GSH參與低溫脅迫下外源NO對黃瓜葉綠體活性氧清除系統(tǒng)的影響

索琳格，吳佩，張文博，楊志峰，劉慧英，崔金霞*

（石河子大學農學院園藝系/特色果蔬栽培生理與種質資源利用兵團重點實驗室，新疆 石河子 832003）

黃瓜（ L.）屬于典型的喜溫性蔬菜，在保護地冬春栽培中常遭遇低溫傷害，同時由于自身耐冷性差，嚴重影響其生長發(fā)育、產量和品質[1-2]。葉綠體是最容易受低溫傷害的器官之一，低溫抑制葉綠體發(fā)育，使活性氧積累，造成明顯的植物細胞膜系統(tǒng)的破壞，從而使葉綠體功能紊亂，因此研究增強黃瓜耐低溫能力具有重要意義[3]。

一氧化氮（nitric oxide，NO）作為生物活性物質和內源信號分子，參與植物生長發(fā)育過程及脅迫響應，適宜濃度NO通過多種方式參與調節(jié)植物對逆境脅迫的應答過程[4-5]，如低溫、高溫、鹽害、干旱等[6-7]。這其中包括調控植物體內的AsA-GSH循環(huán)維持植物體內氧化還原狀態(tài)和ROS穩(wěn)態(tài)，增強其對逆境脅迫的耐性[8-9]。還原型谷胱甘肽（GSH）是一種低分子量水溶性硫醇化合物，它分布在植物的所有亞細胞或細胞器中[10-11]。GSH既參與植物生長發(fā)育的各種過程[12-13]，也是一種非生物脅迫耐受性的小分子抗氧化劑[14-15]，以多種途徑提供抗氧化防御。首先GSH可直接與O2·-、OH·和H2O2反應形成加合物清除自由基；其次GSH在谷胱甘肽過氧化物酶的作用下，把H2O2還原成水，其自身被氧化為GSSG（氧化型谷胱甘肽），GSSG 在谷胱甘肽還原酶的作用下，從NADPH 接受氫又重新被還原為GSH[16]，再者，GSH調節(jié)抗氧化酶系統(tǒng)，有助于維持ASA-GSH循環(huán)通路組分的減少，DHAR催化GSH還原DHA生成AsA[17]。此外，NO與GSH形成的GSNO調節(jié)NO水平和蛋白質巰基亞硝基化修飾影響生物體多種信號傳導和生物體防御應答，近期的研究表明GSH作為一種信號分子與其他信號分子存在交互作用，從而增強植物對逆境的適應[18]。

相關研究文獻表明低溫下外源噴施NO供體SNP（亞硝基鐵氰化鈉）通過增強GSH-AsA循環(huán)效率和相關酶活性清除ROS提高植物耐低溫能力，但植物存在多種清除ROS的途徑，NO清除ROS也存在多種信號路徑，GSH的抗氧化性能在NO增強植物的耐冷性中是否是必須的尚不明確。BSO能選擇性地抑制γ-谷氨酰半胺氨酸合成酶（γ-ECS），從而阻止了谷氨酸與半胱氨酸合成二肽，進而使GSH不能合成、NADPH合成酶抑制劑6-AN（在葉綠體中AsA-GSH循環(huán)系統(tǒng)中需利用NADPH提供的電子將H2O2還原成水，用來清除H2O2）。因此，本研究利用SNP為外源 NO供體、GSH合成酶抑制劑BSO，以黃瓜為試材，擬通過探究低溫脅迫下GSH參與外源NO對黃瓜葉綠體H2O2和O2˙-含量、抗氧化酶、還原力水平及氧化還原狀態(tài)方面的影響，以期進一步從細胞器水平揭示GSH在NO調控黃瓜葉綠體抗氧化系統(tǒng)抵抗低溫脅迫中的作用。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 試材

選用黃瓜品種津研四號。

1.1.2 主要試劑與設備

試劑：SNP（亞硝基鐵氰化鈉）、BSO（丁硫氨酸亞砜胺）、6-AN（6-氨基煙酰胺）均購自Sigma公司，草炭購自德國Floragard公司。

設備：RXZ-300C智能人工氣候箱（寧波江南儀器廠）；Percival E-36L植物培養(yǎng)箱（Percival，美國）等。

1.2 方法

1.2.1 試驗設計

篩選籽粒飽滿的黃瓜種子，55℃浸種25 min后，室溫浸泡 6 h，置于 RXZ-300c型智能人工氣候箱（寧波江南儀器廠生產）內28℃黑暗催芽24 h，選擇芽長一致種子播于72孔穴盤，混合基質采用草炭、蛭石（ ∶ =2∶1），每孔 1粒，覆混合基質厚度約 0.5-1.0 cm，待2片子葉完全展開時移入裝有混合基質的花盆 （直徑×高，120 mm×110 mm），每盆一株，250 mL Hoagland營養(yǎng)液（1倍）每隔4 d澆灌一次，待2片真葉展平，移入Percival E-36L植物培養(yǎng)箱（Percival，美國），設置環(huán)境條件為晝 25℃/14 h，夜20℃/10 h，光照強度300 μmol/（m2·s1），相對濕度60%，培養(yǎng)箱內適應2 d后進行試驗處理，如表1所示，分別在 10：00和 18：00進行以下 4個試驗處理（黃瓜幼苗葉片正反面均勻噴施以下藥物），處理 2天。

表1 不同藥劑處理時間與方法Tab.1 Treatment time of different chemicals

1.2.2 測定項目與方法

1.2.2.1 葉綠體的制備

葉綠體提取在葉濟宇[19]和Robinson[20]方法的基礎上加以改進。取出后用5倍體積的25 mmol/L HEPES緩沖液（pH 7.8）稀釋，其中包含0.2 mmol/L EDTA和2%（W/V）PVP。4℃條件下，1200× g離心20 min，上清液用于測定葉綠體內超氧陰離子自由基（O2·-）含量、過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）、抗壞血酸過氧化物酶(APX)、谷胱甘肽還原酶(GR)、脫氫抗壞血酸還原酶（DHAR）、單脫氫抗壞酸還原酶（MDHAR）活性和谷胱甘肽（GSH）、抗壞血酸(AsA)的含量；以丙酮懸浮葉綠體用于測定H2O2含量。

1.2.2.2 葉綠體被膜完整性的測定

應用希爾反應的原理測定葉綠體的完整性，葉綠體的顆粒比較大，分離和制備時一般采用差速離心技術，當細胞破碎后選擇1500×g離心力進行分布離心，可分離沉淀出葉綠體；再通過測定葉綠體的光合速率或希爾反應中的放氧情況則可以鑒定其生理活性。離體后的完整葉綠體與2，6-二氯酚靛酚（2，6-DPIP）在光下可使水光解釋放氧氣，同時2，6-DPIP由藍色被還原為無色或粉紅色，可用分光光度計測定反應前后染料吸光度的變化表示氧氣的釋放量。

1.2.2.3 各項指標測定

O2·- 含量的測定采用羥胺氧化法[21]，H2O2含量的測定根據四氯化鈦檢測法[22]的方法，GR活性測定參考 Rao等[23]的方法，POD用愈創(chuàng)木酚法[24]測定，CAT活性檢測參照 Patra等[25]方法。

APX測定按照 Nakano and and Asada（1981）[26]的方法測定，在25℃下進行反應。利用紫外可見分光光度計觀察其在290 nm下的動力學變化情況。觀察每隔30 s OD值的變化來計算酶促反應速率。

MDHAR活性的測定參照文獻 [27]中的方法，DHAR活力的測定參照文獻[28]中的方法。

GSH和 GSSG含量、AsA和 DHA含量、NADPH和NADP+含量測定按照試劑盒(南京建成，中國)的方法測定，并計算 GSH/GSSG、AsA/DHA、NADPH/NADP+比值；葉片丙二醛（MDA）含量的測定參照硫代巴比妥酸（TBA）比色法[29]。

1.2.3 數(shù)據處理

采用Excel 2013處理數(shù)據，SPSS 21軟件進行統(tǒng)計分析，用Duncan’s新復極差法進行差異顯著性檢驗（ ＜0.05），用 ORIGIN PRO 8.5軟件繪圖。

2 結果與分析

2.1 GSH參與NO對低溫脅迫下黃瓜葉片丙二醛含量的影響

由圖 1可知：低溫 24 h后，與 CK相比，水+SNP處理的黃瓜葉片MDA含量顯著降低，降低了18.9%；與水 +SNP處理相比，BSO+SNP、6AN+SNP處理MDA含量則顯著上升，分別增加了16.6%和19.4%，說明低溫下GSH參與了NO降低黃瓜葉片膜脂過氧化程度和細胞膜透性的下降。

圖1 GSH參與NO對低溫脅迫下黃瓜葉片質膜透性和丙二醛的影響Fig.1 GSH involved in the effect of nitric oxide on MDA content of cucumber seedling leaves under low temperature stress

2.2 GSH參與NO對低溫脅迫下黃瓜葉綠體H2O2和O2˙-的影響

由圖 2可知：低溫 24 h后，與 CK相比，水+SNP處理的黃瓜葉綠體中H2O2和O2·-含量顯著降低，分別降低了13.1%和22.6%；與水+SNP處理相比，BSO+SNP、6AN+SNP 處理 H2O2和 O2·-含量則顯著上升，H2O2含量分別增加了 44.9%和28.7%，O2·-含量分別增加了78.2%和67.8%，說明低溫下GSH參與了NO降低黃瓜葉綠體內活性氧的積累。

圖2 GSH參與NO對低溫脅迫下黃瓜葉綠體H2O2和O2˙-的影響Fig.2 GSH involved in the effect of nitric oxide on H2O2and O2˙-content in chloroplasts of cucumber under low temperature stress

2.3 GSH參與NO對低溫脅迫下黃瓜葉片葉綠體抗氧化酶的影響

由圖3可知：低溫脅迫下，外源水+SNP處理黃瓜葉綠體的 CAT、GR、POD、APX、MDHAR 和 DHAR明顯高于 CK，分別提高了 62.2%、48.0%、43.7%、38.5%、49.3%和 39.8%；與水 +SNP處理相比，BSO+SNP 和 6AN+SNP 處 理 下 的 CAT、GR、POD、APX、MDHAR和DHAR活性均顯著下降。這說明GSH參與了 NO增強黃瓜葉綠體 CAT、GR、POD、APX、MDHAR和DHAR的活性，可維持黃瓜葉綠體的抗氧化酶活性，從而提高活性氧清除能力。

圖3 GSH參與NO對低溫脅迫下黃瓜葉片葉綠體抗氧化酶的影響Fig.3 GSH involved in the effect of nitric oxide on antioxidase in chloroplasts of cucumber under low temperature stress

2.4 GSH參與NO對低溫脅迫下黃瓜葉綠體還原力水平和氧化還原狀態(tài)的影響

圖4 顯示：與CK相比，黃瓜幼苗葉片低溫24 h后，水 +SNP處理的 GSH、AsA、NADPH含量和GSH/GSSG、AsA/DHA、NADPH/NADP+ 比值分別提高了 22.4%、31.3%、26.8%和 18.1%、38.5%、7.2%；與水 +SNP處理相比，BSO+SNP和 6AN+SNP處理的GSH、AsA、NADPH 含 量 和 GSH/GSSG、AsA/DHA、NADPH/NADP+比值均顯著低于水+SNP處理。

GSH/GSSG、AsA/DHA 和 NADPH/NADP+是植物體內重要的3對氧化還原對，其比值的高低反映了黃瓜葉綠體內的氧化還原狀態(tài)。以上結果表明GSH參與了NO提高黃瓜葉綠體的還原力水平，同時也說明3對氧化還原對的比值與葉綠體中還原力GSH、AsA和NADPH的水平高低密切相關。

圖4 GSH參與NO對低溫脅迫下黃瓜葉綠體還原力水平和氧化還原狀態(tài)的影響Fig.4 GSH involved in the effect of nitric oxide on the reducing power and redox state in chloroplasts of cucumber under low temperature stress

3 討論

（1）在正常生長條件下，植物葉綠體活性氧的形成和清除間保持一種動態(tài)平衡，而在低溫脅迫下活性氧如超氧陰離子自由基（O2·-）、過氧化氫（H2O2）、羥自由基（OH·）及單線態(tài)氧（1O2）等大量產生打破動態(tài)平衡，導致膜系統(tǒng)受損。已有研究表明低溫脅迫下NO能夠通過提高植物光合作用，誘導抗氧化酶活性和抗氧化物質的增加清除過多的ROS，增強黃瓜的耐冷性[2，6]。GSH作為小分子非酶強抗氧化劑可直接與O2·-、OH·和H2O2反應形成加合物清除自由基，還可以通過 AsA-GSH循環(huán)、GRX(glutaredoxin)、GST(glutathione S-transferase)等酶促反應清除ROS，提高植物的抗逆性[10，30]。

本文研究結果顯示，低溫24 h后，與CK相比，水+SNP處理的黃瓜葉片中MDA含量、葉綠體中H2O2和O2·-含量顯著降低；與水 +SNP處理相比，BSO+SNP、6AN+SNP處理抑制了SNP的效果，說明低溫下GSH參與了NO降低黃瓜葉綠體內活性氧的積累，降低氧化損傷。

（2）GSH能促進葉綠體的AsA-GSH循環(huán)，使葉綠體內的 AsA含量增加，APX、MDHAR和 GR等活性相應增加，這些酶之間的協(xié)調作用，可清除體內的活性氧，維持葉綠體內較低的膜脂過氧化水平[31]。植物細胞的葉綠體、細胞質、線粒體等細胞器中都含有較高濃度的GSH。AsA、GSH和NADPH是植物氧化還原反應中重要的H+供體，其水平的高低是衡量植物還原庫力水平高低的重要指標；GSH/GSSG、AsA/DHA 和 NADPH/NADP+是植物體內維持氧化還原平衡的3對重要氧化還原對[32-33]。

本文試驗結果表明，低溫脅迫24 h后，水+SNP處理黃瓜葉綠體的 CAT、GR、POD、APX、MDHAR 和DHAR酶活性以及 GSH、AsA和 NADPH含量，GSH/GSSG、AsA/DHA及 NADPH/NADP+明顯高于CK，與水 +SNP處理相比，BSO+SNP、6AN+SNP處理削弱了SNP作用的發(fā)揮，說明GSH及其參與的AsA-GSH循環(huán)在NO增強黃瓜葉綠體抗氧化酶活性，清除ROS提高黃瓜耐冷性中充當著重要角色，同時外源NO誘導了抗氧化物質GSH、AsA的積累和還原力水平的提高，增強了黃瓜在低溫脅迫下清除ROS毒害能力及使細胞氧化還原平衡處于還原狀態(tài)，從而有效緩解低溫脅迫危害。

（3）近期研究表明GSH作為不同的生化反應的輔助因子，與激素、信號分子，氧化還原狀態(tài)的觸發(fā)的信號轉導存在相互作用[18，34]。

本文試驗結果表明，在低溫24 h后，采用GSH合成抑制劑BSO抑制GSH 合成，或者采用6-AN使GSH/GSSG氧化還原信號循環(huán)失效，都會降低NO的作用效果，表明GSH在NO的下游發(fā)揮著重要作用，但其作為信號的角色仍需進一步深入研究。

4 結論

綜上所述，在低溫脅迫下，外源NO供體SNP的施用使低溫脅迫下黃瓜葉片MDA含量、葉綠體中H2O2和O2·-的產生和積累減少，提高了黃瓜葉綠體細胞內的抗氧化酶活性，調節(jié)細胞氧化還原平衡處于還原狀態(tài)，從而有效緩解了低溫脅迫對黃瓜植株的氧化脅迫損傷，而BSO抑制GSH合成和6AN抑制GSH再生均會阻礙SNP的作用效果。因此GSH在NO增強植物耐冷性中發(fā)揮著非常重要的作用。