十株乳酸菌耐酸特性及單寧酸耐受性的研究

田延楚，呂嘉櫪，余芳，張軍蒙

(陜西科技大學 食品與生物工程學院，西安 710021)

十株乳酸菌耐酸特性及單寧酸耐受性的研究

田延楚，呂嘉櫪*，余芳，張軍蒙

(陜西科技大學 食品與生物工程學院，西安 710021)

在乳酸菌發(fā)酵果蔬汁過程中，某些果蔬汁偏高的酸度和單寧酸含量是影響發(fā)酵的主要因素之一。研究采用植物乳桿菌、干酪乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、嗜熱鏈球菌、副干酪乳桿菌、嗜酸乳桿菌、羅伊氏乳桿菌、糞鏈球菌、乳雙歧桿菌和保加利亞乳桿菌，對其耐酸特性以及單寧酸對其生長的影響進行了研究。結(jié)果表明：10株乳酸菌產(chǎn)酸量依次為2.97%，3.24%，2.83%，1.14%，3.03%，2.56%，2.7%，1.0%，0.94%，2.56%；10株乳酸菌初始生長的pH值依次為4.0，3.5，4.0，4.5，3.0，4.0，3.5，4.5，4.5，3.0；而單寧酸對10株乳酸菌的生長有抑制作用，10株菌對單寧酸的耐受性依次為0.25%，0.25%，0.1%，0.2%，0.15%，0.15%，0.15%，0.15%，0.1%，0.15%。

乳酸菌；耐酸特性；單寧酸

乳酸菌發(fā)酵源遠流長，因其具有一定的有益功效，故廣泛用于食品的生產(chǎn)加工中。目前市面上有多種乳酸菌發(fā)酵食品，比如各種泡菜、漿水、香腸、面包、酸面團等；也有多種乳酸菌發(fā)酵飲品，但絕大多數(shù)飲品在原料中添加了乳品，如各種活菌型酸乳飲品、凝固型酸奶等；還有少數(shù)純果汁和復(fù)合果蔬汁的乳酸菌飲品[1-6]。純果蔬汁進行乳酸菌發(fā)酵所用的原料一般是低酸的果蔬品種，如洋蔥、山藥、芒果、火龍果等[7-10]；而酸度較高的蘋果汁、山楂汁、藍莓汁等一般需要經(jīng)過與其他的蔬菜汁，如紅棗汁、番茄汁、胡蘿卜汁或者乳品復(fù)配后才進行乳酸菌發(fā)酵[11-15]。

在乳酸菌發(fā)酵過程中，偏高的酸度和具有廣譜抗菌作用的單寧酸成為制約乳酸菌發(fā)酵某些高酸、高單寧酸含量的水果飲品的重要因素，使得乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)品不夠豐富且某些果汁飲品風味不夠獨特。因此，篩選出耐酸且耐單寧酸的乳酸菌是十分必要的。

本研究以10株乳酸菌為原料，主要針對其耐酸特性和單寧酸耐受性進行相關(guān)研究，以期篩選出合適的乳酸菌并為乳酸菌和果蔬的進一步開發(fā)利用提供一定的理論依據(jù)。

1 實驗

1.1 菌株

植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum，簡稱LP)、干酪乳桿菌(Lactobacilluscasei，簡稱LC)、鼠李糖乳桿菌(Lactobacillusrhamnosus，簡稱LCR)、嗜熱鏈球菌(Streptococcusthermophilus，簡稱ST)、副干酪乳桿菌(Lactobacillusparacasei，簡稱LCP)、嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidophilus，簡稱LA)、羅伊氏乳桿菌(Lactobacillusreuteri，簡稱LR)、糞鏈球菌(Streptococcusfaecalis，簡稱SF)、乳雙歧桿菌(Bifidobacteriumlactis，簡稱BL)、保加利亞乳桿菌(Lactobacillusbulgaricus，簡稱LB)，均由陜西科技大學食品與生物工程學院提供。

1.2 儀器與設(shè)備

B203LEDR生物顯微鏡 重慶奧特光學儀器有限公司；AC-0629普通光學顯微鏡 重慶光學儀器有限公司；單人凈化工作臺 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；DHP9080電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海佳勝實驗設(shè)備有限公司；LS-C50L型立式壓力蒸汽滅菌鍋 江陰濱江醫(yī)療設(shè)備廠；UV-2600型紫外可見分光光度計 尤尼柯上海儀器有限公司；PHS-3C雷磁pH計 上海儀電科學儀器股份有限公司。

1.3 培養(yǎng)基

MRS培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，酵母膏5 g，牛肉膏10 g，檸檬酸二銨2 g，葡萄糖20 g，吐溫-80 1 mL，乙酸鈉5 g，磷酸氫二鉀2 g，硫酸鎂0.58 g，硫酸錳0.25 g，蒸餾水1000 mL，121 ℃滅菌20 min。

1.4 實驗方法

1.4.1 菌株活化

將10株乳酸菌按體積分數(shù)為1%的比例接株到滅菌的MRS培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)48 h，按相同的步驟再重復(fù)活化1次，備用。

1.4.2 菌株產(chǎn)酸能力的測定

用MRS培養(yǎng)基，按1%(體積比)的接株量將10株乳酸菌分別接株于培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫培養(yǎng)72 h，以未接菌的培養(yǎng)基為對照，每隔12 h，用酸堿滴定法測定其總酸，并測其pH值。

1.4.3 菌株耐酸性的測定

培養(yǎng)基的初始pH會對菌株生長代謝所需的酶的活性以及營養(yǎng)物質(zhì)的利用情況等產(chǎn)生影響，因此影響菌株的生長情況。將滅菌的MRS培養(yǎng)基用1%(體積比)的鹽酸調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH分別為2.5，3.0，3.5，4.0，4.5，5.0，將活化好的菌株按1%(體積比)的接株量分別接入調(diào)節(jié)pH后的MRS培養(yǎng)基中，于37 ℃恒溫培養(yǎng)72 h，以未接菌的MRS培養(yǎng)基為對照，每隔12 h，用紫外可見分光光度計在600 nm處測其OD值。

1.4.4 單寧添加量對菌株生長的影響

在MRS培養(yǎng)基中添加單寧酸，使其含量分別達到0%，0.05%，0.1%，0.15%，0.2%，0.25%，0.3%，按1%(體積比)的接株量將10株乳酸菌分別接株于上述培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫培養(yǎng)72 h，以未接菌的培養(yǎng)基為對照，每隔12 h，用紫外可見分光光度計在600 nm處測其OD值。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株產(chǎn)酸能力的測定

其中：X為總酸，g/kg；c為滴定用氫氧化鈉溶液濃度，mol/L；V1為消耗氫氧化鈉體積，mL；V2為空白樣消耗氫氧化鈉體積，mL；K為換算系數(shù)，乳酸0.090；F為稀釋倍數(shù)；m為試樣質(zhì)量，將計算結(jié)果用百分數(shù)表示。繪圖結(jié)果見圖1和圖2。

圖1 10株乳酸菌的總酸

圖2 10株乳酸菌的pH值變化情況

由圖1可知，10株乳酸菌在生長過程中均可產(chǎn)酸，其中LC產(chǎn)酸最多，產(chǎn)酸量達到3.24%；其次是LCP，LP，LCR，LR，LA，LB，其產(chǎn)酸量依次為3.03%，2.97%，2.83%，2.7%，2.56%，2.56%；接著是ST，SF，產(chǎn)酸量依次為1.14%，1.0%；而BL的產(chǎn)酸量最少，僅為0.94%。

由圖2可知，發(fā)酵結(jié)束后BL的pH值為4.54，是10株菌中最高的；然后為SF，ST，依次為4.34和4.25；接著是LA，LB，LR，LCR，LP，依次為3.75，3.71，3.7，3.66，3.63；最后是LC和LCP，其中LC的pH值為3.60，LCP的pH值為3.59。與圖1的結(jié)論進行對比發(fā)現(xiàn)，LA和LB的產(chǎn)酸量相同，但LB的pH值更低，說明LB產(chǎn)解離酸比LA多；LC產(chǎn)酸量最多，LCP其次，但LCP的pH值比LC低0.01，說明LCP產(chǎn)解離酸稍多于LC；其余菌株產(chǎn)酸量和其pH值趨勢是相一致的。因此，產(chǎn)酸量結(jié)論和pH值結(jié)論基本吻合。

2.2 菌株耐酸性的測定

為了直觀地確定菌株的耐酸能力，以培養(yǎng)基的初始pH值為變量，每12 h的OD600值(未接菌的培養(yǎng)基調(diào)零)為指標進行單因素實驗，其結(jié)果見圖3～圖7。

圖3 pH為2.5時10株乳酸菌的生長情況

圖4 pH為3.0時10株乳酸菌的生長情況

圖5 pH為3.5時10株乳酸菌的生長情況

圖6 pH為4.0時10株乳酸菌的生長情況

圖7 pH為4.5時10株乳酸菌的生長情況

由圖3～圖7耐酸試驗結(jié)果可知，培養(yǎng)基初始pH低于3.0時，10株乳酸菌均不能生長；初始pH高于4.5時，10株乳酸菌都可以生長。LCP和LB均在初始pH 3.0時有生長趨勢但不明顯，LCP從12 h開始快速生長，48 h后趨于穩(wěn)定，LB也是從12 h開始快速生長，36 h后趨于穩(wěn)定；LC在初始pH增加為3.5時長勢很好，且12 h開始快速生長，36 h后進入穩(wěn)定期；LR和LCR在此條件下也可以生長，但長勢不佳，可看出LR從12 h開始快速生長，36 h后趨于穩(wěn)定，LCR在12 h內(nèi)快速生長，24 h后達到穩(wěn)定期；LP和LA初始生長pH為4.0，且長勢良好，LP在12 h后快速生長，24 h后趨于平穩(wěn)，LA的快速生長期為24 h內(nèi)，其后也達到穩(wěn)定期；pH達到4.5時，BL，ST和SF均出現(xiàn)生長趨勢。結(jié)合菌株生長的初始pH以及它們生長良好的pH值發(fā)現(xiàn)，10株菌中LCP，LC的耐酸性最好，其次為LCR，LB和LR，接著是LA，LP，而BL，ST和SF的耐酸性最差。

2.3 單寧酸添加量對菌株生長的影響

單寧酸廣泛存在于植物的各個部位，因其具有廣譜抑菌作用，故需篩選出有抗單寧作用的乳酸菌株才能發(fā)酵果蔬，實驗結(jié)果見圖8～圖13。

圖8 單寧添加量為0時OD值

圖9 單寧添加量為0.05%時OD值

圖10 單寧添加量為0.1%時OD值

圖11 單寧添加量為0.15%時OD值

圖12 單寧添加量為0.2%時OD值

圖13 單寧添加量為0.25%時OD值

由圖8～圖13可知，隨著單寧酸添加量的增加，10株乳酸菌的OD值增加會逐漸變緩。單寧酸添加量為0%時，10株乳酸菌的OD值均大幅上升，即10株菌生長良好；單寧酸添加量為0.05%時，10株乳酸菌的OD值也大幅上升，但和單寧酸添加量0%相比數(shù)據(jù)整體偏低；單寧酸添加量為0.1%時，10株乳酸菌的OD值依然上升明顯但數(shù)據(jù)整體更加偏低，說明10株菌的生長受到抑制；當單寧酸添加量上升至0.15%時，可明顯看到BL和LCR的OD值沒有上升，菌株不生長；單寧酸添加量繼續(xù)上升為0.2%時，LA，SF，LR，LB，LCP的OD值上升不明顯，菌株不升值；而添加單寧酸含量為0.25%時，ST的OD值也不再增加，說明ST沒有生長；在此情況下只有LC和LP的OD值上升，菌株依然生長。由上述結(jié)果可知單寧酸會抑制10株乳酸菌的生長，但其中也有對單寧酸表現(xiàn)出抗性作用的菌株，10株乳酸菌對單寧酸的耐受性由高到低依次為：LC，LP>ST>LB，LR，LCP，LA，SF>LCR，BL。

3 結(jié)論

本研究采用植物乳桿菌、干酪乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、嗜熱鏈球菌、副干酪乳桿菌、嗜酸乳桿菌、羅伊氏乳桿菌、糞鏈球菌、乳雙歧桿菌和保加利亞乳桿菌，對其耐酸特性以及單寧酸對其生長的影響進行了研究。結(jié)果表明：10株乳酸菌中干酪乳桿菌產(chǎn)酸最多，乳雙歧桿菌產(chǎn)酸最少；干酪乳桿菌和保加利亞乳桿菌耐酸性最好，其次是羅伊氏乳桿菌和副干酪乳桿菌；而單寧酸會抑制10株乳酸菌的生長，但其中有些乳酸菌對單寧酸的抑制作用不敏感，10株乳酸菌株中對單寧酸的耐受性最好的是干酪乳桿菌和植物乳桿菌，其對單寧酸的耐受性可達0.25%以上。乳酸菌對單寧酸的耐受性可能是由于其可以分泌單寧酶與單寧結(jié)合位點結(jié)合，從而降低單寧的抑制性，也可能是由于其含有的酶不含金屬離子，故單寧酸不能與其結(jié)合發(fā)揮抑制作用等。通過對10株乳酸菌耐酸性和單寧酸耐受性進行研究，可以為研制以高酸、高單寧含量的果蔬品種為原料的乳酸菌制品奠定基礎(chǔ)。

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Research on Acid-resistant Characteristics and Tannic Acid Tolerance of Ten Strains of Lactobacillus

TIAN Yan-chu, LV Jia-li*, YU Fang, ZHANG Jun-meng

(College of Food and Bioengineering, Shaanxi University of Science and Technology, Xi'an 710021,China)

In the process of fermenting fruit and vegetable juice with lactobacillus, the high acidity and tannin content is one of the main factors that affect the fermentation. Ten strains of lactobacillus, such asLactobacillusplantarum,Lactobacilluscasei,Lactobacillusrhamnosus,Streptococcusthermophilus,Lactobacillusparacasei,Lactobacillusacidophilus,Lactobacillusreuteri,Enterococcusfaecalis,BifidobacteriumlactisandLactobacillusbulgaricus, are studied on the acid-resistant characteristics and the effect of tannic acid on the growth of these lactobacillus strains. The results show that the acid production amount of these ten strains of lactobacillus is 2.97%, 3.24%, 2.83%, 1.14%, 3.03%, 2.56%, 2.7%, 1.0%, 0.94%, 2.56%; the initial pH value of these ten strains of lactobacillus is 4.0, 3.5, 4.0, 4.5, 3.0, 4.0, 3.5, 4.5, 4.5, 3.0; tennic acid has effect on the growth of these ten strains of lactobacillus, and tannic acid tolerance to these ten strains of lactobacillus is 0.25%, 0.25%, 0.1%, 0.2%, 0.15%, 0.15%, 0.15%, 0.15%, 0.1%, 0.15%.

lactobacillus; acid-resistant characteristics; tannic acid

2016-10-12 *通訊作者

國家自然科學基金資助項目(59493300)；教育部博士點基金資助項目(9800462)

田延楚(1992-)，女，陜西榆林人，碩士，研究方向：發(fā)酵工程； 呂嘉櫪(1964-)，女，陜西咸陽人，教授，研究方向：應(yīng)用微生物。

TS201.1

A

10.3969/j.issn.1000-9973.2017.01.002

1000-9973(2017)01-0005-05