)極顯著低于生理鹽水組（ ＜0.01），根據(jù)周曉菲等[10]治愈標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)小鼠乳腺組織中金黃色葡萄球菌數(shù)推算出各治療組的治愈率，生理鹽水治療組小鼠金黃色葡萄球菌性小鼠乳腺炎的治愈率為0，抗菌肽治療組為40%，抗生素治療組為80%。

圖2 革蘭氏染色結(jié)果Fig.2 Gram stain results

表3 乳腺組織中細(xì)菌計數(shù)結(jié)果、乳腺炎發(fā)病率及小鼠死亡情況Tab.3 Results of bacterial count，incidence of mastitis and death of mice in breast tissue

3 討論

自抗生素問世以來，抗生素被廣泛應(yīng)用于臨床治療動物疾病和作為飼料添加劑預(yù)防動物疾病，但是隨著抗生素的廣泛、大量使用，抗生素的弊端也日益增加，例如由于藥物的長期刺激，使一部分致病菌產(chǎn)生變異、產(chǎn)生耐藥菌株，“超級細(xì)菌”很大程度就是由于抗菌藥物濫用催生出來的，另外，畜產(chǎn)品中的藥物殘留人類疾病的治療，直接影響人類的健康，因此，尋找無毒副作用的抗生素替代品勢在必行。

蠅蛆抗菌肽作為抗生素的理想替代品，既具有抗生素的促生長作用和抵抗疾病的作用，同時又克服了抗生素藥物殘留和易產(chǎn)生耐藥性的缺點，是目前最具潛力及應(yīng)用前景的抗菌制劑之一。

蠅蛆抗菌肽是蠅蛆經(jīng)病原微生物誘導(dǎo)后在其體內(nèi)產(chǎn)生的小分子生物活性物質(zhì)，對大多數(shù)病原微生物都具有抑菌活性[11]，如細(xì)菌、真菌和病毒等，且這些病原菌不易對抗菌肽產(chǎn)生耐藥性，故蠅蛆抗菌肽作為新型抗菌制劑應(yīng)用于臨床方面具有極大的潛力。

本試驗使用金黃色葡萄球菌誘導(dǎo)蠅蛆產(chǎn)生抗菌肽，從蠅蛆中提取蠅蛆抗菌肽并測定測定蠅蛆抗菌肽濃度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)從經(jīng)過誘導(dǎo)的蠅蛆中提取到的蠅蛆抗菌肽的濃度 (25.36±1.91)顯著高于未經(jīng)誘導(dǎo)的蠅蛆(22.23±0.18)( ＜0.05)，這與王志濤、武玉飛等[11-12]研究結(jié)果結(jié)果一致。

通過K-B藥敏紙片法測定蠅蛆抗菌肽對金黃色葡萄球菌的抑菌活性，發(fā)現(xiàn)經(jīng)金黃色葡萄球菌誘導(dǎo)產(chǎn)生的蠅蛆抗菌肽和未誘導(dǎo)蠅蛆抗菌肽均能抑制金黃色葡萄球菌的生長，但經(jīng)金黃色葡萄球菌誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗菌肽的抑菌圈直徑(19.97±0.65)顯著大于未經(jīng)誘導(dǎo)的蠅蛆抗菌肽 (13.82±0.79)(＜0.05)，這與劉玉等[13]研究結(jié)果一致。

本試驗根據(jù)劉萍等[7]試驗操作，用小鼠作為試驗研究動物，使用微量進(jìn)樣器向小鼠的第4對乳腺注射金黃色葡萄球菌細(xì)菌懸液，成功建立了金黃色葡萄球菌性小鼠乳腺炎病理模型，模擬了奶牛乳腺炎乳腺內(nèi)細(xì)菌的生長環(huán)境，然后用蠅蛆抗菌肽替代傳統(tǒng)抗生素治療金黃色葡萄球菌性小鼠乳腺炎并進(jìn)行治療效果的評價。

在治療各試驗組小鼠第3、5和7天的過程中，抗菌肽治療組和抗生素治療組小鼠精神狀態(tài)、飲食量和飲水量逐漸恢復(fù)，從小鼠的病理組織切片中可以觀察到小鼠乳腺組織中炎性細(xì)胞和紅細(xì)胞浸潤逐漸減少。

TNF-α是調(diào)節(jié)炎癥或與炎癥反應(yīng)相關(guān)的內(nèi)源性介質(zhì)，通常在炎癥早期由受到刺激的淋巴細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞等合成、釋放，在機體的炎性應(yīng)答過程中發(fā)揮著關(guān)鍵性的作用，被認(rèn)為是炎癥反應(yīng)的主要細(xì)胞因子。TNF-α具有雙重生物學(xué)效應(yīng)，在濃度較低時，參與抵抗細(xì)菌、病毒和寄生蟲的感染，促進(jìn)組織修復(fù)及調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)，引起腫瘤細(xì)胞凋亡等；在高濃度時，過量的TNF-α在體內(nèi)的大量產(chǎn)生和釋放則會破壞機體的免疫平衡，對許多細(xì)胞都具有生物毒性作用，既可誘發(fā)細(xì)胞壞死，又可誘發(fā)細(xì)胞凋亡。為了評估蠅蛆抗菌肽的抗炎效果，本試驗檢測了小鼠乳腺組織中的TNF-α含量，結(jié)果顯示，金黃色葡萄球菌誘導(dǎo)TNF-α大量表達(dá)，此結(jié)果與王亨等[9]的研究結(jié)果一致，使用蠅蛆抗菌肽小鼠乳腺炎后，小鼠乳腺組織中的TNF-α含量極顯著降低(＜0.01)，結(jié)果證明，蠅蛆抗菌肽在治療小鼠金黃色葡萄球菌性乳腺炎時，具有明顯的抗炎作用，能夠降低乳腺炎組織中TNF-α的分泌，減輕其對組織的損傷，并使其維持在一定水平，參與防御反應(yīng)。

小鼠乳腺組織中金黃色葡萄球菌數(shù)可以反映乳腺組織的感染細(xì)菌情況，本試驗用高鹽甘露醇鑒別培養(yǎng)基檢測小鼠乳腺組織中的金黃色葡萄球菌數(shù)，發(fā)現(xiàn)蠅蛆抗菌肽可極顯著降低小鼠乳腺組織中金黃色葡萄球菌的數(shù)量（ ＜0.01）。

綜上所述，蠅蛆抗菌肽對金黃色葡萄球菌性小鼠乳腺炎具有一定的治療效果，本研究為蠅蛆抗菌肽治療奶牛乳腺炎提供一定的科學(xué)依據(jù)和理論基礎(chǔ)。