兒童急性淋巴細(xì)胞白血病復(fù)發(fā)相關(guān)基因突變的研究進(jìn)展

曾 星綜述，于 潔審校（重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院，重慶400013）

兒童急性淋巴細(xì)胞白血?。ˋLL）是兒童最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一。隨著大劑量聯(lián)合化療方案的不斷改進(jìn)，對(duì)危險(xiǎn)因素的認(rèn)識(shí)不斷深入，基于危險(xiǎn)因素的分層化療的實(shí)施，以及支持治療保障的提高，兒童ALL治療效果得到了顯著提高。發(fā)達(dá)國(guó)家兒童ALL的5年生存率可達(dá)90%以上，但仍有8%～20%患兒復(fù)發(fā)。ALL患兒首次復(fù)發(fā)后即使采取積極的增強(qiáng)化療及異基因造血干細(xì)胞移植治療，僅有少數(shù)患兒可以得到長(zhǎng)期生存[1]。疾病復(fù)發(fā)已成為制約兒童ALL預(yù)后的關(guān)鍵難題。隨著高通量基因檢測(cè)技術(shù)的廣泛應(yīng)用，多種與白血病復(fù)發(fā)相關(guān)的基因變異被相繼發(fā)現(xiàn)，主要涉及淋系分化調(diào)控、表觀遺傳修飾、核酸代謝、細(xì)胞周期調(diào)控等多種重要信號(hào)途徑，這些基因異常增強(qiáng)了白血病細(xì)胞的增殖和抗凋亡能力，對(duì)關(guān)鍵化療藥物產(chǎn)生耐藥，進(jìn)而導(dǎo)致復(fù)發(fā)。本文就近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的與兒童ALL復(fù)發(fā)相關(guān)的基因進(jìn)行綜述。

1 與淋系分化調(diào)控相關(guān)基因

1.1 IKZF1基因 IKZF1基因位于7p12，其編碼的蛋白為Ikaros，是一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，其可以通過(guò)N端的DNA結(jié)合區(qū)域與靶基因的特異序列結(jié)合，從而激活或抑制靶基因的表達(dá)，參與早期淋巴細(xì)胞分化、成熟[2]。IKZF1基因缺失導(dǎo)致Ikaros單倍體不足或顯性負(fù)相亞型（DN型）過(guò)度表達(dá)，是導(dǎo)致兒童ALL早期復(fù)發(fā)的重要原因之一。IKZF1基因缺失在BCR-ABL陽(yáng)性的B-ALL患兒中最為常見(jiàn)，且BCR-ABL陽(yáng)性患兒若合并IKZF1缺失，則表現(xiàn)出對(duì)伊馬替尼不敏感，在BCR-ABL陰性ALL患兒中也表現(xiàn)為酪氨酸激酶持續(xù)激活，呈類BCRABL樣特征，對(duì)化療反應(yīng)差，難以達(dá)到完全緩解，且復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)高[3-4]。在歐洲癌癥研究與治療組織的多中心研究中，對(duì)1 223例BCR-ABL陰性兒童進(jìn)行測(cè)序分析，其中179例（14.6%）患兒檢測(cè)到IKZF1缺失，且以B-ALL患兒最為常見(jiàn)，臨床特征為年長(zhǎng)、白細(xì)胞水平高、對(duì)化療反應(yīng)差、微小殘留病（MRD）水平高、復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)高，且多與iAMP21、MLL重排、低倍體等已知預(yù)后不良因素明顯相關(guān)，多因素COX回歸分析顯示，IKZF1缺失是兒童ALL的一項(xiàng)獨(dú)立預(yù)后因素[5]。在BCR-ABL陽(yáng)性ALL患兒中，IKZF1基因缺失率超過(guò)70%[6-7]，因?yàn)锽CR-ABL陽(yáng)性本身即是已知的對(duì)預(yù)后不良的重要危險(xiǎn)因素。且自20世紀(jì)中葉以來(lái)，酪氨酸激酶抑制劑（TKIs）的應(yīng)用使得BCR-ABL陽(yáng)性患兒預(yù)后得到明顯改善。為避免TKIs的應(yīng)用影響IKZF1基因缺失對(duì)預(yù)后的判斷，VAN[6]等研究應(yīng)用TIKs治療，結(jié)果顯示，在BCR-ABL陽(yáng)性ALL患兒中，含有IKZF1基因缺失患兒仍預(yù)后不良，且多在早期復(fù)發(fā)，其是1項(xiàng)獨(dú)立的預(yù)后不良因素，可作為分層化療的依據(jù)。

1.2 酪氨酸蛋白激酶-2（JAK2）與細(xì)胞因子受體樣因子2（CRLF2）基因

1.2.1 JAK基因 JAK基因是一類非受體酪氨酸激酶家族，包括 JAK1、JAK2、JAK3 和 TYK1，可被細(xì)胞因子受體激活，活化的JAK催化受體上的酪氨酸殘基發(fā)生磷酸化，進(jìn)而磷酸化激活信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)導(dǎo)激活因子（STAT），磷酸化后的STAT轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，參與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)，即JAK-STAT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[8]。JAK-STAT信號(hào)通路參與多種生理調(diào)節(jié)過(guò)程，涉及細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化，造血及免疫功能等，JAK突變導(dǎo)致JAKSTAT信號(hào)通路持續(xù)激活，導(dǎo)致造血細(xì)胞的過(guò)度增殖、分化受抑，是導(dǎo)致白血病發(fā)生、復(fù)發(fā)的主要原因之一[9]。MULLIGHAN等[10]對(duì)187例BCR-ABL陰性高危ALL患兒進(jìn)行JAK基因檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)約10.7%的患兒存在JAK基因突變，JAK突變陽(yáng)性患兒4年累積復(fù)發(fā)率為33.3%，高于JAK突變陰性患兒的復(fù)發(fā)率23.2%，提示JAK突變與復(fù)發(fā)相關(guān)。STEEGHS等[11]對(duì)461例B-ALL患兒分析發(fā)現(xiàn)，JAK2畸變組預(yù)后較無(wú)JAK2畸變組差，16例含有JAK2突變：6例復(fù)發(fā)，9例有MRD監(jiān)測(cè)，其中4例在D19/33有較高的MRD水平，且均復(fù)發(fā)；剩余5例中MRD呈低水平，但其中2例在診斷后2.4年內(nèi)復(fù)發(fā)，且這2例在初診時(shí)因年齡大于10歲及初診時(shí)白細(xì)胞數(shù)大于50而歸于高危組。以上研究均提示JAK2突變與復(fù)發(fā)相關(guān)且預(yù)后不良。

1.2.2 CRLF2基因 CRLF2基因與白細(xì)胞介素-7受體α形成異二聚體受體，是一種細(xì)胞因子受體，與配體TSLP結(jié)合后可激活下游JAK-STAT信號(hào)通路[3]。CRLF2基因重排形成P2RY8/CRLF2和IGH/CRLF2，可導(dǎo)致CRLF2蛋白過(guò)度表達(dá)，與JAK2基因突變共同作用使JAK-STAT信號(hào)通路持續(xù)活化，影響細(xì)胞增殖、分化，與白血病復(fù)發(fā)及不良預(yù)后相關(guān)[12]。HARVEY等[13]對(duì)207例高危B-ALL患兒的基因檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，29例（14%）患兒CRLF2呈高表達(dá)，其中18例為IGH/CRLF2，10例為P2RY8/CRLF2，1例同時(shí)含有以上2種CRLF2重排，且CRLF2高表達(dá)患兒4年無(wú)復(fù)發(fā)生存率（EFS）為35.3%，顯著低于無(wú)CRLF2重排的患兒（71.3%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。多項(xiàng)研究表明，CRLF2改變常與JAK基因突變及IKZF1相伴發(fā)生，三者共同作用導(dǎo)致JAKSTAT通路持續(xù)激活，影響正常淋巴細(xì)胞發(fā)育，與ALL復(fù)發(fā)及不良預(yù)后相關(guān)[3，14]。

2 與表觀遺傳學(xué)修飾相關(guān)基因

2.1 CREBBP基因 CREBBP基因編碼的環(huán)腺苷酸反應(yīng)元件結(jié)合蛋白是一種轉(zhuǎn)錄輔激活因子，含有組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶（HAT）結(jié)構(gòu)域，具有HAT活性。CREBBP基因突變或缺失導(dǎo)致其組蛋白乙?；芰p弱和靶基因轉(zhuǎn)錄受抑制，從而影響CREBBP對(duì)靶基因（即糖皮質(zhì)激素受體反應(yīng)相關(guān)基因）的轉(zhuǎn)錄調(diào)控能力，進(jìn)而導(dǎo)致激素耐藥、疾病復(fù)發(fā)[15]。CREBBP的純合缺失在小鼠模型中表現(xiàn)為嚴(yán)重的發(fā)育異常，CREBBP+/-的小鼠則表現(xiàn)為B細(xì)胞發(fā)育缺陷，其血液腫瘤的發(fā)病率也顯著增加，約20%復(fù)發(fā)ALL患兒中可見(jiàn)CREBBP基因的突變或缺失，且以高2倍體復(fù)發(fā)患兒最為常見(jiàn)[16]。INTHAL等[16]對(duì)341例ALL患兒進(jìn)行基因測(cè)序分析，71例ALL患兒復(fù)發(fā)，其中13例（18.3%）攜帶CREBBP基因突變，而在緩解患兒中僅0.7%檢出突變，提示CREBBP基因與復(fù)發(fā)相關(guān)。INTHAL等[16]檢測(cè)1組含有野生型或CREBBP突變型的T淋巴細(xì)胞株對(duì)地塞米松和乙酰化酶抑制劑（伏立諾他）的反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)大部分細(xì)胞對(duì)地塞米松耐藥，而對(duì)伏立諾他（有效濃度IC50小于1 μm）敏感，可見(jiàn)CREBBP突變削弱了組蛋白乙?；饔?，進(jìn)而影響糖皮質(zhì)激素受體反應(yīng)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄、表達(dá)，導(dǎo)致對(duì)糖皮質(zhì)激素耐藥，而去乙?；敢种苿┓⒅Z他對(duì)部分激素耐藥的ALL患兒有效，更進(jìn)一步佐證了該觀點(diǎn)。

2.2 混合譜系白血病基因（MLL） MLL也稱KMT2A，位于11q23，其編碼蛋白質(zhì)是一個(gè)由3 969個(gè)氨基酸組成的多結(jié)構(gòu)域蛋白，各結(jié)構(gòu)域具有不同功能，其中C端末端的SET結(jié)構(gòu)域是主要的催化結(jié)構(gòu)域，也是大多數(shù)組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶都具有保守催化結(jié)構(gòu)域[17]及組蛋白H3K4甲基化酶功能[18]。大部分MLL易位重排后，其編碼的融合蛋白保留了N端的AT鉤結(jié)構(gòu)域、SNL結(jié)構(gòu)域和RD結(jié)構(gòu)域，而C端的PHD結(jié)構(gòu)域、TA結(jié)構(gòu)域和SET結(jié)構(gòu)域丟失。因此，MLL融合蛋白失去了組蛋白甲基化能力，進(jìn)而影響其對(duì)下游靶基因（HOX基因家族）轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)[18]。有研究表明，MLL重排常見(jiàn)于嬰兒ALL，其預(yù)后極差，5年EFS僅為20%～40%，容易早期復(fù)發(fā)，即使采取高強(qiáng)度化療及移植仍不能改善預(yù)后[19-20]。MLL重排患兒其甲基化程度與復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)呈正相關(guān)，而去甲基化藥物如地西他濱等對(duì)有MLL重排的白血病細(xì)胞治療有效，提示MLL重排導(dǎo)致組蛋白甲基化異常與ALL患兒復(fù)發(fā)相關(guān)[21]。

2.3 糖皮質(zhì)激素受體基因（NR3C1）與B細(xì)胞易位基因1（BTG1） 糖皮質(zhì)激素作為最重要的化療藥物之一，通過(guò)與糖皮質(zhì)激素受體GR結(jié)合，形成GR-GC復(fù)合物進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，與靶基因能結(jié)合有效的介導(dǎo)白血病細(xì)胞凋亡，其耐藥與白血病復(fù)發(fā)密切相關(guān)。NR3C1基因編碼糖皮質(zhì)激素受體，該基因缺失使糖皮質(zhì)激素受體表達(dá)下降，機(jī)體對(duì)糖皮質(zhì)激素反應(yīng)降低，進(jìn)而導(dǎo)致激素耐藥、復(fù)發(fā)。雖有研究報(bào)道，NR3C1基因缺失為復(fù)發(fā)特異性基因，但該基因突變多發(fā)生在體外細(xì)胞株，在患者標(biāo)本中很少發(fā)現(xiàn)，提示其不是糖皮質(zhì)激素耐藥的主要機(jī)制[22]。有研究表明，10%～14%的復(fù)發(fā)患兒可檢出BTG1和TBL1XR1缺失，且與糖皮質(zhì)激素耐藥相關(guān)[23]。BTG1蛋白是糖皮質(zhì)激素受體的輔激活物，可與精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶（PRMT1）形成BTG1/PRMT1復(fù)合體，結(jié)合至糖皮質(zhì)激素受體基因啟動(dòng)子區(qū)，調(diào)控糖皮質(zhì)激素受體的表達(dá)。BTG-1基因突變或缺失導(dǎo)致BTG-1蛋白生成減少，可減少激素受體的表達(dá)而導(dǎo)致糖皮質(zhì)激素耐藥，上調(diào)BTG-1基因的表達(dá)則可以重建藥物敏感性。因此，BTG1基因突變與激素耐藥相關(guān)，進(jìn)而導(dǎo)致復(fù)發(fā)[24]。

3 與核酸代謝系相關(guān)基因

3.1 NT5C2基因 MEYER等[25]對(duì)10例復(fù)發(fā)B-ALL患兒進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序發(fā)現(xiàn)，2例患兒包含有同一基因NT5C2突變，對(duì)另外61例復(fù)發(fā)的ALL患兒進(jìn)行全外顯子測(cè)序發(fā)現(xiàn)，5例患兒包含NT5C2突變。在臨床表現(xiàn)上，所有包含NT5C2基因突變的患兒均在早期復(fù)發(fā)（初診后36個(gè)月內(nèi)復(fù)發(fā)）。TZONEVA等[26]研究發(fā)現(xiàn)，3%（1/35）的B-ALL復(fù)發(fā)患兒及19%（20/103）的T-ALL復(fù)發(fā)患兒含有NT5C2基因突變，且攜帶有該突變對(duì)的患兒對(duì)核苷類似物化療耐藥。以上研究均提示，NT5C2基因突變與復(fù)發(fā)相關(guān)。NT5C2基因編碼5'-核苷酸酶（cN-Ⅱ）蛋白，分布于細(xì)胞質(zhì)中，參與調(diào)節(jié)和穩(wěn)定核苷酸庫(kù)，維持細(xì)胞的正常生理功能[27]。cN-Ⅱ能從5'端水解單磷酸核苷酸[次黃嘌呤核苷酸和單磷酸腺苷（AMP）]，同時(shí)對(duì)單磷酸化核酸如次黃嘌呤、抗腫瘤核苷類似物具有去磷酸化作用，參與核苷類似物在細(xì)胞內(nèi)的代謝過(guò)程[28]。6-巰嘌呤（6-MP）、6-巰鳥(niǎo)嘌呤等核苷類似物進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)必須經(jīng)激酶磷酸化，才能進(jìn)一步生成活性代謝產(chǎn)物發(fā)揮細(xì)胞毒性，但是磷酸化的核苷類似物可能作為cN-Ⅱ的底物被降解，從而降低其活性代謝產(chǎn)物的濃度。NT5C2突變患兒使cN-Ⅱ去磷酸化活性增強(qiáng)，導(dǎo)致6-MP及6-巰鳥(niǎo)嘌呤耐藥，是導(dǎo)致白血病復(fù)發(fā)的重要原因之一[29]。

3.2 磷酸核糖焦磷酸合成酶1（PRPS1）基因 LI等[30]對(duì)16對(duì)初發(fā)、緩解、復(fù)發(fā)的B-ALL患兒進(jìn)行全外顯子測(cè)序發(fā)現(xiàn)，PRPS1突變?yōu)閺?fù)發(fā)特征性突變，且所有突變患兒均早期復(fù)發(fā)。PRPS1基因編碼磷酸核糖焦磷酸合成酶（PRS），是嘌呤生物合成中第一個(gè)限速酶，可催化三磷酸腺苷和5-磷酸核糖的反應(yīng)，生成AMP和5-磷酸核糖-l-焦磷酸。在正常細(xì)胞中，由于反饋抑制作用，PRPS1處于較低水平。在PRPS1突變患兒中，該基因突變使核苷酸對(duì)PRPS1活性的負(fù)反饋抑制作用減弱，導(dǎo)致嘌呤從頭合成持續(xù)激活，產(chǎn)生次黃嘌呤堆積，從而競(jìng)爭(zhēng)性抑制6-MP轉(zhuǎn)化為具有細(xì)胞毒性的巰鳥(niǎo)嘌呤核苷酸，導(dǎo)致其耐藥[31]。對(duì)編碼嘌呤從頭合成特異性酶的基因進(jìn)行基因敲除，或使用抑制嘌呤從頭合成代謝藥物（如洛美曲索）[32]，均可逆轉(zhuǎn)含有PRPS1基因突變的細(xì)胞的巰嘌呤耐藥。

4 與細(xì)胞周期相關(guān)基因

細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑2A/2B（CDKN2A/B）位于9p21，是屬于細(xì)胞周期依賴性酶抑制因子基因家族，CDKN2A編碼2種蛋白質(zhì)：一是細(xì)胞周期依賴性激酶抑制蛋白P16（p16INK4a），二為其可變閱讀框基因產(chǎn)物 P14（P14ARF）[32]。CDKN2B 編碼另一個(gè)細(xì)胞周期蛋白依賴激酶抑制蛋白 P15（p15INK4B）[33]。正常情況下，p15INK4B/p16INK4a與細(xì)胞周期蛋白競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合細(xì)胞周期蛋白依賴蛋白激酶（CDK4/6），抑制CDK4/6激酶活性，而使視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白（pRb）無(wú)法磷酸化，阻止細(xì)胞進(jìn)入S期及DNA的合成啟動(dòng)，繼而抑制細(xì)胞增殖；同時(shí)，高磷酸化的pRb可誘導(dǎo)p15INK4B/p16INK4a表達(dá)，進(jìn)而反饋性抑制Rb蛋白磷酸化。因此，p16、p15在細(xì)胞周期調(diào)節(jié)途徑p15INK4B/p16INK4a-CDK4/6-pRb-E2F中起負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用，二者異常則會(huì)引發(fā)細(xì)胞增殖失控，導(dǎo)致腫瘤發(fā)生。CDKN2A編碼的另一種蛋白P14ARF可與E3泛素蛋白連接酶（mdm2）結(jié)合，從而減弱mdm2介導(dǎo)的P53降解作用。當(dāng)CDKN2A突變導(dǎo)致P14AR不能和mdm2結(jié)合引發(fā)mdm2降解P53，從而誘發(fā)腫瘤。CDKN2A基因缺失、突變、甲基化已證明與多種造血系統(tǒng)腫瘤相關(guān)，其中CDKN2A基因缺失最常見(jiàn)[34]。XU等[35]研究發(fā)現(xiàn)，215例成人B-ALL中，CDKN2A缺失率為28.4%，而復(fù)發(fā)患者中其缺失顯著升高，為44.6%（P=0.006），可見(jiàn)CDKN2A基因缺失與ALL復(fù)發(fā)顯著相關(guān)，而CDKN2A/B在兒童白血病中的作用仍存有爭(zhēng)議。MAUDE等[9]對(duì)204例納入ALL-REZ BMF2002方案化療的患兒進(jìn)行測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)，超過(guò)90%的復(fù)發(fā)ALL患兒含有CDKN2A/B基因缺失，復(fù)發(fā)多為早期或極早期復(fù)發(fā)，且二次復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)較高，但其潛在當(dāng)量因子和pOS無(wú)顯著差異，通過(guò)MRD評(píng)價(jià)其對(duì)化療的反應(yīng)來(lái)看，CDKN2A/B基因缺失患兒對(duì)化療敏感，容易達(dá)到二次緩解。因此，即使CDKN2A/B基因缺失與早期復(fù)發(fā)相關(guān)，但其通過(guò)化療后容易再次緩解，CDKN2A基因突變與否都與其最終預(yù)后無(wú)顯著相關(guān)。

5 小 結(jié)

綜上所述，兒童ALL的復(fù)發(fā)受到多種基因功能缺陷影響，涉及淋系分化調(diào)控、表觀遺傳學(xué)修飾、核酸代謝、細(xì)胞周期調(diào)控等多個(gè)途徑，各基因之間并非完全獨(dú)立，他們相互作用、疊加，其機(jī)制異常復(fù)雜，目前尚無(wú)統(tǒng)一的認(rèn)識(shí)。對(duì)復(fù)發(fā)分子機(jī)制的深入認(rèn)識(shí)，有助于研究人員更為精準(zhǔn)地進(jìn)行危險(xiǎn)度分層、判斷預(yù)后，并為分子靶向藥物的研發(fā)及應(yīng)用提供依據(jù)。