丹參線粒體和葉綠體微衛(wèi)星標記開發(fā)及多樣性分析

沙秀芬，彭 芳，陶 珊，吳 宇，劉繼明，張 超，李 群*

(1 四川師范大學 生命科學學院，成都 610101；2 四川省農(nóng)業(yè)科學院 經(jīng)濟作物育種栽培研究所，成都 610300；3 國家中藥材產(chǎn)業(yè)技術體系成都試驗站,成都 610300；4 彭州市農(nóng)林局，成都 611942)

丹參(Salviamiltiorrhiza)屬唇形科鼠尾草屬植物，主要產(chǎn)于河北、四川、山西、陜西、山東、河南等地，其根和根莖可入藥，具有活血祛瘀，涼血消癰，養(yǎng)血安神等效用，為婦科用藥，主治子宮出血、月經(jīng)不調(diào)、血瘀、腹痛、經(jīng)痛、經(jīng)閉、廟痛，屬于中國傳統(tǒng)大宗中藥材。目前以丹參為主的復方丹參注射液、復方丹參滴丸、復方丹參片等多種復方制劑，被臨床上廣泛用于冠心病、心絞痛、心肌梗塞和心腦血管系統(tǒng)疾病[1]的治療。同時，丹參還具有抗腫瘤[2-3]、抗菌抗炎[4]、保護器官[5]等作用，是臨床應用最廣泛的藥材之一。

近年來，不少學者運用不同的分子標記方法對丹參主要產(chǎn)區(qū)的種質(zhì)資源進行了遺傳多樣性研究，結果表明不同產(chǎn)地的丹參個體遺傳多樣性豐富，但各地遺傳特性不一致。郭寶林等[6]運用RAPD分子標記對中國主產(chǎn)區(qū)的9個丹參居群樣本進行遺傳多樣性研究，結果顯示，丹參居群內(nèi)具有豐富的遺傳多樣性且不同地區(qū)間存在差異；宋振巧等[7]利用EST-SSR分子標記對4個產(chǎn)地的80個丹參種質(zhì)資源進行了多樣性水平分析和聚類分析，證明EST-SSR可有效檢測丹參的遺傳多樣性，但其遺傳距離與地理位置未達顯著相關性；Zhang等[8]利用ISSR標記分析了不同形態(tài)丹參種質(zhì)的遺傳多樣性，結果顯示不同形態(tài)丹參材料間存在較高的遺傳多樣性。相對于以上的標記，SSR(simple sequence repeat)標記是由1～6 bp核苷酸為重復單位組成的串聯(lián)重復序列，因具有共顯性遺傳、多態(tài)性信息含量豐富、物種間轉移性好、可重復性好和操作性簡便等優(yōu)點，已被廣泛應用于遺傳多樣性的研究，王海等[9]采用丹參葉綠體基因的SSR分子標記分析了全國31個不同丹參居群的遺傳特性，認為丹參的遺傳變異以種群間為主導，丹參種質(zhì)間存在廣泛的基因交流，并建議保護道地產(chǎn)區(qū)的種質(zhì)特性。但是，目前已開發(fā)的適用于丹參葉綠體和線粒體基因組的SSR標記較少。因此本研究利用丹參葉綠體和線粒體基因組開發(fā)SSR標記，并對61份丹參進行遺傳多樣性和近緣物種通用性分析。

1 材料和方法

1.1 材 料

所有試驗材料均種植于四川省農(nóng)業(yè)科學院經(jīng)濟作物育種栽培研究所(表1)。每個材料取1～2片幼嫩葉片，冷凍于-80 ℃冰箱中備用。然后，下載唇形科全部的葉綠體、線粒體基因組序列(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/browse/?report=5#!/organelles/Labiatae)，用于電子PCR(Electronic PCR，e-PCR)生物信息學跨物種分析。

1.2 方 法

1.2.1基因組DNA的提取參照文獻[10]的CTAB方法并稍加修改(65 ℃水浴45 min；加150 μL ddH2O溶DNA)提取DNA。提取的DNA用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的濃度，將合格的DNA樣品稀釋至50 ng/μL用于SSR反應。

1.2.2SSR位點的搜索及引物設計使用MISA軟件(http：//pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/misa.html)搜索SSR位點。設置搜索參數(shù)用于檢測單核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸SSR基序，分別至少重復10、6、5、5、5和5次。使用Primer3軟件對SSR位點進行引物設計?；谝韵聟?shù)設計引物組：GC含量40%～60%，Tm 50～60 ℃，引物長度20～24 bp，預期擴增產(chǎn)物長度100～250 bp。所有引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2.3SSR引物的篩選為篩選出擴增效率好的cpSSR、mtSSR引物，選擇10個DNA樣品，用設計的SSR引物進行PCR擴增，PCR反應體系為20 μL(Mix 10 μL，引物2 μL，ddH2O 6 μL，模板DNA 2 μL)。反應程序設置：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，34個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR擴增產(chǎn)物用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測。

1.2.4SSR標記的驗證篩選出多態(tài)性好的引物用61份丹參樣品進行PCR擴增，PCR擴增產(chǎn)物用毛細管電泳進行檢測。PCR反應體系為20 μL(DNA模板2 μL、引物2 μL(稀釋400倍)、dNTP 2 μL(稀釋4倍)、ddH2O 12 μL、Buffer 2 μL、Taq酶0.2 μL)。反應程序為：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，34個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

1.2.5數(shù)據(jù)分析毛細管凝膠電泳圖結果有條帶記為1，無條帶記為0。利用NTSYS-pc2.1軟件進行UPGMA聚類構建樹形圖。利用POPGENE1.31軟件計算等位基因數(shù)(Na)、有效等位基因數(shù)(Ne)、Shannon’s信息指數(shù)(I)、觀察雜合度(Ho)和期望雜合度(He)等多樣性指標。用PIC_CALC軟件分析多態(tài)性含量(PIC)。利用e-PCR進行SSR的跨物種性分析。

2 結果與分析

2.1 丹參cpSSR和mtSSR重復基元特征分析

使用MISA軟件搜索丹參線粒體、葉綠體基因組序列的SSR位點，共獲得32個cpSSR位點，24個mtSSR位點，不同核苷酸重復基元的SSR數(shù)量間存在明顯差異(表2)。其中，單核苷酸重復基元A/T的mtSSR位點共17個，占mtSSR位點總數(shù)的70.8%；二核苷酸重復基元(AG/CT、AT/AT)和三核苷酸重復基元(AAG/CTT、AAT/ATT)，分別占mtSSR位點總數(shù)的12.5%和16.7%。而cpSSR位點的單核苷酸重復基元A/T，占cpSSR位點總數(shù)的96.9%，二核苷酸重復基元AT/AT，占mtSSR總數(shù)的3.1%。沒有篩選出全部由G/C堿基構成的SSR位點。

2.2 引物的篩選

為了初步篩選出SSR引物，用56對引物在10個DNA樣品中進行擴增，結果(圖1)顯示，34對引物能在7個以上的樣品中成功擴增出條帶，具有較高的穩(wěn)定性和多態(tài)性，能夠用于SSR標記的驗證。將篩選出的34對引物對61份丹參樣品進行PCR擴增，PCR產(chǎn)物用毛細管電泳檢測篩選出23對擴增效果好、位點數(shù)量適中的cpSSR和mtSSR引物，進一步用于丹參遺傳多樣性分析，結果(表3)發(fā)現(xiàn)，其中19個SSR位點出現(xiàn)在丹參葉綠體基因組和線粒體基因組的非編碼區(qū)UTR區(qū)域，4個SSR位點出現(xiàn)在CDS編碼區(qū)，分別是引物cp21p、cp26p、mt4p和mt21p。

2.3 丹參遺傳多樣性分析

2.3.1SSR標記多態(tài)性分析用篩選的23對引物對61個樣本進行PCR擴增，共檢測到23個位點，均為多態(tài)性位點，多態(tài)百分比率為100%(表4)。每一對引物檢測到觀察等位基因數(shù)為2，有效等位基因數(shù)范圍為1.103～1.987，平均值為1.566。引物cp25p最多，為1.987，其次是引物mt6p和cp5p，有效等位基因數(shù)均為1.913，引物mt9p有效等位基因數(shù)最少，為1.103。

在群體遺傳多樣性分析中(表4)，觀測雜合度(Ho)在0.499～0.906之間，平均為0.654，引物mt9p最高，cp25p最低；期望雜合度(He)在0.094～0.501之間，平均為0.346，引物cp25p最高，mt9p最低；Shannon’s指數(shù)(I)為0.196～0.690，平均為0.519，引物cp25p最高，mt9p最低。標記的多態(tài)信息含量(PIC)介于0.089～0.373，平均為0.278。其中0.250

表2 丹參中不同SSR重復基序的量

M. DNA markerⅠ；10份材料編號同表1圖1 引物cp25p、cp29p、cp30p對10份材料的擴增結果M. DNA markerⅠ; The 10 variety codes were the same as in Table 1Fig.1 Amplification effect of primer cp25p, cp29p, cp30p on 10 materials

引物名稱Primer name 重復基序Repeat motif引物序列Primer sequence (5'→3')退火溫度Tm/℃擴增產(chǎn)物長度Amplification product length/bp基因組中位置Genomic locationcp1p(A)10F:TAGCCGCACTTAAAAGCCGAR:TCCATTCATTTTTCTGTTTCGAATTCA56.952.5232(trnK-UUU)-rps16基因間區(qū) Intergeniccp2p(A)11F:AATGATCCGGGGCGTAATCCR:CCCTCTCTTTCCGTTTCCGT57.757.3213atpA-atpF基因間區(qū) Intergeniccp5p(A)10(A)15F:GGCTCTCACGCTCAATTCCTR:CGGCGACCTATGCCTTATGT57.757.5243(trnG-UCC)-(trnfM-CAU)基因間區(qū) Intergeniccp8p(T)11F:CGGTGGTATCAAAACGCCACR:TTCATTCCCGAGGAAGTGCA57.156.5234rps4-(trnT-UGU)基因間區(qū) Intergeniccp10p(A)11F:ACCTTTGCGTCTTCCTTGGAR:CAGTCCCGACGGATCCAATA56.756.7240psbM-(trnD-GUC)基因間區(qū) Intergeniccp11p(A)15F:GGAGAAGATGCGGGTTCGATR:CCTTGAGGTCACGGGTTCAA57.557.6247rps8-rpl14基因間區(qū) Intergeniccp21p(T)13F:ATTTGACCTCGTATCCGGCGR:CCCTCGGTTGATCTTGGTTGA57.757.3122rpoC2cp25p(T)10F:GTCAAATACATGAATGAAGGAAAAGGAR:CGTTAGCCCATACTGCTCCA52.757.2181rps4-(trnT-UGU)基因間區(qū) Intergeniccp26p(T)10F:GACTTTGATTCGCGGCACTCR:CGTTTCCAAAGAGGTTCGTTGT57.155.6118clpPcp30p(T)11F:AATCAAGCCACGACCCTCACR:CGGTTACCGGTCTCAATAATTGA57.954.4209ndhG-ndhI基因間區(qū) Intergenicmt2p(A)11F:AAAGCCCCGCACCTCATTAAR:CTGGCTGGGAGCTGTATGAG57.158.2161orf117a-mttB基因間區(qū) Intergenicmt4p(A)10F:TCCTTCCACCGGCCCTTATAR:TCAACGGTTCTTCGGCCTAC58.157.5227orf154amt6p(T)10F:GCAGCACACCAGACGAAAAGR:GTTCAGGAGCTCCTTGCGTA57.357.3242orf137-(trnQ-UUG)基因間區(qū) Intergenicmt7p(A)10F:CCGAATGAATATCCCGCGGAR:CCGCCTTTTTGCCAACATCA57.656.8194atp4-(trnI-CAU)基因間區(qū) Intergenicmt9p(T)11(A)11F:GAACGGTCGGTAGCTGCTTAR:CTCGTAGTACCTGCTAGCGC57.358.0142orf117a-mttB基因間區(qū) Intergenicmt11p(T)10F:GCCCTTCAACCACCTCATCTR:TCTATCGAGACATTGCGGGC57.657.5238orf182b-orf119a基因間區(qū) Intergenicmt12p(TA)6F:GCGTTGGTACCACGCTCTATR:AGCTATACCACCAGTCTGTTTTCT57.655.2237orf154amt13p(TA)7F:GAAAGGGCCGCTTGCTTAAAR: GGAAAGAGGAGGCCTTTGCT56.357.8192ccmC-rpl2基因間區(qū) Intergenicmt14p(TTC)5F:GCGTTGTTGGGTGGAATTCCR:TCCAAACCTCCTCTTCCCCA57.558.3177orf99c-orf139基因間區(qū) Intergenicmt16p(A)10F:TCTAACCGATCCGCCCAGTAR:ACGATCCTGTCTCAGAGGCT57.957.9243atp6-orf103a基因間區(qū) Intergenicmt19p(A)10F:CAGAGCGAGTCGAAGTGTGTR:CGTAACTGAGCGGTGGACTT57.457.5216orf103b-orf108b基因間區(qū) Intergenicmt21p(A)10F:GAAGAGTGCACGTCCGAAGAR:ACCTACGTCATTCGACTCGC57.457.2232orf105-nad7基因間區(qū) Intergenicmt22p(T)11F:CGGACCCTCGATTCGATTGTR:GCTGCAAGACCAAAACAGGG57.457.5121ccmB-rpl10基因間區(qū) Intergenic

2.3.2聚類分析運用NTSYS-pc2.1軟件對61份丹參進行聚類分析。結果(圖2)顯示，在相似性系數(shù)為0.54處可分為兩大類群，四川省中江縣7號材料獨立聚為第一大類群；剩余的丹參聚為第二大類群。第二大類群在0.64處又可分為6個亞群，分為亞群Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ和Ⅵ。四川省、陜西省、山東省和9份中間材料聚在第Ⅰ亞群；安徽省、山西省和中間材料16號聚在亞群Ⅱ；四川省中江縣5號小葉丹參單獨聚為Ⅳ亞群。由圖2可見，四川丹參在5個亞群中均有，說明四川丹參的遺傳多樣性豐富，而且同一個省的丹參分布在不同的類群中，表明丹參藥材遺傳變異與地理分布無明顯相關性，這說明丹參產(chǎn)區(qū)之間的遺傳分化不明顯。

2.4 cpSSR和mtSSR標記在鼠尾草屬種間的通用性

利用13對mtSSR和10對cpSSR標記分別對丹參、墨西哥鼠尾草(S.leucantha)和康定鼠尾草(S.prattii)等進行PCR擴增。結果(表5)顯示：11對mtSSR標記和9對cpSSR標記能在3種以上的植物中擴增出清晰的條帶。11對mtSSR引物在9種鼠尾草屬中的平均通用性比率為64.63%，通用性較高；9對cpSSR引物在10種鼠尾草屬中的平均通用性比率為44.66%，通用性較低。

表4 23對mtSSR和cpSSR標記的遺傳參數(shù)

61份材料編號同表1圖2 基于遺傳距離的61份丹參資源聚類圖 The 61 variety codes were the same as in Table 1Fig.2 Cluster diagram of 61 accessions of S. miltiorrhiza based on genetic distance

2.5 cpSSR標記在野芝麻亞科植物屬間的通用性

將10對cpSSR引物分別在22條基因組序列中用電子PCR進行分析，結果(表6)發(fā)現(xiàn)，引物cp5p、cp8p和cp10p分別在3個屬4條基因組序列、8個屬21條基因組序列和6個屬12條基因組序列生成特異性產(chǎn)物，表明這3對引物在野芝麻亞科植物屬間的通用性較好。

3 討 論

3.1 61份丹參品種間的親緣關系

通過聚類分析發(fā)現(xiàn)，采集的61份丹參的遺傳相似性系數(shù)為0.54～0.96。山東32號和四川中江49號，中間材料47號和四川中江52號品種，遺傳距離最小，相似性系數(shù)最大。此外，來源于四川中江、山東和安徽的丹參聚在Ⅰ、Ⅱ亞群，說明四川中江、山東和安徽地區(qū)的丹參親緣關系較近，具有很大的相似性，可能是因為四川中江丹參的種植主要采用根段無性繁殖方式栽培，在栽培過程中引來了外來種源，不同地區(qū)進行種質(zhì)互換、基因交流等引起的。9份中間材料聚在Ⅰ亞群，可能它們母本之間親緣關系較近；而5號四川中江小葉丹參品種形成了相對獨立的亞群，小葉丹參經(jīng)產(chǎn)地長期選根留種，形成了具有適應性強、耐旱、畝產(chǎn)量高等優(yōu)勢的穩(wěn)定遺傳因子，且在長期栽培過程中和其他產(chǎn)地丹參品種間基因交流較少所致?？傮w看，四川丹參出現(xiàn)在絕大部分亞群中，說明四川丹參仍保留著較為豐富的遺傳多樣性。為保護四川丹參資源的多樣性，提高四川丹參的質(zhì)量，急需對四川丹參資源進行系統(tǒng)收集評價，為生產(chǎn)提供更加優(yōu)質(zhì)的種源。

表5 mtSSR和cpSSR引物在鼠尾草屬種間的擴增結果

注: -. 表示鼠尾草沒有用mtSSR來檢測

Note：-. Indicates thatSalviais not detected with mtSSR

表6 cpSSR引物在野芝麻亞科植物屬間的擴增結果

3.2 遺傳多樣性分析

遺傳多樣性是物種生存適應和發(fā)展進化的前提，對環(huán)境變化適應能力越強的物種，其遺傳多樣性越高或遺傳變異越豐富；反之，容易受到環(huán)境變化影響的物種其遺傳多樣性較低[11]。期望雜合度(He)被認為是衡量一個物種遺傳多樣性水平高低的標準，本研究結果表明丹參的期望雜合度為0.346，高于雙子葉植物的平均水平(He=0.190)，多態(tài)信息含量在0.089～0.373之間，平均值為0.278，Shannon’s指數(shù)平均值為0.519，說明所收集的丹參種質(zhì)資源呈中等水平的遺傳多樣性。與王海[9]、宋杰[12]、Hyejin An[13]等研究丹參遺傳多樣性的結果是一致的。本研究開發(fā)的23對SSR引物在丹參中具有較高的多態(tài)性，說明mtSSR和cpSSR引物對丹參具有良好的鑒別能力，可以作為品種鑒定的一個輔助工具。

3.3 cpSSR和mtSSR標記的通用性

近年，人們對葫蘆科[14]、虎耳草科[15]、蠟梅科[16]、松科[17]、禾本科[18]、豆科[19]、茄科[20]、菊科[21]、葡萄科[22]及薔薇科[23]等近緣物種間通用性進行了大量研究，并且開發(fā)了一定數(shù)目通用SSR標記，這些標記可以為遺傳學和基因組學等方面的研究提供更多的遺傳信息[24]。本研究所選用的11對mtSSR標記在鼠尾草屬通用性比率為64.63%，比宗成堃[25]利用EST-SSR標記在唇形科鼠尾草屬通用性分析結果高，表明丹參mtSSR在鼠尾草屬中有較好的通用性。而9對cpSSR在唇形科鼠尾草屬通用性比率為44.66%，低于宗成堃的研究結果。顯然，mtSSR和cpSSR引物在鼠尾草屬內(nèi)較高的可轉移性極大地減輕了引物開發(fā)的工作量，同時為研究種間進化關系提供了一條有效途徑。