全人源單克隆抗體制備技術(shù)的研究進(jìn)展

唐亞華綜述，胡慧明，朱美玲審校（南華大學(xué)附屬南華醫(yī)院：.藥學(xué)部；2.內(nèi)分泌科，湖南衡陽(yáng)42002）

1975年，KOHLER等[1]通過(guò)雜交瘤技術(shù)成功獲得了具有抗原特異性的鼠源性單克隆抗體，從而開(kāi)啟了單克隆抗體開(kāi)發(fā)的新紀(jì)元。單克隆抗體具有專一性高、親和力強(qiáng)等特點(diǎn)，已成為多種人類疾病診斷及治療的重要工具。然而，鼠源性抗體在臨床應(yīng)用方面存在諸多缺陷。鼠源單抗應(yīng)用至人體時(shí)，由于其來(lái)源于小鼠，具有免疫源性，會(huì)激活人體免疫系統(tǒng)，從而生成人抗鼠抗體，引發(fā)免疫損傷；鼠源單抗激活補(bǔ)體和Fc受體相關(guān)生物效應(yīng)系統(tǒng)的特異性存在不足[2]。為了解決上述鼠源單抗存在的缺陷，科研工作者先后改造形成了嵌合型抗體和人源化抗體，但二者仍舊無(wú)法完全消除鼠源單抗的免疫源性，對(duì)臨床療效的改善依然有限[3]。為了進(jìn)一步減少抗體的免疫原性，提高其臨床療效，研究者不斷探索制備全人源抗體的新方法。全人源抗體是指完全由人類抗體基因編碼而成的抗體，其免疫原性小、臨床效果好，是未來(lái)單克隆抗體的主要發(fā)展方向[4]。目前，制備全人源抗體主要有噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)、轉(zhuǎn)基因小鼠技術(shù)及單個(gè)B細(xì)胞抗體制備技術(shù)。本文將對(duì)以上3種應(yīng)用廣泛的全人源單克隆抗體制備技術(shù)做一簡(jiǎn)要綜述。

1 噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)

1990年MCCAFFERTY等[5]首次成功將抗體片段在噬菌體表面展示，經(jīng)過(guò)20多年的發(fā)展，噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)成為迄今最成熟、應(yīng)用最廣泛的抗體庫(kù)技術(shù)之一。噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)的基本原理是：應(yīng)用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）技術(shù)擴(kuò)增全套人抗體編碼基因序列，經(jīng)酶切后將抗體DNA序列插入噬菌體編碼外殼蛋白結(jié)構(gòu)基因的適當(dāng)位置，建立噬菌體抗體文庫(kù)，使抗體與噬菌體外殼蛋白相融合，并以融合蛋白的形式展示于噬菌體表面。將構(gòu)建好的噬菌體抗體庫(kù)與目的抗原結(jié)合，通過(guò)抗原抗體特異性結(jié)合的原理，應(yīng)用合適的篩選途徑，將不能與目的抗原相結(jié)合的噬菌體洗脫，篩選出能與目的抗原特異性結(jié)合的噬菌體。再通過(guò)對(duì)目的噬菌體DNA測(cè)序，得到抗原特異性的人抗體基因序列，最終利用基因工程技術(shù)制備特異性全人源抗體[6]。

目前，利用該技術(shù)已成功構(gòu)建了多個(gè)不同類型的scFv、Fab和sdAb抗體庫(kù)并以此生產(chǎn)出多個(gè)應(yīng)用于臨床的全人源單克隆抗體[7]。噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)具有基因型和表型統(tǒng)一、篩選抗體周期短（最快只需1周）、篩選容量大等特點(diǎn)，理論上能夠分離得到幾乎所有抗原的特異性全人源抗體。然而，從噬菌體抗體庫(kù)獲得的抗體親和力普遍較低，難以用于臨床治療。近年來(lái)，科研工作者通過(guò)創(chuàng)新優(yōu)化篩選過(guò)程、增加靶抗原多樣性等方法提高抗體的親和力；利用易錯(cuò)PCR、DNA改組及基因深度測(cè)序等技術(shù)增加抗體庫(kù)的庫(kù)容和多樣性，為噬菌體全人源抗體的廣泛應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。截至2014年，美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）總共批準(zhǔn)了6個(gè)通過(guò)噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)生產(chǎn)的抗體投入市場(chǎng)，同時(shí)還有30多種利用此技術(shù)生產(chǎn)的抗體藥物正處于各級(jí)臨床試驗(yàn)階段[6]。

2 轉(zhuǎn)基因小鼠技術(shù)

1989年BRUGGEMANN等[8]首次將人IgH基因座轉(zhuǎn)入小鼠體內(nèi)，引起基因重排并表達(dá)IgM，證明了利用轉(zhuǎn)基因小鼠制備人類抗體的可能性。隨后科學(xué)家通過(guò)酵母人工染色體技術(shù)以及基因敲除技術(shù)成功構(gòu)建了全人源抗體轉(zhuǎn)基因小鼠，并將其公司化產(chǎn)業(yè)化，從而極大地推動(dòng)了治療性抗體市場(chǎng)化的蓬勃發(fā)展。轉(zhuǎn)基因小鼠技術(shù)的基本原理是：應(yīng)用相關(guān)基因工程技術(shù)破壞小鼠內(nèi)源抗體基因，然后將人抗體基因轉(zhuǎn)入小鼠體內(nèi)，再將目標(biāo)抗原免疫轉(zhuǎn)基因小鼠，從而在其體內(nèi)表達(dá)相應(yīng)的抗體。該技術(shù)讓抗原抗體免疫反應(yīng)在小鼠體內(nèi)進(jìn)行，因此，保證了抗體類別轉(zhuǎn)換的完整性、抗體克隆選擇的多樣性及抗體親和力成熟的自然機(jī)理，如發(fā)生骨髓的抗體基因重排、淋巴結(jié)生發(fā)中心抗原誘導(dǎo)體細(xì)胞高頻突變等，從而使通過(guò)該技術(shù)所得到的抗體具有良好的親和性、穩(wěn)定性和可溶性等。

目前，人們已經(jīng)研發(fā)出微基因座、人工染色體及轉(zhuǎn)染色體3代轉(zhuǎn)基因小鼠制備技術(shù)，并通過(guò)這3類轉(zhuǎn)基因小鼠成功生產(chǎn)出治療銀屑病、黑色素瘤、高膽固醇血癥等多種疾病的全人源單克隆抗體[9]。但是，由于人和小鼠之間免疫系統(tǒng)組成存在差異，如何通過(guò)轉(zhuǎn)基因小鼠獲得更接近人體天然產(chǎn)生的抗體結(jié)構(gòu)，仍然是研究者追求的目標(biāo)。

3 單個(gè)B細(xì)胞抗體制備技術(shù)

單個(gè)B細(xì)胞制備全人源抗體的基本原理是：從人外周血、骨髓等來(lái)源分選B細(xì)胞，將單個(gè)B細(xì)胞分至盛有適量細(xì)胞裂解液、RNA酶抑制劑的適當(dāng)容器中，以此為模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄PCR擴(kuò)增抗體基因序列?？寺≈吝m當(dāng)載體通過(guò)測(cè)序，分析評(píng)價(jià)插入、缺失和突變情況；再通過(guò)重疊延伸PCR方法將抗體基因片段連接成scFv、scAb、Fab等形式，酶切將其連接至原核或真核載體內(nèi)，在相應(yīng)的系統(tǒng)中表達(dá)、純化得到全人源抗體，最終用目的抗原篩選和鑒定抗體的特異性、親和力等生物學(xué)特性。該技術(shù)保留了輕重鏈可變區(qū)的天然配對(duì)，具有基因多樣性好、效率高、所需細(xì)胞量少等優(yōu)勢(shì)[10]。但在實(shí)際應(yīng)用過(guò)程中，B細(xì)胞分選技術(shù)和后續(xù)PCR基因擴(kuò)增技術(shù)是制約單個(gè)B細(xì)胞抗體制備技術(shù)應(yīng)用的重要因素。

根據(jù)研究目的不同，單個(gè)B細(xì)胞分選方式分為隨機(jī)分選和抗原特異性分選，樣本來(lái)源包括外周血、淋巴組織及骨髓。單個(gè)B細(xì)胞的隨機(jī)分選主要有顯微鏡挑選法[11]、激光捕獲顯微切割法[12]及熒光激活細(xì)胞分選法[13-14]。熒光激活細(xì)胞分選法以熒光劑和流式分選儀為基礎(chǔ)，能夠自動(dòng)化分選單個(gè)B細(xì)胞，具有速度快、精確度高的優(yōu)點(diǎn)，因此應(yīng)用最為廣泛。抗原特異性單個(gè)B細(xì)胞分選方法主要包括抗原標(biāo)記磁珠分選法[15]、多參數(shù)熒光標(biāo)記細(xì)胞分選法[16-17]及微陣列芯片法[18-19]。微陣列芯片法是將芯片表面制作許多小孔，每個(gè)小孔中只能容納一個(gè)B細(xì)胞，隨后用熒光標(biāo)記的目標(biāo)抗原識(shí)別特異性抗體，進(jìn)而將檢測(cè)到的能夠分泌目標(biāo)抗原特異性抗體的B細(xì)胞從小孔內(nèi)轉(zhuǎn)移至適當(dāng)容器中進(jìn)行后續(xù)操作。該技術(shù)具有高通量、效率高等優(yōu)點(diǎn)，是目前分選單個(gè)B細(xì)胞技術(shù)中最先進(jìn)、有效的方法之一。

由于抗體可變區(qū)基因序列的未知性，因此合理的引物序列在單個(gè)B細(xì)胞技術(shù)中至關(guān)重要，要求引物具有靈敏性、特異性，既能夠避免非特異性擴(kuò)增又能夠有效地?cái)U(kuò)增出完整的抗體基因序列。通常針對(duì)抗體重鏈輕鏈可變區(qū)不同前導(dǎo)序列設(shè)計(jì)前向引物混合物，反向引物特異性互補(bǔ)于抗體恒定區(qū)[10，20]。雖然基于混合引物的擴(kuò)增方法已被證實(shí)能夠擴(kuò)增出部分抗體序列，但在引物多樣性、擴(kuò)增效率、特異性和抗體表達(dá)譜的還原等問(wèn)題上仍需要改進(jìn)[10]。OZAWA等[21]利用5'RACE技術(shù)，更加特異性地?cái)U(kuò)增出目的抗體可變區(qū)基因序列。此項(xiàng)技術(shù)在抗體基因多樣性方面相比于前向引物混合物PCR方法具有優(yōu)勢(shì)，且此過(guò)程無(wú)須純化PCR產(chǎn)物、省略了復(fù)雜的前向引物混合物，大大簡(jiǎn)化了反應(yīng)體系[22-23]。

隨著基于單細(xì)胞的抗體制備技術(shù)的不斷開(kāi)發(fā)和完善，通過(guò)該技術(shù)所產(chǎn)生的抗體具有全人源、高度抗原特異性和親和力高等優(yōu)勢(shì)，單個(gè)B細(xì)胞抗體制備技術(shù)已逐漸成為單克隆抗體制備的主要技術(shù)[24]。但該技術(shù)還存在著諸如無(wú)法更高效地獲取特殊抗原特異性的B淋巴細(xì)胞，無(wú)法更準(zhǔn)確地制備抗體結(jié)合的單抗表位，無(wú)法提高所得到抗體的作用寬度等局限性。相信隨著相關(guān)技術(shù)的優(yōu)化和開(kāi)發(fā)，單個(gè)B細(xì)胞抗體制備技術(shù)將得到進(jìn)一步的發(fā)展和成熟，所制備的單克隆抗體也將在疾病的治療、預(yù)防等方面具有無(wú)限的應(yīng)用前景。

4 全人源單克隆抗體展望分析

自1986年美國(guó)FDA批準(zhǔn)第一個(gè)治療性單克隆進(jìn)入臨床以來(lái)，治療性抗體發(fā)展迅速，截至2017年8月，F(xiàn)DA累計(jì)批準(zhǔn)了69個(gè)治療性抗體藥物，其治療范圍包括腫瘤、免疫相關(guān)疾病（器官移植、自身免疫性疾?。┘案腥拘约膊〉龋渲腥嗽磫慰寺】贵w和人源化單克隆抗體已成主流[25-26]。雖然全人源單克隆抗體在保持親和力、中和性及減少免疫源性方面與人源化單克隆抗體相比取得了顯著成效，但由于人們對(duì)于抗體效應(yīng)機(jī)制和機(jī)體免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)機(jī)制方面了解依然有限，全人源單克隆抗體的生產(chǎn)還存在著很多局限。隨著相關(guān)研究的深入和技術(shù)的發(fā)展，全人源單克隆抗體的生產(chǎn)必將更加豐富多樣，相關(guān)技術(shù)也將更加的先進(jìn)和完善，越來(lái)越多的全人源單克隆抗體一定能夠在人類疾病診斷和治療領(lǐng)域發(fā)揮至關(guān)重要的作用。