動物早期胚胎體外培養(yǎng)的研究進(jìn)展

孫思怡，李 琦，張 帆，韓淑敏，李雁冰，李井春，魏國生

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動物科技學(xué)院，黑龍江 大慶 163319）

近年來，胚胎體外培養(yǎng)作為動物繁殖的重要手段越來越受到重視。將胚胎在體外培養(yǎng)至桑椹胚或囊胚后再進(jìn)行移植能有效地提高繁殖效率，但同時也存在胚胎質(zhì)量差、囊胚率低、基因變異率高等問題。隨著相關(guān)學(xué)者的不斷研究，目前進(jìn)展較為順利，在一定程度上改善了這些問題。早期胚胎體外培養(yǎng)采用模擬母體體內(nèi)生理環(huán)境的方法構(gòu)建培養(yǎng)環(huán)境，獲得了較好的培養(yǎng)效果。此外，培養(yǎng)液配方和胚胎培養(yǎng)體系的改良也一直是研究的熱點(diǎn)。培養(yǎng)液的改良方法主要是在已有的基礎(chǔ)培養(yǎng)液中添加一些物質(zhì)，以期達(dá)到提高囊胚率、改善胚胎質(zhì)量以及克服發(fā)育阻斷的效果。胚胎培養(yǎng)體系也由最初的靜置培養(yǎng)體系逐漸發(fā)展為動態(tài)培養(yǎng)體系，更為接近體內(nèi)發(fā)育環(huán)境。由于胚胎的體外培養(yǎng)受多因素影響，因此，綜合培養(yǎng)液成分和培養(yǎng)環(huán)境等因素進(jìn)行整體效應(yīng)考慮，對胚胎體外培養(yǎng)的研究更為有利。

1 早期胚胎體外培養(yǎng)的培養(yǎng)環(huán)境

對早期胚胎體外培養(yǎng)影響較大的環(huán)境因素有溫度、氣相環(huán)境、滲透壓及pH值。早期胚胎對溫度較為敏感，在胚胎體外培養(yǎng)過程中較為常用的溫度為37～39℃，對不同動物來說最適宜的溫度略有差異［1］。胚胎的生存必須依賴氧氣，但氧濃度過高并不利于胚胎的發(fā)育，因此，保證低氧環(huán)境對胚胎的體外培養(yǎng)是必要的。在較高的氧氣壓力下，外側(cè)的卵裂球?qū)⒁暂^慢的速率分裂并形成滋養(yǎng)外胚層，而在較低的氧氣張力下內(nèi)側(cè)的卵裂球?qū)⒏杆俚胤至巡⑶掖俪蓛?nèi)細(xì)胞團(tuán)塊。有試驗(yàn)證明，氧張力對牛囊胚中的組蛋白標(biāo)記H3K9me2（抑制性）和 H3K4me2（允許性）具有重要影響［2］。 在人類卵母細(xì)胞和胚胎體外培養(yǎng)過程中，5%O2條件下胚胎著床率和卵裂率顯著高于20%O2條件下［3］。但最近也有數(shù)據(jù)表明，胚胎培養(yǎng)的最佳氧氣張力可能取決于發(fā)育階段［4］。有研究表明，人體外受精胚胎采用低氧環(huán)境培養(yǎng)可能有助于提高胚胎發(fā)育潛能［5］。目前常規(guī)培養(yǎng)系統(tǒng)中多使用5%O2培養(yǎng)條件，但由于氧濃度與不同培養(yǎng)系統(tǒng)的相互作用的差異導(dǎo)致5%O2對不同培養(yǎng)系統(tǒng)的作用結(jié)果不同。除了氧濃度以外，胚胎的生存對CO2濃度也有一定的要求。到目前為止，胚胎體外培養(yǎng)仍主要采用5%CO2的氣相環(huán)境。 培養(yǎng)液中含有 Na+、Cl-、K+、Mg2+、Ca2+、PO43-、SO42-、HCO3-等無機(jī)鹽成分。 Na+和 Cl-主要作用是調(diào)節(jié)滲透壓；HCO3-作為緩沖劑可調(diào)節(jié)培養(yǎng)液的pH值，是哺乳動物胚胎培養(yǎng)液中較為重要的一種，胚胎發(fā)育較適宜的 pH 值為 7.1～7.4［6］；在卵裂階段，提高K+濃度、降低Na+濃度對胚胎的發(fā)育是有利的。

2 胚胎培養(yǎng)液的添加物

輸卵管和子宮的生理環(huán)境對早期胚胎的正常發(fā)育有很大的影響，因此，在體外培養(yǎng)時，需盡量使培養(yǎng)液達(dá)到體內(nèi)發(fā)育的相關(guān)條件。胚胎培養(yǎng)液中的主要添加物有無機(jī)鹽、能量底物、氨基酸、維生素、激素、蛋白成分和生長因子等，為胚胎的正常發(fā)育提供一個相對適宜的環(huán)境。近年來，對培養(yǎng)液中的添加物進(jìn)行調(diào)整以完善配方，確保胚胎擁有更好的體外培養(yǎng)環(huán)境一直是相關(guān)研究的熱點(diǎn)。研究者根據(jù)試驗(yàn)的目的、方法等因素會選擇不同的培養(yǎng)液，目前較為常用的胚胎體外培養(yǎng)液有TCM199、Ham′s F10、SOF、CR1、CZB 等［7］。Pinyopummintr等［8］研究表明，在牛卵裂期胚胎發(fā)育階段具有選定底物的簡單培養(yǎng)基可以支持早期發(fā)育，效果比復(fù)合培養(yǎng)基更好。

2.1 能量底物

胚胎在體外發(fā)育過程中，最基本的生命活動即是能量代謝，因此，能量底物是胚胎培養(yǎng)液中必不可少的一種成分。胚胎在體內(nèi)發(fā)育過程中，主要的能源物質(zhì)有丙酮酸、乳酸和葡萄糖等。隨著胚胎的發(fā)育，早期胚胎在不同階段所需的能量底物的濃度有所不同，作用亦有不同，不同物種之間也存在差異。小鼠、綿羊、牛及人的早期胚胎主要以丙酮酸、乳酸和氨基酸為能量代謝的底物，對葡萄糖的利用能力則很有限，甚至在一些不含氨基酸的培養(yǎng)液中，葡萄糖還會抑制早期胚胎的發(fā)育，因此，在SOF、CR1、CZB等主流培養(yǎng)液中均不含有葡萄糖。而丙酮酸和乳酸作為哺乳動物早期胚胎卵裂階段的主要供能物質(zhì)，在多數(shù)胚胎培養(yǎng)液中都有添加，是胚胎培養(yǎng)液中重要的添加物。有試驗(yàn)結(jié)果顯示，丙酮酸和乳酸是豬胚胎早期階段的首選能量底物［9］。有研究者認(rèn)為，在SOF培養(yǎng)液中加入葡萄糖是不必要的，會對桑椹胚發(fā)育產(chǎn)生不利影響，而丙酮酸鹽和乳酸能支持早期胚胎發(fā)育到桑椹胚階段［10］。但也有學(xué)者認(rèn)為葡萄糖對卵裂階段胚胎的發(fā)育有一定抑制作用，對桑椹胚以后的胚胎發(fā)育卻有一定促進(jìn)作用，而且早期胚胎雖不以葡萄糖為能量底物，但也存在于母體動物的輸卵管和子宮液中，因此，在早期胚胎體外發(fā)育中添加葡萄糖并非完全沒有必要［11］。

2.2 氨基酸

氨基酸是蛋白質(zhì)合成的前體和參與胚胎能量代謝的物質(zhì)，分為必需氨基酸（EAA）和非必需氨基酸（NEAA）。研究顯示，NEAA可以為早期胚胎提供營養(yǎng)物質(zhì)，并顯著提高早期胚胎的囊胚發(fā)育率［12］。在培養(yǎng)液中添加NEAA還能顯著提高許多動物胚胎的囊胚細(xì)胞數(shù)量，有利于早期胚胎的發(fā)育，但培養(yǎng)液中氨基酸的代謝產(chǎn)物胺對早期胚胎的發(fā)育有一定損害［13］，因此，在考慮培養(yǎng)液營養(yǎng)物質(zhì)供應(yīng)問題的同時也要注意添加量，盡量避免對早期胚胎的損傷［14］。許多研究表明，氨基酸是牛早期胚胎發(fā)育必不可少的，20種常見氨基酸能顯著提高牛羊的囊胚率［15］。 Fouda［16］研究發(fā)現(xiàn)，通過在TCM199中添加50 μL水平的EAA和NEAA可以改善兔4細(xì)胞和8細(xì)胞階段胚胎的發(fā)育能力，使其發(fā)育到囊胚期的成功率提高。N，N-二甲基甘氨酸能降低氧化應(yīng)激，改善牛胚胎的體外發(fā)育［17］。1.0 mmol/L甘氨酸能改善早期和晚期階段的胚胎發(fā)育，尤其是在早期階段更為顯著［18］。半胱氨酸和胱氨酸降低了由H2O2引起的氧張力，從而克服體外培養(yǎng)的山羊胚胎中的氧化應(yīng)激［19］。由于植入前哺乳動物胚胎的發(fā)育結(jié)果受周圍微環(huán)境直接調(diào)節(jié)，因此，不適當(dāng)?shù)陌被釢舛然虬被岣袘?yīng)機(jī)制的喪失可能是有害的，并且會影響胚胎的進(jìn)一步發(fā)育［20］。總之，氨基酸對動物早期胚胎的發(fā)育有利是顯而易見的，但對于在培養(yǎng)液中添加的氨基酸種類以及適宜的濃度仍需學(xué)者們進(jìn)一步研究。

2.3 抗氧化劑

在目前模擬體內(nèi)輸卵管及子宮的低氧環(huán)境的培養(yǎng)系統(tǒng)中，活性氧（ROS）被認(rèn)為是影響胚胎發(fā)育的一個重要因素。早期胚胎對氧化損傷十分敏感，且體外培養(yǎng)活性氧濃度較體內(nèi)發(fā)育環(huán)境高，降低早期胚胎體外培養(yǎng)過程中的活性氧濃度能使體外培養(yǎng)更貼近胚胎體內(nèi)發(fā)育的氧環(huán)境。在正常生理條件下，體內(nèi)胚胎發(fā)育受多種抗氧化物質(zhì)調(diào)控，使活性氧達(dá)到一個平衡狀態(tài)，如?；撬帷喤；撬帷C、過氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶、谷氨酰半胱氨酸合成酶等。在體外培養(yǎng)時，則需要添加抗氧化劑來降低活性氧濃度，以達(dá)到抗氧化損傷，使胚胎正常發(fā)育的目的。有研究表明，牛胚胎對氧化應(yīng)激是敏感的，添加含谷胱甘肽的培養(yǎng)基可以促進(jìn)體外胚胎發(fā)育［21-22］。除了谷胱甘肽以外，還有一些常見的天然抗氧化劑對體外胚胎發(fā)育的改善有利，比如VC和VE能清除自由基，保護(hù)細(xì)胞膜；番茄紅素能通過克服體外培養(yǎng)系統(tǒng)中的一些不利條件來提高囊胚質(zhì)量［23］；半胱氨酸能有效抑制NADPH氧化酶的活性，提高氧化損傷胚胎的抗氧化能力［24］。?；撬岵粌H能促進(jìn)胚胎的新陳代謝，抵抗K+濃度過高引起的損害，還具有較好的抗氧化作用。在培養(yǎng)液中添加?；撬崮苡行宄踝杂苫欣谂咛サ恼０l(fā)育［25］。有研究證實(shí)，在培養(yǎng)液中添加褪黑激素不僅可以達(dá)到抗細(xì)胞過氧化反應(yīng)的目的，還能夠克服早期胚胎的發(fā)育阻滯，提高體外胚胎的囊胚發(fā)育率及囊胚細(xì)胞數(shù)，提升囊胚質(zhì)量［26］。 乙酰左旋肉堿、N-乙酰-L-半胱氨酸和α-硫辛酸3種抗氧化劑的組合使小鼠囊胚細(xì)胞數(shù)顯著增加，并維持細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽水平，改善胚胎發(fā)育及生存能力［27］。有研究表明，體外培養(yǎng)環(huán)境中小鼠胚胎發(fā)育阻滯與合子基因組激活（ZGA）相關(guān)基因的表達(dá)有關(guān)，線粒體參與調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)ROS的動態(tài)平衡，從而對胚胎發(fā)育產(chǎn)生影響［28］。

2.4 蛋白質(zhì)及大分子物質(zhì)

一些蛋白質(zhì)及大分子物質(zhì)能供給胚胎營養(yǎng)，促進(jìn)細(xì)胞生長、增殖與分裂，對提高早期胚胎囊胚率有積極作用。血清的成分十分復(fù)雜，其中含有氨基酸、生長因子、維生素、激素、礦物質(zhì)及蛋白成分等多種早期胚胎所需的營養(yǎng)成分，因而對早期胚胎發(fā)育有重要作用，體現(xiàn)在保持細(xì)胞存活、促進(jìn)細(xì)胞生長、維持細(xì)胞pH值及滲透壓穩(wěn)定、保障細(xì)胞膜完整性等多個方面。目前，較為常用的蛋白源添加物有胎牛血清（FCS）、新生犢牛血清（NCS）、發(fā)情母牛血清（OCS）、閹公牛血清（SS）和牛血清白蛋白（BSA）［1］。但由于血清含有一些仍未確定的物質(zhì)，且血清產(chǎn)品易受到個體健康狀況等因素的影響，具有一定的不確定性，對胚胎的影響十分多元化，所以不利于研究培養(yǎng)液中某一具體成分對早期胚胎的影響。近年來，在研究某種具體成分對胚胎體外發(fā)育的影響時，無血清培養(yǎng)液受到人們的關(guān)注，但在生產(chǎn)實(shí)踐中，為了保證培養(yǎng)的效果和胚胎的質(zhì)量，人們?nèi)蕴砑友?。BSA是培養(yǎng)液中較為常用的一種蛋白源物質(zhì)，它能結(jié)合培養(yǎng)液中的一些胚胎毒性物質(zhì)，對胚胎起到保護(hù)作用。BSA對山羊體外受精卵具有一定的促卵裂作用，能夠提高早期胚胎囊胚率［12］。研究發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)液中添加生長因子有利于胚胎克服發(fā)育阻斷并提高胚胎的質(zhì)量。如添加表皮生長因子（EGF）的培養(yǎng)液能提高豬早期胚胎的囊胚發(fā)育率［29］，EGF還能促進(jìn)OXYS/lcgn株大鼠胚胎發(fā)育至胚泡階段［30］；適宜劑量的轉(zhuǎn)化生長因子TGF-β1可促進(jìn)小鼠胚胎著床和發(fā)育［31］；在體外培養(yǎng)期間補(bǔ)充胰島素樣生長因子IGF-1可保護(hù)牛胚胎免受甲萘醌的有害作用［32］。

2.5 其他成分

在早期胚胎培養(yǎng)液中，還有一些添加物也對胚胎發(fā)育具有積極作用。作為胚胎發(fā)育的調(diào)節(jié)因子，一定濃度的激素在適當(dāng)階段對胚胎發(fā)育有促進(jìn)作用。比如褪黑激素能夠促進(jìn)豬胚胎的體外發(fā)育［33］；胚胎培養(yǎng)液中較高水平的人絨毛膜促性腺激素（HCG）能提高人胚胎發(fā)育潛能［34］；Ghrelin 可以抑制促凋亡基因Bax的表達(dá)，促進(jìn)抗凋亡基因Bcl-2的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)綿羊早期胚胎的發(fā)育［35］。維生素在碳水化合物和氨基酸代謝過程中起重要作用，能促進(jìn)細(xì)胞對葡萄糖的攝取和乳糖的合成，進(jìn)而影響胚胎的發(fā)育。VK2能通過體外培養(yǎng)的牛胚胎線粒體恢復(fù)囊胚率［36］；VA的生理活性代謝物視黃酸（RA）通過核視黃酸受體（RARs）起作用，是胚胎發(fā)育過程中各器官系統(tǒng)形態(tài)的有效調(diào)節(jié)劑，也是成體組織穩(wěn)態(tài)所必需的［37］。 Gardner等［38］研究顯示，EDTA能抑制卵裂期胚胎的糖酵解活性，從而防止糖酵解的過早刺激從而促進(jìn)發(fā)育。然而，EDTA不應(yīng)該用于后期胚胎，因?yàn)樗鼤种铺墙徒?，降低囊胚期的能量產(chǎn)生并顯著抑制內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的發(fā)育。除此之外，有最新研究發(fā)現(xiàn)，添加L-肉堿能提高豬胚胎的發(fā)育能力和抗凍性［39］。而為了防止胚胎在體外培養(yǎng)過程中被細(xì)菌污染，添加適量的抗生素也是很重要的。青霉素是一種高效、低毒、應(yīng)用廣泛的重要抗生素，也是常用的胚胎培養(yǎng)液添加物，而作為微生物源殺細(xì)菌劑的鏈霉素同樣常被添加于胚胎培養(yǎng)液中。

3 胚胎培養(yǎng)體系的培養(yǎng)方式、方法

根據(jù)培養(yǎng)條件和需求的不同，胚胎的具體培養(yǎng)方法可分為常規(guī)培養(yǎng)系統(tǒng)、輸卵管離體培養(yǎng)以及與體細(xì)胞共培養(yǎng)3種。常規(guī)培養(yǎng)系統(tǒng)是將胚胎單獨(dú)在培養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)，而不添加其他細(xì)胞及其分泌因子的一種培養(yǎng)方法，分為微滴法和培養(yǎng)板法。前者是在塑料培養(yǎng)皿中制作30～100 μL的微滴，上面覆石蠟油，將胚胎置于其中培養(yǎng)，一般用于數(shù)量較少的胚胎培養(yǎng)；后者是直接將胚胎置于含500～800 μL培養(yǎng)液的四孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)，一般用于數(shù)量較多的胚胎培養(yǎng)。經(jīng)過胚胎培養(yǎng)液的不斷改進(jìn)和培養(yǎng)條件的逐步完善，該方法的效率和質(zhì)量有了很大的提高，因此，成為目前胚胎體外培養(yǎng)的主要方法。而輸卵管離體培養(yǎng)因較為煩瑣和胚胎發(fā)育率不高等原因較少被使用。與體細(xì)胞共培養(yǎng)法可以利用體細(xì)胞生長過程中產(chǎn)生的有益因子克服發(fā)育阻斷，從而促進(jìn)胚胎發(fā)育，但隨著培養(yǎng)液的不斷改良，實(shí)驗(yàn)室更傾向于使用常規(guī)培養(yǎng)系統(tǒng)［1］。研究表明，共培養(yǎng)對克服小鼠早期胚胎發(fā)育阻滯作用較為明顯，且輸卵管上皮細(xì)胞共培養(yǎng)的效果優(yōu)于卵丘細(xì)胞［40］。有研究者建立了小鼠早期胚胎與腫瘤細(xì)胞體外共培養(yǎng)模型，結(jié)果顯示，早期胚胎與腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)可顯著提高小鼠2細(xì)胞胚胎的體外發(fā)育效率［41］。近年來，雖然胚胎培養(yǎng)體系已從靜置的微滴法逐漸發(fā)展為效果更好的動態(tài)微流體培養(yǎng)，但動態(tài)培養(yǎng)體系操作較為復(fù)雜，限制了其廣泛應(yīng)用，而靜置培養(yǎng)體系則因培養(yǎng)效果穩(wěn)定、易操作而一直占據(jù)主導(dǎo)地位，其中微滴法是目前最常用的培養(yǎng)方法［42］。

4 展望

近年來，隨著豬、牛、羊等家畜的胚胎工程技術(shù)的不斷進(jìn)步，促進(jìn)了畜牧業(yè)的蓬勃發(fā)展，為人類胚胎工程技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展打下了堅實(shí)的基礎(chǔ)。通過進(jìn)一步完善培養(yǎng)液、改良培養(yǎng)系統(tǒng)以及根據(jù)胚胎的不同發(fā)育階段設(shè)計不同培養(yǎng)液等方法，以期使體外培養(yǎng)環(huán)境更接近體內(nèi)發(fā)育環(huán)境，解決由于脫離母體環(huán)境導(dǎo)致的一些問題，比如胚胎體外培養(yǎng)較體內(nèi)發(fā)育質(zhì)量差，卵裂球不夠緊湊且質(zhì)量不佳，囊胚率不高，移植后妊娠率不高等。相信隨著科技的不斷進(jìn)步和相關(guān)學(xué)者的研究，目前動物胚胎體外培養(yǎng)存在的上述問題都將得到解決。

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