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    一種改良的簡易灌注分離小鼠肝細胞的方法

    2018-02-13 09:58:34
    精準醫(yī)學雜志 2018年6期
    關鍵詞:膠原酶貼壁原代

    (北京大學人民醫(yī)院藥劑科,北京 100044)

    肝臟是人體重要的代謝器官之一,可參與多種生理病理過程[1-6]。在肝臟行使的諸多功能中,肝細胞發(fā)揮了主要作用,原代培養(yǎng)的肝細胞更接近于機體內(nèi)環(huán)境,因此成為許多體外實驗的選擇,但肝細胞的分離技術要求高、原代培養(yǎng)的肝細胞增殖能力差,不容易成功。兩步灌流法是分離肝細胞的經(jīng)典方法[7],該方法分離得到的細胞數(shù)量多、存活率及純度也較高,但該方法所需的灌流裝置復雜,操作技術要求高,耗時長,而且不適宜小鼠的肝細胞分離。近年來有文獻報道的Ⅳ型膠原酶消化法分離小鼠肝細胞,是一種不經(jīng)血液灌流的酶直接消化法[8-9],該方法簡單易行,但與傳統(tǒng)的灌流法相比,收獲的肝細胞數(shù)量減少、純度不夠高。因此,建立一種簡單易行、高效的分離培養(yǎng)純化肝細胞的方法十分重要。本研究采用改良的簡易兩步灌注法分離小鼠肝細胞,并進行原代培養(yǎng),旨在為肝細胞相關課題的研究奠定基礎?,F(xiàn)將結果報告如下。

    1 材料與方法

    1.1 實驗動物

    4~12周齡C57小鼠60只,雌雄不限,由北京大學醫(yī)學部動物部提供。

    1.2 主要實驗試劑及器材

    實驗所用試劑主要包括高糖DMEM(美國HYCLONE公司);鼠尾膠原(美國MILLIPORE公司);胎牛血清(FBS,美國GIBCO公司);Ⅳ型膠原酶(美國GIBCO公司)等。實驗相關器材主要包括0.45 mm頭皮針、200目尼龍細胞篩等。

    1.3 肝細胞分離及純化

    以3 g/L戊巴比妥鈉10 mL/kg體質(zhì)量腹腔注射麻醉小鼠,為防止麻醉過深致術中小鼠死亡而使肝臟凝血,可在麻醉后立即腹腔注射0.05 mL肝素;麻醉后固定小鼠,乙醇消毒皮膚,依次剪開皮膚、皮下組織并充分暴露肝門靜脈,肝門處筋膜少無需剝離,經(jīng)肝門靜脈穿線備用;用眼科剪在門靜脈處剪一“V”字形切口,棉球短暫壓迫止血,立即插入頭皮針(連接裝有20 mL灌流液注射器),動脈夾固定頭皮針,再將已穿好的線結扎以防頭皮針滑脫;固定頭皮針針頭后,可用鑷子固定灌流管路以防通路扭曲產(chǎn)生氣泡或推注時針頭扭動而刺破門靜脈;緩慢推入D-Hank’s灌流液(無需預熱,室溫即可),待肝臟逐漸膨漲并變白時剪斷下腔靜脈使灌流液流出,再夾閉下腔靜脈繼續(xù)推入灌流液,待肝臟再次膨脹后松開夾閉的下腔靜脈使灌流液流出,如此反復循環(huán)2~3次,可將肝臟內(nèi)的血液灌凈,整個過程約需10 mL灌流液,大約推注5 min;灌流結束后將注射器里換成預熱的膠原酶,推注速度略慢,肝臟膨脹后夾閉下腔靜脈,靜止0.5~1.0 min使酶充分發(fā)揮消化作用,再松開下腔靜脈時,肝臟塌陷速度減慢,如此循環(huán)2~4次后肝臟塌陷,表面出現(xiàn)裂痕,有明顯的肝小葉輪廓,此時可停止消化;小心取下肝臟,置入裝有15 mL預冷DMEM的玻璃皿中漂洗,小心剝除膽囊、結締組織等成分后;再將肝臟置入另一個裝有15 mL預冷DMEM的玻璃皿中,將肝臟放在200目細胞篩上,微微傾斜玻璃皿,用眼科鑷輕輕剝離肝包膜,可見肝臟逐步變?yōu)椤盃€泥狀”,夾住肝門處結締組織并在篩子上輕輕甩動肝臟,靠篩子的摩擦力將肝細胞過濾到細胞篩下面的玻璃皿中,最后再用數(shù)毫升DMEM沖洗篩子上殘余的肝細胞;將含有細胞懸液的DMEM液體置入15 mL離心管中,室溫靜止5~8 min,一般可收獲2~4 mL細胞沉淀,吸掉上清液,加入預冷的DMEM,重懸細胞,再次室溫靜止5~8 min以純化細胞。

    1.4 肝細胞培養(yǎng)

    將37 ℃預熱的完全培養(yǎng)基(含體積分數(shù)0.10 FBS的高糖DMEM)加入到已純化的細胞沉淀中,重懸細胞并混勻以進行細胞計數(shù),調(diào)整肝細胞懸液的細胞密度,按每孔1×106個細胞接種于鋪有鼠尾膠原的6孔或12孔培養(yǎng)板中,在倒置顯微鏡下動態(tài)觀察細胞的形態(tài)后,置于37 ℃的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。4 h細胞貼壁后進行細胞換液,用吸量管或槍頭用力吹打細胞,以將雜質(zhì)吹下。棄培養(yǎng)液,吸凈,直接加入37 ℃預熱的新鮮培養(yǎng)液培養(yǎng)細胞,以后每24 h換液1次,細胞可存活10 d以上。

    2 結 果

    小鼠肝臟經(jīng)以上改良的簡易兩步灌注法消化后,可獲得分散較好的單個細胞,每只小鼠獲得的肝細胞數(shù)量約為2.5×107個,細胞呈圓形、透明,包膜完整而清晰;取經(jīng)3次洗滌后的肝細胞懸液加入等量錐蟲藍染液混合染色數(shù)秒鐘后,滴于玻片,置顯微鏡下行活細胞記數(shù),低倍鏡下可見活細胞呈光亮圓形,飽滿,透光度好,胞核清晰,錐蟲藍染色觀察,消化后所得的細胞較少著色,細胞成活率可達85%以上。細胞培養(yǎng)4 h大約90%以上的肝細胞貼壁(圖1),貼壁的肝細胞呈典型的黏附聚集生長,細胞由貼壁前的圓形轉(zhuǎn)變?yōu)槎噙呅?,胞體變平變薄,明顯增大。胞漿豐富,胞核呈圓形或橢圓形,單核或雙核。細胞可穩(wěn)定貼壁7~10 d(圖2~3),貼壁期間細胞成活率仍大于85%,7~10 d后細胞陸續(xù)出現(xiàn)脫顆粒、死亡。

    除細胞成活率外,研究還顯示,小鼠肝細胞原代培養(yǎng)到第1、3、5、7和10天時均能夠分泌白蛋白,細胞培養(yǎng)液內(nèi)檢測到的白蛋白的濃度分別為(1.87±0.13)、(1.98±0.32)、(3.45±0.21)、(4.12±0.15)與(3.53±0.19)g/L。結果表明分離培養(yǎng)的肝細胞功能良好,可用于后續(xù)實驗。

    圖1 肝細胞培養(yǎng)4 h后的形態(tài)

    圖2 肝細胞培養(yǎng)7 d后的形態(tài)

    圖3 肝細胞培養(yǎng)10 d后的形態(tài)

    3 討 論

    原代培養(yǎng)的肝細胞是一種應用廣泛的細胞模型,因其更接近體內(nèi)環(huán)境,可更好地模擬體內(nèi)細胞的功能,常用于藥理學、分子生物學等諸多領域的相關研究[10-16]。本課題組通過長期摸索、反復實驗,結合以往經(jīng)典的二步灌流法[7]和Ⅳ型膠原酶直接消化法,設計了一種操作簡單、省時、高效的簡易灌注分離小鼠肝細胞的方法,現(xiàn)將經(jīng)驗總結如下。

    3.1 小鼠的選擇

    C57是近交系動物,與封閉群相比,個體之間差異小,對實驗反應一致,動物品種的具體選擇應根據(jù)實驗需求。小鼠的性別,原則上雌雄不限,但同組實驗,盡量保證性別前后一致,以求實驗結果的穩(wěn)定。8~10周齡的小鼠是相當于成年狀態(tài),大小合適,低于4周齡的年齡偏小,門靜脈細,不易插管;高于12周齡的小鼠,年齡偏大。但具體情況應根據(jù)實驗需求而定,根據(jù)本課題組的經(jīng)驗,4~12周齡的小鼠都可以采取本方法獲取較多的肝細胞。

    3.2 培養(yǎng)基的選擇

    分離肝細胞時使用的培養(yǎng)液,最好用4 ℃預冷的DMEM(不含F(xiàn)BS),因低溫對肝細胞有保護作用,最后培養(yǎng)細胞及換液時所需的培養(yǎng)液,要使用37 ℃預熱的完全培養(yǎng)液。預先用“膠原蛋白”處理的培養(yǎng)皿,細胞貼壁效果更好。

    3.3 灌流及消化過程中注意的問題

    門靜脈插管和膠原酶消化,是本方法的核心要素。0.45 mm的頭皮針連接上裝有20 mL灌流液的注射器后,首先應將管道的氣泡排凈,以防氣泡進入肝臟導致灌流不全;將頭皮針的針頭稍微摩鈍,以防插管時將肝門靜脈刺破;用剪刀將頭皮針的針柄剪出劃痕,以增加固定時的摩擦力,防止滑脫。Ⅳ膠原酶應現(xiàn)用現(xiàn)配,使用HBSS液配制,濃度為1 g/L(不同批次膠原酶活力略有差異,濃度一般1 g/L),使用前,置于37 ℃水浴鍋預熱30 min~1 h,酶的活力更佳。

    3.4 肝細胞的功能檢測

    本研究結果顯示,經(jīng)此簡易灌注法分離的小鼠肝細胞可穩(wěn)定貼壁7~10 d,貼壁期間細胞存活率可達85%以上,與傳統(tǒng)方法相似[17]。通過檢測培養(yǎng)液上清中的白蛋白的分泌情況,判斷肝細胞的生物學活性和功能,結果表明本研究分離培養(yǎng)的肝細胞功能良好,可用于后續(xù)實驗,白蛋白分泌量隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加而增加,培養(yǎng)至第7天時分泌量達高峰,隨后逐漸下降,在培養(yǎng)的3~10 d左右為肝細胞原代培養(yǎng)的最佳實驗階段。成纖維細胞污染通常是導致肝臟上皮細胞培養(yǎng)失敗的主要原因,本方法采取的簡易灌注法首先在灌注膠原酶后可使肝臟充分消化;其次在停止消化后,小心剝除膽囊、結締組織等成份,并將肝包膜撕除干凈,以上措施均可很大程度上防止成纖維細胞的混雜生長。

    綜上所述,這種簡易的灌流方法,與SEGLEN等[7]的方法相比,不需要特殊的復雜裝置,與王宇明[18]簡易灌流法相比,灌流裝置由輸液管改為注射器,手動推入,更易根據(jù)灌流情況掌控推入速度。此外,本實驗的創(chuàng)新點還在于收集細胞時不使用離心法,而采取室溫靜置數(shù)分鐘的方法,筆者對比了離心法和靜置法收集肝細胞的數(shù)量差異,室溫靜置法收集的肝細胞數(shù)量明顯高于離心法,可能是由于新分離的肝細胞較為脆弱,離心法會增加肝細胞的破損。根據(jù)本課題組的摸索,此方法同樣適用于大鼠肝細胞的分離及原代培養(yǎng)[19],更換大號頭皮針、適度增加灌流量、增加酶的消化時間即可,其他步驟同上。原代肝細胞已成經(jīng)為科學研究中應用越來越廣泛的細胞模型[20-22],期望本課題組探索的簡易兩步灌注法分離小鼠肝細胞,能被更多的實驗室采納應用。

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