外源H2S影響黃瓜幼苗響應(yīng)高鹽脅迫的蛋白質(zhì)組學(xué)分析

任緒明，蔣景龍*，孫 旺，李 麗

(1 陜西理工大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院，陜西漢中 723001；2 陜西理工大學(xué) 化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，陜西漢中 723001)

土壤次生鹽漬化是指由于不合理的耕作灌溉而造成的土壤鹽漬化過(guò)程，其中設(shè)施栽培引起的土壤次生鹽漬化較為嚴(yán)重。次生鹽漬化會(huì)對(duì)植物造成各種各樣不利的影響，如滲透脅迫、氧化脅迫、營(yíng)養(yǎng)元素失衡、調(diào)控耐鹽相關(guān)基因與蛋白表達(dá)等，最終抑制植物的生長(zhǎng)[1]。硫化氫(hydrogen sulfide，H2S)是一種有毒氣體，有“臭雞蛋”氣味，易溶于水。隨著對(duì)H2S生物功能的認(rèn)識(shí)，它被認(rèn)為是繼CO、NO之后的另一種氣體信號(hào)分子[2]。研究表明，植物內(nèi)源H2S是以半胱氨酸(cysteine，Cys)為底物，由半胱氨酸脫巰基酶(cysteine desulfhydrases，CDes)催化產(chǎn)生的[3]。H2S作為內(nèi)源信號(hào)分子，能夠參與植物體內(nèi)諸多生理過(guò)程，如緩解光抑制傷害[4]、促進(jìn)植物側(cè)根的發(fā)育[5]和提高植物體對(duì)非生物脅迫的抵御能力[6]等。H2S在參與植物體對(duì)環(huán)境脅迫的適應(yīng)能力方面發(fā)揮著重大作用[7]。朱會(huì)朋等[8]發(fā)現(xiàn)H2S不僅可以通過(guò)上調(diào)楊樹根系胞質(zhì)膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)體系(H+泵和Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)體)來(lái)促進(jìn)Na+和H+逆向跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，而且H+泵可以通過(guò)抑制去極化激活的離子通道限制鹽誘導(dǎo)下K+的外流。何慶元等[9]采用不同濃度H2S供體NaHS溶液噴施在鹽溶液脅迫下的大豆植株上，表明在鹽脅迫下抗氧化酶活性降低，但在一定濃度的NaHS噴施下，能提高抗氧化性酶的活性，達(dá)到對(duì)大豆鹽脅迫的緩解作用。NaHS作為外源H2S供體之一，在溶液中會(huì)電離成Na+和HS-，而HS-是一種弱酸根離子，既會(huì)水解也會(huì)電離，在H2O分子的作用下，會(huì)水解為H2S。然而，對(duì)于H2S處理對(duì)黃瓜葉片高鹽脅迫響應(yīng)的蛋白質(zhì)組學(xué)研究未見(jiàn)報(bào)道。

蛋白質(zhì)組學(xué)是指從整體的角度分析細(xì)胞內(nèi)動(dòng)態(tài)變化的蛋白質(zhì)組成成分、表達(dá)水平與修飾狀態(tài)，了解蛋白質(zhì)之間的相互作用與聯(lián)系，揭示蛋白質(zhì)功能與細(xì)胞生命活動(dòng)的規(guī)律[10]。蛋白質(zhì)組學(xué)分析，通常將電泳技術(shù)、質(zhì)譜技術(shù)和生物信息學(xué)技術(shù)相聯(lián)進(jìn)行蛋白質(zhì)鑒定，主要有雙向凝膠電泳(2-DE)、雙向熒光差異凝膠電泳(2D-DIGE)、質(zhì)譜分析、生物信息學(xué)等研究技術(shù)，其中第二代蛋白組學(xué)技術(shù)如多維蛋白鑒別技術(shù)(MudPIT)、同位素親和標(biāo)記技術(shù)(ICATs)、同位素相對(duì)標(biāo)記與絕對(duì)定量技術(shù)(iTRAQs)、細(xì)胞培養(yǎng)條件下穩(wěn)定同位素標(biāo)記技術(shù)(SILAC)及同位素編碼的蛋白質(zhì)標(biāo)簽(ICPL)正在不斷發(fā)展[11-12]。而2-DE技術(shù)即雙向凝膠電泳技術(shù)，是將蛋白質(zhì)按等電點(diǎn)和分子量?jī)煞N不同特性結(jié)合起來(lái)進(jìn)行蛋白質(zhì)分離的技術(shù)，具有較高的分辨率和靈敏度，已成為蛋白質(zhì)特別是復(fù)雜系統(tǒng)中的蛋白質(zhì)檢測(cè)和分析的一種強(qiáng)有力的生化手段[13]。時(shí)朝等[14]利用雙向電泳技術(shù)和質(zhì)譜鑒定方法，從低溫處理后的軟獼猴桃中分離鑒定了11種蛋白質(zhì)，鑒定結(jié)果顯示，這些蛋白與光合作用、糖代謝、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、抗逆和基因調(diào)控有關(guān)。牛銀銀等[15]利用NaCl溶液模擬鹽分脅迫，對(duì)幼苗葉片蛋白進(jìn)行雙向電泳分析，檢測(cè)到差異表達(dá)蛋白點(diǎn)有61個(gè)，鑒定結(jié)果表明，小麥幼苗為了滿足對(duì)鹽的需求，可能開啟和關(guān)閉了體內(nèi)的一些相關(guān)代謝途徑。于濤等[16]對(duì)不同發(fā)育期的玉米上、中部籽粒進(jìn)行差異表達(dá)蛋白質(zhì)的分析，獲得66個(gè)蛋白表達(dá)豐度顯著差異，丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶、S-腺苷甲硫氨酸合成酶1(SAMS)的差異表達(dá)可能是導(dǎo)致粒位效應(yīng)的重要原因。

本實(shí)驗(yàn)主要以黃瓜(CucumissativusL.)栽培品種‘春夏秋王’為試材，利用基于雙向電泳的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)分析200 mmol/L NaCl脅迫和15 μmol/L NaHS(H2S供體)處理后葉片蛋白質(zhì)的差異表達(dá)規(guī)律，這些研究可能為闡明H2S在黃瓜高鹽脅迫應(yīng)答中的分子作用機(jī)制提供一定的理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

黃瓜栽培種‘春夏秋王’購(gòu)自漢中市現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技有限公司。選取籽粒飽滿、大小一致的種子，用50 ℃溫水浸泡20 min后放置于蒸餾水中吸脹3～4 h[17]。然后將種子播種于珍珠巖中，置于人工光照培養(yǎng)室中培養(yǎng)，待所有幼苗第1片真葉完全展開時(shí)，選取長(zhǎng)勢(shì)一致的幼苗分別用200 mmol/L NaCl (T組)和200 mmol/L NaCl+15 μmol/L NaHS(S組)處理7 d，以營(yíng)養(yǎng)液處理作為對(duì)照組(CK組)。選取對(duì)照及處理組的黃瓜幼苗第2片真葉液氮速凍后移至-80 ℃超低溫冰箱內(nèi)保存。每個(gè)處理3次生物學(xué)重復(fù)，用于2-DE差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究。

1.2 生長(zhǎng)指標(biāo)測(cè)定

處理7 d時(shí)，測(cè)量幼苗第2片真葉的葉長(zhǎng)(葉柄至葉尖的長(zhǎng)度)，根據(jù)龔建華等[18]的方法計(jì)算葉面積；分別取幼苗地上部和地下部，用去離子水沖洗干凈，擦干水分后，用直尺測(cè)定幼苗莖長(zhǎng)和根長(zhǎng)，再分別稱鮮重，于105 ℃殺青15 min，然后75 ℃烘至恒重，稱干重[19]。

1.3 蛋白質(zhì)提取與定量

黃瓜葉片總蛋白質(zhì)的提取參照Wu等[20]的丙酮/三氯乙酸沉淀法(TCA)，方法略有改進(jìn)。取0.5 g葉片樣品液氮中研磨成粉，樣品懸浮于1.5 mL預(yù)冷的TCA和0.07% β-巰基乙醇的丙酮溶液中，-20 ℃沉淀過(guò)夜，其間振蕩數(shù)次。離心棄上清液，加入等體積含0.07% β-巰基乙醇的冰丙酮溶液，靜置1 h，4 ℃、12 000×g離心，棄上清液；重復(fù)洗滌沉淀3～4次。直至上清液清亮，將沉淀真空干燥成粉末狀。在蛋白干粉中加入600 μL裂解液(7 mol/L尿素、2 mol/L硫脲、4% CHAPS、65 mmol/L DTT、40 mmol/L Tris-base)充分渦旋混勻，冰浴超聲促溶，4 ℃離心1 h。吸取上清液，分裝至1.5 mL Eppendorf管內(nèi)，液氮速凍后保存于-80 ℃超低溫冰箱。

1.4 雙向電泳

第一向等電聚焦(IEF)：采用長(zhǎng)度18 cm，pH 4～7的線性干膠條，取水化液(8 mol/L尿素、2 mol/L硫脲、2% CHAPS、18 mmol/L DTT、0.002%溴酚藍(lán))與蛋白提取液共350 μL(含蛋白質(zhì)約為500 μg)，充分混勻，水化過(guò)夜。取水化后的膠條放入Manifold膠條槽中，膠面向上，覆蓋適量礦物油，置于等電聚焦儀上(Ettan IPGpher 3，GE)。設(shè)置運(yùn)行參數(shù)，進(jìn)行電泳。參數(shù)如下：50 V 聚焦1 h；100 V 聚焦2 h；500 V 聚焦1 h；1 000 V聚焦2 h；2 000 V 聚焦1 h；5 000 V 聚焦1 h；10 000 V 聚焦2 h；10 000 V 聚焦65 000 Vh。第一向等電聚焦完成后，將膠條置于平衡緩沖液(6 mol/L 尿素、1.5 mol/L Tris-HCl (pH 8.8)、2% SDS、30%甘油、0.002%溴酚藍(lán))中平衡2次，每次15 min。第一次平衡在緩沖液中加入1%二硫蘇糖醇(DDT)；第二次平衡在緩沖液中加入2.5%碘乙酰胺(IAM)。平衡完畢后取出膠條輕輕潤(rùn)洗，去除多余的平衡緩沖液，準(zhǔn)備第二向電泳。

SDS-PAGE電泳：平衡結(jié)束后，將膠條轉(zhuǎn)入第二向SDS-PAGE電泳儀(Ettan DALTsix，GE)，置于分離膠上端，排除氣泡，0.5%瓊脂糖凝膠封固膠條，進(jìn)行第二向電泳。先設(shè)恒定電流15 mA電泳30 min，隨后電流增大至38 mA，直至溴酚藍(lán)遷移至凝膠底端0.5 cm處結(jié)束。電泳結(jié)束后，凝膠用超純水清洗2 min；加入考馬斯亮藍(lán)R-250染色液染色3 h；脫色液脫色2次，各45 min；強(qiáng)化液(1%冰乙酸)脫色至背景清晰。

1.5 質(zhì)譜鑒定與數(shù)據(jù)庫(kù)分析

采用SilverFast掃描儀對(duì)凝膠進(jìn)行圖像掃描，分辨率為300 dpi。采用Yang等[21]的方法，使用蛋白質(zhì)相對(duì)表達(dá)體積(%VOL)來(lái)表述每一個(gè)匹配蛋白質(zhì)在不同處理組間的表達(dá)豐度。差異蛋白質(zhì)的表達(dá)豐度分析分別以CK、T、S的凝膠作為參考膠，兩兩比較，只有蛋白質(zhì)在至少2個(gè)重復(fù)內(nèi)被發(fā)現(xiàn)才被認(rèn)為是真實(shí)的蛋白質(zhì)。本實(shí)驗(yàn)中，以表達(dá)豐度上調(diào)(出現(xiàn))或下調(diào)(消失)差異大于等于1.5倍(Fold≥1.5)，并且在統(tǒng)計(jì)學(xué)t檢驗(yàn)上P<0.05為條件，對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行篩選。差異蛋白質(zhì)用MALDI-TOF/TOF-MS/MS進(jìn)行鑒定，對(duì)蛋白檢索結(jié)果的顯著性判別標(biāo)準(zhǔn)一般認(rèn)為PMF在MS/MS檢索中Ions分?jǐn)?shù)≥60，說(shuō)明該蛋白的鑒定結(jié)果有效。

1.6 生物信息學(xué)分析

采用Blast2GO(https://www.blast2go.com/)[22]軟件對(duì)被鑒定的差異表達(dá)蛋白質(zhì)進(jìn)行GO(Gene Ontology)功能注釋。通過(guò)基因本體(GO，http://www.geneontology.org/)數(shù)據(jù)庫(kù)計(jì)算每一個(gè)GO分類(term)的差異蛋白數(shù)目，按照其生物過(guò)程(biological process，BP)、細(xì)胞組分(cellular component，CC)和分子功能(molecular function，MF)對(duì)已鑒定的蛋白質(zhì)進(jìn)行比較分析[23]。

利用在線分析工具KAAS(KEGG Automatic Annotation Server，http://www.genome.jp/tools/kaas/)對(duì)目標(biāo)蛋白質(zhì)集合進(jìn)行KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)通路注釋。首先通過(guò)比對(duì)KEGG(http://www.kegg.jp/)[24]數(shù)據(jù)庫(kù)，找到最相似的蛋白質(zhì)，將目標(biāo)蛋白質(zhì)序列進(jìn)行KO(KEGG Ortholog)歸類，并根據(jù)KO歸類自動(dòng)獲取目標(biāo)蛋白質(zhì)序列參與的通路信息。應(yīng)用MultiExperiment Viewer(MeV)軟件對(duì)已鑒定蛋白質(zhì)進(jìn)行表達(dá)量的聚類分析。

1.7 數(shù)據(jù)處理與作圖

雙向凝膠譜圖用ImageMaster 2D Platinum 7.0軟件分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用Excel 2010軟件整理，結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差，用SPSS21.0軟件進(jìn)行單因素方差分析及多重比較。應(yīng)用Graphpad Prism 5、MeV和Photoshop作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 H2S處理緩解鹽脅迫對(duì)黃瓜生長(zhǎng)的抑制

與對(duì)照組相比，在200 mmol/L NaCl溶液處理下，黃瓜幼苗出現(xiàn)了不同程度的傷害，具體表現(xiàn)為植株矮小，葉片發(fā)黃、部分還出現(xiàn)了失水萎蔫，甚至倒伏的現(xiàn)象(圖 1)。與NaCl處理組相比，用15 μmol/L NaHS溶液處理后，鹽脅迫對(duì)黃瓜生長(zhǎng)的抑制作用得到了明顯的緩解，葉片萎蔫程度降低，未出現(xiàn)倒伏等癥狀。

???Wolfgang Spohn，“From Nash to Dependency Equilibria”，in Giacomo Bonanno，Benedikt Lowe，Wiebe van der Hoek(eds．)，Logic and the Foundations of Game and Decision Theory，Springer，2010，p．135，p．140，p．141．

經(jīng)過(guò)NaCl和NaHS處理7 d后，黃瓜幼苗各項(xiàng)生長(zhǎng)指標(biāo)均呈下降趨勢(shì)(表 1)。與對(duì)照組相比，NaCl處理后，黃瓜幼苗葉面積、莖長(zhǎng)、根長(zhǎng)、地上和地下部鮮重以及地上和地下部干重分別降低了89.5%、27.9%、47.5%、66.3%、58.1%、49.7%和52.6%。與NaCl處理組相比，用NaHS處理后，黃瓜幼苗的各項(xiàng)生長(zhǎng)指標(biāo)均有所提高，但均低于對(duì)照組，其中，葉面積、莖長(zhǎng)、根長(zhǎng)、地上和地下部鮮重以及地上和地下部干重分別提高了457.9%、22.5%、61.4%、112.5%、44.4%、65.8%和22.2%。結(jié)果顯示，高鹽脅迫會(huì)抑制黃瓜幼苗的生長(zhǎng)，外源施加H2S供體NaHS可以緩解高鹽對(duì)其的傷害。

2.2 凝膠圖譜分析

對(duì)蛋白質(zhì)表達(dá)圖譜分析顯示，CK組、T處理和S處理組分別檢測(cè)到808、818和764個(gè)點(diǎn)形規(guī)則清晰、可重復(fù)的蛋白質(zhì)，分子質(zhì)量大多分布在25.0～35.0 kD (占34.6%)，等電點(diǎn)主要集中分布在pI 5～6 (占46.2%)。比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，CK/T組、T/S組和CK/S組分別有410、409和466個(gè)蛋白質(zhì)相匹配。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明，表達(dá)豐度顯著差異的(P<0.05)蛋白質(zhì)共45個(gè)，去掉表達(dá)豐度過(guò)低的蛋白質(zhì)，總共34個(gè)蛋白質(zhì)(圖 2)。

采用表達(dá)差異倍數(shù)(Fold change，R)以及統(tǒng)計(jì)學(xué)方法t檢驗(yàn)，對(duì)差異表達(dá)蛋白質(zhì)進(jìn)行篩選(Fold change≥1.5-fold或 ≤0.67-fold，P<0. 05；圖 3)。由圖3所示，CK/T組有12個(gè)蛋白質(zhì)表達(dá)上調(diào)和6個(gè)蛋白質(zhì)表達(dá)下調(diào)，T/S組有5個(gè)蛋白質(zhì)表達(dá)上調(diào)和11個(gè)蛋白質(zhì)表達(dá)下調(diào)，CK/S組有7個(gè)蛋白質(zhì)表達(dá)上調(diào)和4個(gè)蛋白質(zhì)表達(dá)下調(diào)。

2.3 差異蛋白點(diǎn)的鑒定及功能分類

將34個(gè)差異表達(dá)蛋白質(zhì)進(jìn)行MALDI-TOF/TOF-MS鑒定分析，并采用MASCOT(http://www.atrixsci-ence.com)在線檢索NCBI和 Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫(kù)。成功鑒定26個(gè)蛋白質(zhì)，另8個(gè)蛋白質(zhì)因匹配率太低而未得到鑒定(表 2)。

表1 NaHS處理對(duì)鹽脅迫下黃瓜幼苗生長(zhǎng)指標(biāo)的影響

注：表中同列不同字母表示處理間在P<0.05水平上存在顯著差異

Note: Values in each column with different letters are significantly difference among treatments atP<0.05 level

在26個(gè)成功鑒定的蛋白質(zhì)中，23個(gè)可確定生物學(xué)功能(88.46%)，3個(gè)為未知功能蛋白(11.54%)。這些蛋白質(zhì)涉及光合作用(26.92%)、蛋白質(zhì)代謝(23.08%)、能量與碳水化合物代謝(11.54%)、氨基酸生物合成(11.54%)、細(xì)胞結(jié)構(gòu)相關(guān)蛋白(7.69%)、抗氧化作用(3.85%)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(3.85%)及未知功能蛋白(11.54%)等生物學(xué)過(guò)程(圖 4)。

圖1 NaHS處理緩解鹽脅迫對(duì)黃瓜生長(zhǎng)的抑制Fig.1 NaHS treatment alleviates the inhibition of cucumber growth under salt stress

圖2 雙向電泳分析不同處理下黃瓜葉片蛋白質(zhì)表達(dá)圖譜Fig.2 Two-dimensional electrophoresis analysis of protein expression maps of cucumber leaves under different treatments

紅色點(diǎn)表示表達(dá)量上調(diào)的蛋白質(zhì)點(diǎn)；綠色點(diǎn)表示表達(dá)量下調(diào)的蛋白質(zhì)點(diǎn)。橫坐標(biāo)為差異倍數(shù)(以2為底的對(duì)數(shù)變換)， 縱坐標(biāo)為顯著性P-value值(以10為底的對(duì)數(shù)變換)圖3 火山圖分析黃瓜葉片不同處理組間差異表達(dá)的蛋白質(zhì)情況 Red points stand for up-regulated expression of protein; Green points stand for down-regulated expression of proteins. The abscissa is the difference multiple (log transformation based on 2) and the ordinate is the significant P-value (log transformation based on 10)Fig.3 Volcano maps analysis of differential expressed proteins of cucumber leaves under different treatment groups

2.4 GO注釋及KEGG通路分析

將CK組、T組與S組兩兩比較，獲得差異表達(dá)蛋白質(zhì)，并對(duì)其進(jìn)行GO注釋(圖 5)。結(jié)果顯示差異表達(dá)蛋白質(zhì)生物學(xué)過(guò)程主要涉及應(yīng)激反應(yīng)、有機(jī)物代謝過(guò)程、脅迫響應(yīng)和多細(xì)胞生物發(fā)育等。細(xì)胞組成集中分布在細(xì)胞部分和一些胞內(nèi)細(xì)胞器，也有相當(dāng)數(shù)量的蛋白質(zhì)是位于作為胞內(nèi)細(xì)胞器部分位點(diǎn)的蛋白質(zhì)或復(fù)合體。同時(shí)，還鑒定出一些與信號(hào)相關(guān)的蛋白質(zhì)。從具體的細(xì)胞功能注釋結(jié)果分析，大部分的差異蛋白發(fā)揮著蛋白質(zhì)結(jié)合與水解酶活性的分子功能。

圖4 差異表達(dá)蛋白質(zhì)功能分類Fig.4 Primary function classification of differential proteins

為了確定差異蛋白質(zhì)主要參與的生物途徑，在GO注釋的基礎(chǔ)上，對(duì)差異蛋白質(zhì)參與的代謝通路進(jìn)行進(jìn)一步的分析。KEGG通路分析結(jié)果顯示(圖6)，參與肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架調(diào)控的蛋白質(zhì)(11個(gè))和參與細(xì)胞凋亡的蛋白質(zhì)(11個(gè))最多，另分別有7個(gè)蛋白酶體相關(guān)蛋白質(zhì)和6個(gè)蛋白質(zhì)參與碳代謝。此外，還有一些蛋白質(zhì)參與丁酸代謝、半胱氨酸和蛋氨酸代謝、磷酸戊糖途徑、氨基酸生物合成等途徑，說(shuō)明NaCl脅迫下，黃瓜幼苗在適應(yīng)環(huán)境過(guò)程中會(huì)伴隨著蛋白質(zhì)的合成與降解及消耗能量。

A. 肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的調(diào)節(jié)；B. 細(xì)胞凋亡；C. 蛋白酶體；D. 碳 代謝；E. 生物體光合的碳固定；F. 丁酸代謝；G. 戊糖磷酸途徑； H. 半胱氨酸和甲硫氨酸代謝；I. 氨基酸生物合成；J. 半乳糖代謝； K. 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)加工；L. 丙酮酸代謝；M. 二羧酸代謝；N. 檸 檬酸循環(huán)(TCA循環(huán))；O. 戊糖和葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)化；P. 溶酶體； Q. 甘氨酸, 絲氨酸和蘇氨酸代謝圖6 差異表達(dá)蛋白質(zhì)KEGG通路分析 A. Regulation of actin cytoskeleton; B. Apoptosis; C. Proteasome; D. Carbon metabolism; E. Carbon fixation in photosynthetic organisms; F. Butanoate metabolism; G. Pentose phosphate pathway; H. Cysteine and methionine metabolism; I. Biosynthesis of amino acids; J. Galactose metabolism; K. Protein processing in endoplasmic reticulum; L. Pyruvate metabolism;M. Glyoxylate and dicarboxylate metabolism; N. Citrate cycle (TCA cycle); O. Pentose and glucuronate interconversions; P. Lysosome; Q. Glycine, serine and threonine metabolismFig.6 KEGG pathways analysis of differential expression proteins

圖5 差異表達(dá)蛋白的GO注釋分析Fig.5 GO annotation analysis of differential expressed proteins

2.5 差異蛋白質(zhì)層次聚類分析

將成功鑒定的差異蛋白質(zhì)根據(jù)表達(dá)豐度進(jìn)行聚類分析，使具有相似豐度變化模式的蛋白質(zhì)分在同一組中，可以得到不同處理?xiàng)l件的黃瓜葉片蛋白質(zhì)豐度變化的綜合概述。通過(guò)聚類分析，可將26個(gè)蛋白質(zhì)分為3組，Ⅰ組中包含5個(gè)蛋白質(zhì)，除葉綠體磷酸-2-脫氫-3-脫氧庚酸醛縮酶2(蛋白點(diǎn)16)外，均在對(duì)照組(CK組)中表達(dá)量最高，在NaCl組(T組)中表達(dá)量最低，而在NaHS組(S組)中表達(dá)量略低于對(duì)照組，分別參與植物的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(1個(gè))、蛋白質(zhì)代謝(1個(gè))、抗氧化作用(1個(gè))、氨基酸生物合成(1個(gè))和細(xì)胞結(jié)構(gòu)相關(guān)蛋白(1個(gè))；Ⅱ組中包含13個(gè)蛋白質(zhì)，在NaCl和NaHS處理后表達(dá)量均有升高，分別參與植物的碳水化合物及能量代謝(2個(gè))、蛋白質(zhì)代謝(5個(gè))、光合作用(2個(gè))、氨基酸生物合成(1個(gè))和未知功能蛋白質(zhì)(3個(gè))；Ⅲ組中包括8個(gè)蛋白質(zhì)，均在NaCl組(T組)表達(dá)量最高，主要參與植物光合作用(5個(gè))、碳水化合物及能量代謝(1個(gè))、氨基酸生物合成(1個(gè))和細(xì)胞結(jié)構(gòu)相關(guān)蛋白(1個(gè))(圖 7)。由此可知，鹽處理會(huì)改變一些蛋白質(zhì)的表達(dá)，NaHS處理會(huì)增強(qiáng)或減弱某些蛋白質(zhì)的表達(dá)。

3 討 論

3.1 光合作用相關(guān)蛋白

光合作用是綠色植物吸收光能，同化CO2和H2O，制造有機(jī)物質(zhì)并釋放氧氣的過(guò)程，是地球上最重要的化學(xué)反應(yīng)[25]。核酮糖-1,5-二磷酸羧化/加氧酶(ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase)是植物進(jìn)行光合作用羧化階段固定CO2的關(guān)鍵酶，廣泛存在于葉綠體中，肩負(fù)著光反應(yīng)CO2固定和暗反應(yīng)CO2釋放的雙重功能，對(duì)光合作用的效率有著非常重要的意義[26]。有研究認(rèn)為黃瓜葉片在低溫弱光下光系統(tǒng)Ⅰ鐵硫蛋白(PsaC)的抑制效應(yīng)并不引起PSⅡ損傷，而是會(huì)引起PSⅠ的失活[27]。本研究共鑒定到7種與光合作用相關(guān)的蛋白質(zhì)，包括葉綠體二磷酸核酮糖羧化酶小亞基(蛋白點(diǎn)1和12)、葉綠體磷酸核酮糖激酶(蛋白點(diǎn)5)、葉綠體亞型X2蛋白質(zhì)HHL1(蛋白點(diǎn)6)、碳酸酐酶2亞基X2(蛋白點(diǎn)11)和葉綠體莖環(huán)結(jié)合蛋白41 kD a型(蛋白點(diǎn)30和31)。其中有6個(gè)蛋白質(zhì)(蛋白點(diǎn)1、5、6、12、30和31)均上調(diào)表達(dá)，只有蛋白點(diǎn)11下調(diào)表達(dá)?？栁难h(huán)是光合作用中碳反應(yīng)的一部分，吸收的光能用于NADP+的光催化還原，建立質(zhì)子梯度驅(qū)動(dòng)ATP產(chǎn)生?？栁难h(huán)則利用能量(以ATP和NADPH的形式)將二氧化碳和水轉(zhuǎn)化為生物體使用的有機(jī)化合物[28-29]。二磷酸核酮糖羧化酶是催化1,5-二磷酸核酮糖和CO2生成二分子甘-3-磷酸甘油酸反應(yīng)的酶。在本實(shí)驗(yàn)中葉綠體二磷酸核酮糖羧化酶小亞基上調(diào)表達(dá)，表明黃瓜幼苗通過(guò)降低活性氧的積累來(lái)緩解鹽脅迫。葉綠體莖環(huán)結(jié)合蛋白41 kD a型是一種捕光復(fù)合物，在光合作用中作為光受體捕獲或釋放激發(fā)態(tài)光能，對(duì)促進(jìn)光合作用十分重要。葉綠體莖環(huán)結(jié)合蛋白41 kD a型上調(diào)表達(dá)，該蛋白可能參與了黃瓜的鹽脅迫響應(yīng)，在細(xì)胞遭受鹽脅迫時(shí)起應(yīng)激保護(hù)作用。碳酸酐酶是可逆催化CO2和H2O轉(zhuǎn)化為碳酸、質(zhì)子和碳酸氫根離子的酶，可加速無(wú)機(jī)碳的形成， 為Rubisco活性位點(diǎn)更快提供底物[30]。在本研究中碳酸酐酶2亞基X2下調(diào)表達(dá)，表明NaCl處理會(huì)引起葉片氣孔開度變小，從而造成葉肉細(xì)胞的CO2濃度下降，最終抑制了黃瓜的光合作用過(guò)程。

3.2 蛋白質(zhì)代謝相關(guān)蛋白

本研究中參與蛋白質(zhì)代謝相關(guān)的蛋白質(zhì)包括二硫鍵異構(gòu)酶片段(蛋白點(diǎn)2)、26S蛋白酶體調(diào)節(jié)亞基同源物6B(蛋白點(diǎn)4)、擬定線粒體3-羥基異丁酸脫氫酶1類似蛋白(蛋白點(diǎn)10)、葉綠體ATP結(jié)合亞基clp A同源物CD4B(蛋白點(diǎn)14)、延伸因子Ts(蛋白點(diǎn)20)、蛋白酶體α亞基6型(蛋白點(diǎn)28)。其中，二硫鍵異構(gòu)酶是一種氧化還原酶，催化蛋白質(zhì)二硫鍵的形成，并充當(dāng)分子伴侶，也參與了蛋白質(zhì)的折疊，幫助新生蛋白質(zhì)正確折疊[31]。本研究鑒定的二硫鍵異構(gòu)酶片段(蛋白點(diǎn)2)受鹽脅迫的影響而上調(diào)表達(dá)，表明鹽脅迫下，黃瓜幼苗通過(guò)增強(qiáng)蛋白質(zhì)的代謝能力，來(lái)抵御鹽脅迫下可能受到的傷害。延伸因子Ts(蛋白點(diǎn)20)是在mRNA翻譯時(shí)促進(jìn)多肽鏈延伸的蛋白質(zhì)因子。在NaHS處理下，其表達(dá)量上升，可能是黃瓜幼苗通過(guò)增強(qiáng)蛋白質(zhì)的翻譯能力，來(lái)抵御環(huán)境脅迫帶來(lái)的不利影響。

3.3 能量及碳水化合物代謝相關(guān)蛋白

已有研究表明植物受到鹽脅迫后，一些基礎(chǔ)代謝，如能量代謝受到影響，通過(guò)建立一個(gè)新的平衡以抵抗外界環(huán)境[32]。植物能量代謝主要包括呼吸底物降解、呼吸鏈的運(yùn)轉(zhuǎn)和氧化磷酸化3個(gè)過(guò)程，其中呼吸底物的降解包括糖酵解、三羧酸循環(huán)、無(wú)氧呼吸、磷酸戊糖途徑等多條途徑[33]。本研究中鑒定出與能量及碳水化合物代謝相關(guān)的蛋白質(zhì) 3個(gè)，即線粒體琥珀酸脫氫酶亞基5(蛋白點(diǎn)3)、成膜體定向驅(qū)動(dòng)蛋白2(蛋白點(diǎn)26) 、假定葡萄糖-6-磷酸-1-差向異構(gòu)酶(蛋白點(diǎn)27)。有研究表明，對(duì)擬南芥鹽脅迫處理后取其根部，進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)研究，發(fā)現(xiàn)果糖-1,6-二磷酸醛縮酶的蛋白含量明顯增加[34]。鹽脅迫下，植物可通過(guò)增加碳水化合物的合成代謝來(lái)緩解鹽脅迫，這些過(guò)程需要消耗大量的能量。在鑒定出的蛋白點(diǎn)26和27合成均增加，從蛋白水平表現(xiàn)為上調(diào)，該類蛋白質(zhì)在黃瓜響應(yīng)鹽脅迫過(guò)程中具有調(diào)控作用。琥珀酸脫氫酶(succinate dehydrogenase, SDH)是一種酶復(fù)合物，能夠同時(shí)參與檸檬酸循環(huán)和電子傳遞鏈的酶，存在于許多細(xì)菌細(xì)胞和真核生物的線粒體內(nèi)膜中[35]。在檸檬酸循環(huán)的步驟中，SDH催化琥珀酸鹽氧化成富馬酸鹽，同時(shí)將泛醌還原成泛醇。在三羧酸循環(huán)途徑中，其是碳水化合物代謝的一部分。本研究中，琥珀酸脫氫酶亞基5合成降低，表明NaCl處理后，影響了黃瓜幼苗的碳水化合物代謝過(guò)程，最終表現(xiàn)為植株生長(zhǎng)受到抑制。

3.4 氨基酸生物合成相關(guān)蛋白

組成蛋白質(zhì)的大部分氨基酸是以埃姆登-邁耶霍夫(Embden-Meyerhof)途徑與檸檬酸循環(huán)的中間物為碳鏈骨架生物合成的。本研究中有3個(gè)蛋白質(zhì)被鑒定與氨基酸生物合成有關(guān)，包括開環(huán)異落葉松脂素脫氫酶類似蛋白(蛋白點(diǎn)7)、乙酰鳥氨酸脫乙?；割愃频鞍?蛋白點(diǎn)15)和葉綠體磷酸-2-脫氫-3-脫氧庚酸醛縮酶2(蛋白點(diǎn)16)。沈云等[36]研究表明，開環(huán)異落葉松脂素脫氫酶(secoisolariciresinol dehydrogenase, SDH)是鬼臼毒素生物合成途徑中的一個(gè)關(guān)鍵酶，它能夠特異性的催化反式構(gòu)型的開環(huán)異落葉松脂素氧化脫氫生成相同構(gòu)型的馬臺(tái)樹脂醇，從而進(jìn)行下一步的生物合成。該研究中蛋白點(diǎn)7表達(dá)上調(diào)，表明鹽脅迫下，黃瓜幼苗會(huì)提升脫氫酶相關(guān)蛋白質(zhì)的表達(dá)，以降低高鹽的傷害。乙酰鳥氨酸脫乙酰酶屬于水解酶家族，其作用于除肽鍵之外的碳-氮鍵，特別是線性酰胺中的碳-氮鍵。該酶類的系統(tǒng)名稱是N(2)-乙?；?L-鳥氨酸酰胺水解酶，參與尿素循環(huán)和氨基代謝。該蛋白質(zhì)參與N(2)-乙?；?合成L-鳥氨酸的亞途徑，其本身是氨基酸生物合成的一部分。本研究中，乙酰鳥氨酸脫乙?；割愃频鞍?蛋白點(diǎn)15)表達(dá)下調(diào)，導(dǎo)致鳥氨酸合成降低，作為尿素循環(huán)的一部分，其在代謝上具有重要的作用。磷酸-2-脫氫-3-脫氧庚酸醛縮酶2(蛋白點(diǎn)16)是由D-赤蘚糖-4-磷酸和磷酸烯醇丙酮酸合成的分支酸，是色氨酸活性調(diào)節(jié)物(滯后因子)，其本身是代謝中間體生物合成的一部分。色氨酸是植物體內(nèi)生長(zhǎng)素生物合成重要的前體物質(zhì)，在高等植物中普遍存在。該蛋白作為氨基酸代謝中參與次級(jí)代謝的蛋白質(zhì)，對(duì)研究H2S緩解鹽脅迫具有重要意義。

3.5 細(xì)胞結(jié)構(gòu)相關(guān)蛋白

本研究鑒定到2種與細(xì)胞結(jié)構(gòu)相關(guān)的蛋白質(zhì)，包括多聚半乳糖醛酸酶類似蛋白(蛋白點(diǎn)8)和肌動(dòng)蛋白類似蛋白(蛋白點(diǎn)18)。多聚半乳糖醛酸酶(polygalacturonase，PG)作為一種重要的細(xì)胞壁降解酶，參與植物生長(zhǎng)發(fā)育的多個(gè)生理過(guò)程，如器官的脫落、種子發(fā)育、莢果裂開、果實(shí)的成熟軟化和幼苗下胚軸伸長(zhǎng)等[37]。肌動(dòng)蛋白是細(xì)胞的一種重要骨架蛋白，在細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、細(xì)胞分裂、基因表達(dá)和信息傳遞、能量轉(zhuǎn)換以及維持細(xì)胞形態(tài)等方面都具有重要作用[38]。在高鹽脅迫期間，蛋白點(diǎn)8和18的大量表達(dá)，對(duì)于細(xì)胞快速分裂，維持細(xì)胞形態(tài)以及運(yùn)動(dòng)等生命活動(dòng)可能起到重要作用。

3.6 抗氧化作用相關(guān)蛋白

在逆境脅迫下，植物體會(huì)產(chǎn)生一些有害的化學(xué)物質(zhì)，導(dǎo)致自身受損，自由基、活性氧是最常見(jiàn)的逆境有害物質(zhì)?；钚匝醯男再|(zhì)極其活潑，能夠與一切植物體內(nèi)的生物大分子反應(yīng)，從而破壞其活性構(gòu)象，擾亂細(xì)胞正常代謝。但細(xì)胞中也存在著超氧化物歧化酶、過(guò)氧化物酶、過(guò)氧化氫酶等保護(hù)酶，可在干旱脅迫下清除活性氧，維持代謝平衡，保護(hù)膜結(jié)構(gòu)[39]。相關(guān)研究表明，提高植物體內(nèi)抗氧化酶類代謝的水平是增強(qiáng)植物抗逆性的途徑之一[40]。本研究鑒定的過(guò)氧化物酶(Cu2+)片段(蛋白點(diǎn)19)蛋白質(zhì)在高鹽脅迫條件下的表達(dá)量增加，對(duì)提高植物的抗逆性具有重要意義。

3.7 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)蛋白

黃瓜通過(guò)信號(hào)感受器官感受外界的高鹽刺激，然后把信號(hào)傳遞到細(xì)胞核內(nèi)，從而關(guān)閉或啟動(dòng)一些相關(guān)基因表達(dá)以達(dá)到抵御脅迫的目的。在植物中，G蛋白是活細(xì)胞內(nèi)一類具有重要生理調(diào)節(jié)功能的蛋白質(zhì)，它參與調(diào)控氣孔運(yùn)動(dòng)[41]和植物光信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[42]等多種跨膜信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)。本研究發(fā)現(xiàn)了1種與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的蛋白質(zhì)—鳥嘌呤核苷酸結(jié)合蛋白α-1型亞基(蛋白點(diǎn)21)，是一種G蛋白衍生物。它與細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞周期有關(guān)，對(duì)促進(jìn)細(xì)胞分裂增殖也起著重要的作用。

本研究采用丙酮/TCA沉淀法提取黃瓜葉片的總蛋白質(zhì)，分辨率較高且蛋白分離效果好，可以滿足2-DE的條件。利用MALDI-TOF/TOF-MS進(jìn)行質(zhì)譜鑒定，其中26個(gè)蛋白質(zhì)成功鑒定，8個(gè)蛋白質(zhì)因匹配率太低而未得到鑒定，23個(gè)蛋白質(zhì)可確定其生物學(xué)功能。從表中可以看出，蛋白點(diǎn)1和12都為葉綠體二磷酸核酮糖羧化酶小亞基，蛋白點(diǎn)30和31都被鑒定為葉綠體莖環(huán)結(jié)合蛋白41 kD a型，這些蛋白質(zhì)在膠上的分布位置不同，但分別被鑒定為相同蛋白，有的分子量相近或等電點(diǎn)相近，可能是同一個(gè)家族蛋白的不同形式，也可能與蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄翻譯后存在修飾有關(guān)，如蛋白酶降解、糖基化和磷酸化修飾等結(jié)果造成的。

植物在鹽脅迫下蛋白質(zhì)的表達(dá)會(huì)發(fā)生變化，利用質(zhì)譜鑒定技術(shù)和數(shù)據(jù)庫(kù)檢索可以對(duì)這些蛋白質(zhì)可能的功能以及與植物抗鹽性的關(guān)系進(jìn)行預(yù)測(cè)。本研究中，經(jīng)NaCl處理后，與光合作用相關(guān)(蛋白點(diǎn)1、5、6、12)、蛋白質(zhì)代謝相關(guān)(蛋白點(diǎn)2、4、10)及氨基酸生物合成(蛋白點(diǎn)7)相關(guān)的蛋白質(zhì)表達(dá)均上調(diào)，表明黃瓜幼苗會(huì)提高一些蛋白質(zhì)的表達(dá)以抵御鹽脅迫帶來(lái)的傷害。與對(duì)照組相比，施加NaHS(H2S供體)后，與光合作用相關(guān)(蛋白點(diǎn)30、31)、能量及碳水化合物相關(guān)(蛋白點(diǎn)26、27)的蛋白質(zhì)也表達(dá)上調(diào)，結(jié)果與形態(tài)測(cè)定相一致，黃瓜幼苗通過(guò)增加光合與能量代謝來(lái)緩解鹽脅迫。下一步將在鞏固黃瓜幼苗葉片雙向電泳體系和圖像分析技術(shù)的基礎(chǔ)上，建立針對(duì)凝膠蛋白質(zhì)進(jìn)行質(zhì)譜分析的制樣方法，進(jìn)一步對(duì)差異蛋白質(zhì)進(jìn)行質(zhì)譜分析和同源蛋白鑒定，探索NaHS處理后對(duì)鹽脅迫下黃瓜幼苗蛋白質(zhì)表達(dá)的影響機(jī)制，為進(jìn)一步的功能研究以及基因的表達(dá)奠定基礎(chǔ)。