抑制NtVTC1 基因的表達(dá)延緩煙草生長(zhǎng)發(fā)育

陳麗華，李鴻彬

（石河子大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 /石河子大學(xué)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 石河子 832003）

抗壞血酸 (Ascorbic acid，AsA)也稱維生素 C(Vitamin C，VTC)，是植物中廣泛存在的一種水溶性抗氧化有機(jī)小分子。AsA參與植物的衰老調(diào)控[1，2]、細(xì)胞生長(zhǎng)和分裂[3]、激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[4]、糖代謝[5]、成花誘導(dǎo)[6]和脅迫響應(yīng)[7]等多種生理過(guò)程；此外，有研究表明AsA與棉花纖維的發(fā)育緊密相關(guān)[8]。

在植物中，L-半乳糖途徑是最主要的AsA合成途徑。GDP-甘露糖磷酸化酶 (GDP-mannose pyrophosphorylase，GMPase)也稱為 VTC1，能夠催化 D-甘露糖-1-磷酸 (D-mannose-1-P)生成GDP-D-甘露糖(GDP-D mannose)，是抗壞血酸合成中L-半乳糖途徑的第一個(gè)關(guān)鍵限速酶，在抗壞血酸合成過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。此外，NtVTC1催化的產(chǎn)物GDP-甘露糖除了用于合成AsA外，還參與細(xì)胞壁碳水化合物的合成和蛋白糖基化[9]。許多研究表明 NtVTC1基因與植物中AsA的合成密切相關(guān)并調(diào)控著植物的生長(zhǎng)發(fā)育[10-11]。將擬南芥NtVTC1 基因在番茄中過(guò)表達(dá)顯著提高植物葉片、綠色果實(shí)及成熟果實(shí)中的AsA含量[12]；將番茄中的 NtVTC1基因在煙草和馬鈴薯中過(guò)量表達(dá)，能顯著提高 的酶活及細(xì)胞內(nèi)AsA含量[13-14]。

為了進(jìn)一步研究NtVTC1基因的功能，本研究利用RNA干擾技術(shù)，以植物NtVTC1基因編碼蛋白的N端催化結(jié)構(gòu)域保守序列為參考，構(gòu)建煙草NtVTC1基因的RNAi干擾表達(dá)載體 ，并遺傳轉(zhuǎn)化煙草，通過(guò)觀察NtVTC1基因干擾表達(dá)的轉(zhuǎn)基因煙草RI的表型、AsA含量測(cè)定及抗氧化系統(tǒng)酶活性分析，進(jìn)一步研究NtVTC1基因影響植物發(fā)育的重要功能，以期為探索NtVTC1 基因在植物的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的重要作用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞、根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株GV3101為本實(shí)驗(yàn)室保存，植物表達(dá)載體pCAMBIA2300、干擾載體構(gòu)建的基本質(zhì)粒pRI221分別由石河子大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院的黃先忠教授、崔百明教授惠贈(zèng)。野生型煙草(Nicotiana tabacum)由本實(shí)驗(yàn)室保存和種植。質(zhì)粒提取試劑盒以及瓊脂糖凝膠回收試劑盒購(gòu)自天根公司；限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、DNA Marker、pMD19-T Vector及其他相關(guān)的試劑購(gòu)自寶生物公司。

1.2 方法

1.2.1 干擾載體的構(gòu)建

以植物NtVTC1 基因編碼蛋白的N端催化結(jié)構(gòu)域保守序列作為參考，以煙草NtVTC1 基因的cDNA作為模版，選擇編碼N端催化結(jié)構(gòu)域56-134氨基酸序列的168-402核酸序列為參考序列，設(shè)計(jì)包含限制性酶切位點(diǎn) Ⅰ和 Ⅰ的特異性引物NtVTC1F和NtVTC1R并進(jìn)行PCR擴(kuò)增，回收擴(kuò)增產(chǎn)物并與pMD-19T載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α，提取質(zhì)粒DNA并進(jìn)行雙酶切鑒定后送至上海生工進(jìn)行進(jìn)一步測(cè)序鑒定（表1）。

重組質(zhì)粒pMD-19T-NtVTC1經(jīng)SaiⅠ和SpeⅠ酶切后，正向連接至用相同酶切的干擾載體pRI221，再將HbaⅠ和HBOⅠ酶切過(guò)后的回收產(chǎn)物反向連接至 SaiⅠ和SpeⅠ雙酶切的干擾載體pRI221。重組質(zhì)粒經(jīng)Hind Ⅲ和 EcoRⅠ酶切后連接至同樣酶切后的植物表達(dá)載體pCAMBIA2300。通過(guò) Hind Ⅲ和 EcoRⅠ雙酶切鑒定后，將構(gòu)建成功的NtVTC1 基因RNAi干擾表達(dá)載體命名為RNAi-NtVTC1。

1.2.2 農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)化體篩選

采用凍融法將載體 轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101、葉盤(pán)法[15]轉(zhuǎn)化煙草。將遺傳轉(zhuǎn)化的煙草在含有 6-BA(2mg/L)、NAA(0.25mg/L)、Kan(100mg/L)、Cef(500mg/L)的MS培養(yǎng)基中進(jìn)行抗生素初步篩選，將通過(guò)抗生素初步篩選的轉(zhuǎn)基因煙草進(jìn)行分子鑒定和NtVTC1基因表達(dá)量檢測(cè)。

1.2.3 RI轉(zhuǎn)基因株系NtVTC1 基因的表達(dá)量檢測(cè)

RI轉(zhuǎn)基因株系材料采用Trizol方法提取煙草總RNA，參照試劑盒的操作說(shuō)明，以煙草RNA為模板反轉(zhuǎn)錄成cDNA，用反轉(zhuǎn)錄后的cDNA作為模板分別進(jìn)行RT-PCR和qRT-PCR檢測(cè)分析。

表1 本研究中使用的引物Tab.1 Primers used in this study

1.2.4 RI轉(zhuǎn)基因株系A(chǔ)sA含量測(cè)定

AsA含量測(cè)定參照Kampfenkel等[16]的方法。約0.5 g植物材料加入2 mL 6%TCA研磨成勻漿，4℃、12000 r/min離心5 min后收集上清液并立即用于AsA含量的測(cè)定。AsA測(cè)定的反應(yīng)液包括0.2 mL提取液 (6%TCA作為空白對(duì)照)、0.6 mL 0.2M PBS(pH7.4)、0.2mL ddH2O、1mL 6% TCA、0.8 mL 42% H3PO4、0.8mL4% 2，2’- 二 聯(lián) 吡 啶 和 0.4 mL 3%FeCl3?？?AsA(還原型 AsA與氧化型 DHA之和)的測(cè)定以0.2 mL 10 mM L-1 DTT和0.4 mL 0.2 M PBS (pH7.4)代替上述0.6 mL 0.2 mol/L PBS。反應(yīng)液42℃溫浴1 h后，測(cè)定525 nm吸光值。DHA（氧化型AsA）含量為總AsA含量減去未加DTT所測(cè)得還原型AsA含量的差值。每個(gè)處理重復(fù)3次，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示。

1.2.5 抗氧化系統(tǒng)酶活性測(cè)定

酶活性的測(cè)定參考Noctor等[17]的方法。酶液的提?。涸谝旱醒心?00-150 mg組織，加入約50 mg PVP，然后加入1.5 mL 0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液、1 mmol/L EDTA (pH7.5)，在解凍過(guò)程中繼續(xù)研磨，直至懸液均勻。在4℃和15000 r/min離心20 min，收集的上清液用于酶活性測(cè)定。

抗壞血酸過(guò)氧化物酶 (Ascorbate peroxidase，APX)酶活性的測(cè)定：測(cè)定的反應(yīng)體系中包括：890 μL 0.1 mM 磷酸鉀緩沖液 (1m MEDTA)、50 μL 10 mmol/L AsA、10 μL 20 mmol/L H2O2，加入 50 μL 酶液后 2 min內(nèi)290 nm處室溫記錄OD值的變化。

谷胱甘肽還原酶 (Glutathione reductase，GR)酶活性測(cè)定：測(cè)定的反應(yīng)體系為 10 μL 10 m mol/L NADPH、880μL0.1m mol/L磷酸鉀緩沖液 (1 mmol/L EDTA，PH7.5)，加入 10 μL 50 mmol/L GSSG后2-3 min內(nèi)340 nm處室溫記錄OD值的變化。

過(guò)氧化氫酶 (Catalase，CAT)酶活性的測(cè)定：測(cè)定的反應(yīng)體系為900 μL 0.1 mmol/L磷酸鉀緩沖液 (1 mmol/L EDTA，PH7.5)、20 μL 40 mmol/L H2O2，加入100 μL酶液后在加1～2 min內(nèi)240 nm處室溫記錄OD值的變化。

脫氫抗壞血酸還原酶 (Dehydroascorbate reductase，DHAR)酶活性的測(cè)定：測(cè)定的反應(yīng)體系為50 μL 4 mmol/L DHA、25 μL 100 mmol/L GSH、905 μL 0.1 mmol/L磷酸鉀緩沖液 (1 mmol/L EDTA)，加入20 μL酶液后3 min內(nèi)265 nm處室溫記錄OD值的變化。

1.2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

試驗(yàn)所獲數(shù)據(jù)為獨(dú)立3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的平均值，數(shù)據(jù)差異性檢驗(yàn)分析用 檢驗(yàn) (Student’s test)完成，圖的制作用Adobe Illustrator軟件完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 RNAi載體的構(gòu)建與煙草的遺傳轉(zhuǎn)化

從Genbank核酸數(shù)據(jù)庫(kù)中調(diào)取煙草NtVTC1 基因序列，將煙草NtVTC1 基因和植物中NtVTC1 基因編碼的氨基酸序列進(jìn)行序列比對(duì)，選擇編碼VTC1蛋白N端催化結(jié)構(gòu)域56-134保守序列的168-402核酸序列設(shè)計(jì)引物，按照?qǐng)D1所示構(gòu)建干擾表達(dá)載體。利用葉盤(pán)法將RNAi干擾表達(dá)載體遺傳轉(zhuǎn)化煙草。

圖1 RNAi-NtVTC1載體構(gòu)建示意圖Fig.1 Schematic diagram of NtVTC1 RNAi vector construction

2.2 RI轉(zhuǎn)基因煙草株系鑒定和表達(dá)量檢測(cè)

將獲得的NtVTC1 基因抑制表達(dá)的陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因煙草株系RI進(jìn)行基因表達(dá)檢測(cè)，結(jié)果如圖2所示，NtVTC1 基因的RT-PCR和qRT-PCR結(jié)果表明：與野生型煙草WT相比，轉(zhuǎn)基因株系RI中NtVTC1 基因的表達(dá)量較低，說(shuō)明構(gòu)建的NtVTC1 基因RNAi載體能夠有效干擾靶標(biāo)基因 的表達(dá)，獲得的3個(gè)轉(zhuǎn)基因株系中NtVTC1 基因的表達(dá)獲得了顯著的抑制，可以用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)分析。

圖2 RI轉(zhuǎn)基因煙草株系 表達(dá)量檢測(cè)Fig.2 RT-PCR Identifications and Relative Expression analysis of in RI transgenic lines

2.3 RI轉(zhuǎn)基因煙草株系A(chǔ)sA含量分析

為了研究NtVTC1 基因調(diào)控AsA合成的功能，進(jìn)一步測(cè)定了RI轉(zhuǎn)基因株系的AsA含量，結(jié)果顯示：與對(duì)照WT相比，不同的RI轉(zhuǎn)基因煙草株系 (RI1、RI2、RI3)中AsA含量均顯著降低，最高的降低了約60%（圖3），表明NtVTC1 基因能夠調(diào)控?zé)煵葜?AsA的合成。

圖3 RI轉(zhuǎn)基因煙草株系A(chǔ)sA含量檢測(cè)Fig.3 Measurement of AsA content of transgenic lines

2.4 RI轉(zhuǎn)基因煙草株系葉片表型觀察和長(zhǎng)度統(tǒng)計(jì)

對(duì)RI轉(zhuǎn)基因煙草株系的生長(zhǎng)表型觀察發(fā)現(xiàn)：與野生型煙草相比，RI煙草的生長(zhǎng)發(fā)育嚴(yán)重受到了抑制，苗期表現(xiàn)出生長(zhǎng)發(fā)育遲緩的表型（圖 4、圖 5），花期表現(xiàn)出開(kāi)花延遲的現(xiàn)象（圖4）。有研究報(bào)道基因與細(xì)胞伸長(zhǎng)發(fā)育密切相關(guān)，我們前期的研究也發(fā)現(xiàn)棉花NtVTC1 基因的表達(dá)與纖維的伸長(zhǎng)發(fā)育聯(lián)系緊密，因此，我們測(cè)定了煙草葉片的長(zhǎng)度，結(jié)果顯示：與野生型煙草葉片相比，RI轉(zhuǎn)基因煙草株系葉片的的長(zhǎng)度顯著變短，長(zhǎng)度僅約為WT的64%（圖5），表明 的抑制表達(dá)對(duì)顯著抑制了煙草葉片的延展發(fā)育。

圖4 RI轉(zhuǎn)基因煙花期表型分析Fig.4 Flowering phenotype analysis of RI transgenic tobacco plants

圖5 RI轉(zhuǎn)基因煙草株系葉片表型分析Fig.5 Leaf phenotype analysis of RI transgenic tobacco plant lines

2.5 RI轉(zhuǎn)基因煙草株系抗氧化系統(tǒng)酶活性分析

作為細(xì)胞內(nèi)重要的還原性物質(zhì)和抗氧化系統(tǒng)的重要分子，AsA的含量變化會(huì)影響整個(gè)抗氧化系統(tǒng)酶的變化。

對(duì)RI轉(zhuǎn)基因煙草株系進(jìn)行抗氧化系統(tǒng)的主要酶APX、GR、CAT和DHAR活性測(cè)定發(fā)現(xiàn)：與野生型煙草相比，轉(zhuǎn)基因煙草RI的抗氧化系統(tǒng)酶APX、GR、CAT和DHAR活性均表現(xiàn)出顯著的下降，其活性分別降低了約38%、35%、30%和22%。結(jié)果表明：抗氧化系統(tǒng)酶活性的降低可能是導(dǎo)致RI轉(zhuǎn)基因煙草生長(zhǎng)發(fā)育遲緩的原因之一。

圖6 RI轉(zhuǎn)基因煙草株系抗氧化系統(tǒng)酶活性分析Fig.6 Antioxidant enzyme activity analysis of RI transgenic tobacco plant lines

3 討論

VTC1是植物細(xì)胞中抗壞血酸合成L-半乳糖途徑中第一個(gè)關(guān)鍵酶，其通過(guò)催化D-甘露糖-1-P生成GDP-D-甘露糖，GDP-甘露糖是原核生物和真核生物細(xì)胞代謝的重要物質(zhì)[18]。已從土豆[19]、煙草[20]、擬南芥[21]等植物中克隆了NtVTC1 基因。本研究以煙草

基因?yàn)檠芯繉?duì)象，通過(guò)將其編碼的蛋白質(zhì)與其他植物 蛋白質(zhì)進(jìn)行比對(duì)，選擇NtVTC1 基因編碼的保守催化結(jié)構(gòu)域序列，構(gòu)建RNAi干擾表達(dá)載體圖1），并通過(guò)葉盤(pán)法轉(zhuǎn)化煙草，獲得反義表達(dá)煙草NtVTC1 基因的RI轉(zhuǎn)基因煙草株系。與野生型煙草相比，RI轉(zhuǎn)基因煙草AsA含量?jī)H達(dá)到野生型的40%（圖3），說(shuō)明NtVTC1 基因抑制表達(dá)能夠顯著降低植物細(xì)胞內(nèi)AsA的含量，NtVTC1 基因的表達(dá)直接調(diào)控著植物細(xì)胞內(nèi)AsA合成。近年來(lái)已有許多研究表明 能夠調(diào)控植物細(xì)胞內(nèi)AsA的生物合成，Keller等[22]獲得了轉(zhuǎn)反義NtVTC1 基因的馬鈴薯，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株AsA含量比對(duì)照下降；Conklin[21]等對(duì)擬南芥抗壞血酸缺陷突變體vct1的研究發(fā)現(xiàn)與野生型相比，突變體中AsA含量比野生型低30%；Badejo等[23]發(fā)現(xiàn)提高NtVTC1 基因的表達(dá)水平可以增加殷桃果實(shí)成熟過(guò)程中的AsA含量。

RNAi通過(guò)引入與內(nèi)源靶基因具有相同序列的雙鏈RNA，從而誘導(dǎo)內(nèi)源靶基因的 mRNA降解，達(dá)到抑制基因表達(dá)的目的[24]，通常選擇基因的保守序列作為干擾序列參考會(huì)達(dá)到較好的干擾效果。Lawerence等[25]使用RNAi的方法通過(guò)對(duì)擬南芥天然四倍體的研究表明，通過(guò)合理設(shè)計(jì)雙鏈RNA可以有效的同時(shí)對(duì)一個(gè)基因家族的基因表達(dá)進(jìn)行沉默。植物細(xì)胞中AsA的合成由多個(gè)基因編碼的酶催化連續(xù)的化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生，其中 是第一個(gè)關(guān)鍵限速酶，研究表明NtVTC1 基因?qū)χ参锛?xì)胞中AsA的含量起著決定性作用[26]。煙草作為異源四倍體物種，其染色體上可能存在兩個(gè)高度保守的同源NtVTC1 基因。本研究選擇煙草NtVTC1 基因，以其編碼 蛋白的N端的保守結(jié)構(gòu)域序列的核酸序列作為參考干擾序列（圖1），達(dá)到了較好的抑制基因表達(dá)效果（圖2），并進(jìn)一步研究其通過(guò)影響AsA含量調(diào)控植物發(fā)育的作用。后期可結(jié)合 CRISPR-Cas9基因定點(diǎn)敲除技術(shù)獲取該基因功能完全缺失的突變體材料，準(zhǔn)確驗(yàn)證NtVTC1 基因的功能。

RI煙草轉(zhuǎn)基因株系的生長(zhǎng)表現(xiàn)出延遲發(fā)育的表型，整個(gè)植株的生長(zhǎng)和開(kāi)花均受到顯著的抑制（圖 4、圖 5）；尤其是葉片發(fā)育顯著低于野生型，葉片長(zhǎng)度僅為野生型的64%（圖5）。有研究證明高含量的AsA促進(jìn)細(xì)胞分裂和生長(zhǎng)，Cordoba等[27]發(fā)現(xiàn)AsA通過(guò)抑制細(xì)胞壁固化和增強(qiáng)根的新陳代謝來(lái)刺激調(diào)節(jié)根系的生長(zhǎng)；黃文敏等[28]研究發(fā)現(xiàn)外源施加2mM AsA能夠促進(jìn)BY2煙草懸浮細(xì)胞分裂和生長(zhǎng)速度，說(shuō)明煙草葉片生長(zhǎng)受阻可能是由AsA含量降低引起的。RI轉(zhuǎn)基因株系中抗氧化系統(tǒng)酶的活性顯著低于野生型煙草（圖6），說(shuō)明 的抑制表達(dá)對(duì)植物抗氧化系統(tǒng)具有顯著的影響，這可能與AsA含量的降低密切相關(guān)[29]，NtVTC1 基因的表達(dá)與植物的抗氧化能力密切相關(guān)[13]，植物細(xì)胞內(nèi)高含量的AsA將有助于提高抗氧化脅迫的能力。

4 結(jié)論

VTC1是調(diào)控植物細(xì)胞內(nèi)AsA合成的關(guān)鍵酶，本研究通過(guò)構(gòu)建煙草NtVTC1 基因的煙RNAi干擾載體并遺傳轉(zhuǎn)化煙草，轉(zhuǎn)基因煙草表現(xiàn)出在植株生長(zhǎng)、葉片延展和開(kāi)花等方面的顯著延遲，并且AsA含量和抗氧化系統(tǒng)酶的表達(dá)顯著降低。本研究結(jié)果為進(jìn)一步研究NtVTC1 基因的功能及其調(diào)控植物發(fā)育分子機(jī)制解析提供了良好參考。