(青島大學國家生理學重點(培育)學科,山東 青島 266071)
帕金森病(PD)是一種發(fā)病率僅次于阿爾茨海默病(AD)的第2大神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。許多研究表明,遺傳、環(huán)境、老齡化和氧化應激等因素均參與了PD的發(fā)病的過程[1-2]。目前,臨床上用于治療PD的藥物只能在一定程度上改善疾病的相關癥狀,而不能阻止PD病情的發(fā)展[3-5]。因此,闡明PD的發(fā)病原因及可能機制成為現(xiàn)代醫(yī)學研究亟需解決的難題。
FAM3基因家族(FAM3)是2002年新發(fā)現(xiàn)的一個細胞因子樣基因家族,目前已知包括FAM3A、FAM3B、FAM3C和FAM3D 4個成員[5]。FAM3基因家族成員的蛋白序列由224~235個氨基酸殘基組成,具有高度的同源性,而與其他已知的蛋白均沒有發(fā)現(xiàn)同源性[6-7]。目前的研究已初步揭示FAM3基因家族成員有可能在包括糖尿病、腫瘤及神經(jīng)退行性疾病等在內(nèi)的多種重大疾病的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用[8-10]。FAM3C是FAM3基因家族的第3個成員,研究發(fā)現(xiàn)FAM3C在人與小鼠的全身組織中均有表達[11]。目前越來越多的研究表明,F(xiàn)AM3C是葡萄糖和脂質(zhì)代謝的重要調(diào)節(jié)劑[12],而且FAM3C的異常表達參與了多種腫瘤的形成及轉(zhuǎn)移過程[13-14]。HASEGAWA等[15]研究顯示,AD的發(fā)生和大腦中淀粉樣斑塊的形成密切相關,F(xiàn)AM3C通過破壞淀粉樣β前體的穩(wěn)定來改善阿爾茨海默病。然而,F(xiàn)AM3C在PD發(fā)病中的作用尚不明確。本研究選用攜帶人突變型α-突觸核蛋白A53T純合子(α-SynA53T+/+)小鼠,通過檢測不同月齡的α-SynA53T+/+小鼠黑質(zhì)(SN)區(qū)FAM3C蛋白的表達水平,探究FAM3C在PD發(fā)生、發(fā)展中的作用,為闡明PD發(fā)生和發(fā)展的分子機制提供實驗基礎?,F(xiàn)將結果報告如下。
健康α-SynA53T+/+小鼠購于南京大學模式動物研究所,按SPF級別飼養(yǎng),置于室溫(22±2)℃下,12-12 h晝夜循環(huán)光照下生活,自由飲水取食。鑒定基因型后,選取3、6月齡雄性α-SynA53T+/+小鼠和同窩野生型(WT)小鼠各4只。所有關于實驗動物的操作均符合青島大學實驗動物操作規(guī)則中的要求。
大鼠源FAM3C抗體購買于美國R&D SYSTEMS公司,小鼠源Alpha-Synuclein抗體購買于英國Abcam公司,HRP標記山羊抗大鼠IgG購買于MDBio.Inc公司,HRP標記山羊抗小鼠IgG購買于Absin公司,RIPA裂解液、分離膠緩沖液和濃縮膠緩沖液購于康為公司,ECL發(fā)光試劑盒購買于美國Millipore公司。
電泳槽Mini-VE、電轉(zhuǎn)儀(濕轉(zhuǎn))Trans-Blot和電泳儀Power-Pac200購買于美國BIO-RAD公司。
以水合氯醛深度麻醉小鼠,迅速斷頭,完整取出包括中腦SN區(qū)的腦組織,置于冰盒內(nèi),迅速準確取出SN部分,放入預冷的EP管中,準確稱質(zhì)量后,在冰上用加入蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA蛋白裂解液充分研磨、裂解30 min以后,4 ℃下以12 000 r/min離心20 min,取上清液于新的EP管中,應用酶標儀以BCA法測定波長562 nm處的吸光度值,進行蛋白濃度測定。按每孔25 μg蛋白上樣,通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳將不同分子質(zhì)量的蛋白分開,然后電轉(zhuǎn)移到PVDF膜上,于室溫下以100 g/L的脫脂奶粉封閉2 h;分別加入大鼠源FAM3C一抗(1∶300)和小鼠源Alpha-Synuclein 一抗(1∶1 000),4 ℃孵育過夜,在PBST中洗3次后,分別與辣根過氧化物酶標記的山羊抗大鼠IgG(1∶5 000)和山羊抗小鼠IgG(1∶10 000)在室溫下孵育1 h,在PBST中洗滌3次,ECL發(fā)光液顯影,UVP凝膠成像系統(tǒng)成像后用Image J軟件對蛋白條帶進行半定量分析。
Western Blot方法檢測結果顯示,3月齡α-SynA53T+/+小鼠SN區(qū)Human-α-Syn蛋白表達水平顯著升高,差異有統(tǒng)計學意義(t=9.884,P<0.05)。6月齡α-SynA53T+/+小鼠SN區(qū)Human-α-Syn蛋白的表達水平顯著升高,差異具有統(tǒng)計學意義(t=3.779,P<0.05)。見圖1。
Western Blot方法檢測結果顯示,3月齡α-SynA53T+/+小鼠SN區(qū)FAM3C蛋白水平與WT小鼠相比,差異無統(tǒng)計學意義(t=1.245,P>0.05);而6月齡α-SynA53T+/+小鼠SN區(qū)FAM3C蛋白表達水平與WT小鼠相比明顯升高,差異有統(tǒng)計學意義(t=8.865,P<0.05)。見圖2。
PD的主要病理特征是中腦黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的退行性變性死亡,黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元漸進性死亡與氧化應激和炎癥反應有關。前期研究發(fā)現(xiàn),多種細胞因子參與了PD的發(fā)生及發(fā)展過程,PD病人腦脊液中的腫瘤壞死因子-α、白細胞介素1β和白細胞介素6的含量出現(xiàn)了上升[16-18]。自FAM3家族被發(fā)現(xiàn)以來,國內(nèi)外研究者對FAM3基因家族成員的生物學功能展開了深入的研究,目前的研究已經(jīng)初步揭示FAM 3基因家族在代謝、腫瘤以及蛋白質(zhì)相互作用等方面具有重要的生理作用[6,7,10,19]。FAM3A是FAM3細胞因子樣基因家族的第1個成員,體外研究表明,F(xiàn)AM3A主要定位在培養(yǎng)肝細胞的線粒體之中,具有促進ATP生成以及分泌的作用[20-21]。FAM3B是FAM3基因家族的第2個成員,主要表達于胰腺,具有與炎癥因子白細胞介素6相似的致細胞凋亡的作用[22-23],在胰島素抵抗和2型糖尿病發(fā)展過程中起重要作用,其可能成為2型糖尿病的新干預靶點[24-25]。FAM3D被發(fā)現(xiàn)可能介入了機體能量代謝異常、結腸癌及嗜睡等的發(fā)生發(fā)展過程[18,24,26-27]。FAM3C是FAM3基因家族的第3個成員,已被發(fā)現(xiàn)在胚胎發(fā)育和視網(wǎng)膜功能調(diào)控、上皮細胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化以及胰腺癌發(fā)生過程中起著重要作用,在腫瘤組織中發(fā)現(xiàn)了高水平的FAM3C蛋白表達[15,28-30]。在唾液腺、胰腺、結腸、十二指腸和乳腺中的分泌性上皮細胞中也有FAM3C的表達[13]。近年來FAM3C的功能和表達也在哺乳動物大腦中進行了研究,結果顯示FAM3C水平降低與AD的發(fā)病有關,腦內(nèi)FAM3C的表達水平在出生后達到峰值,隨著年齡的增長而下降,與年齡匹配的正常腦相比,AD腦中FAM3C免疫反應神經(jīng)元的陽性數(shù)量減少[15,30]。
A:3月齡,B:6月齡。
A:3月齡,B:6月齡。
本實驗研究顯示,PD模型小鼠在6月齡時SN區(qū)FAM3C蛋白表達水平出現(xiàn)增高,提示FAM3C異常表達參與了PD的發(fā)生及發(fā)展過程,為進一步闡述PD的發(fā)病機制提供了實驗依據(jù)。
綜上所述,在PD的發(fā)病過程中出現(xiàn)了SN區(qū)FAM3C的異常表達,但其對PD發(fā)病機制的作用還需要進一步的研究探討。