血吸蟲病現(xiàn)代診斷技術(shù)的研究現(xiàn)狀

陳海霞 李家萌 孔玉方

(濟(jì)寧市第一人民醫(yī)院，山東濟(jì)寧 272100)

血吸蟲病(schistosomiasis)是一種嚴(yán)重危害人民身體健康和生命安全、影響流行區(qū)社會經(jīng)濟(jì)發(fā)展的人獸共患寄生蟲病。據(jù)報(bào)道，2014年，全國推算血吸蟲病人115 614人，現(xiàn)存晚期血吸蟲病30 880例(Leietal.，2015)。湖南、湖北、安徽、江西、江蘇等省血吸蟲病的流行情況調(diào)查表明在局部地區(qū)血吸蟲病傳播風(fēng)險仍然較大(韓陽清等，2014；肖瑛等，2014；張世清等，2015)。

血吸蟲病是一種與社會、自然環(huán)境密切相關(guān)的疾病。目前，其流行特點(diǎn)是以低度感染為主，傳統(tǒng)的診斷技術(shù)對早期感染血吸蟲的患者敏感性不高，導(dǎo)致血吸蟲病的漏診誤診率極高，成為了臨床疑難雜癥，直接影響到治愈率(Yuetal., 1998)。其次，血吸蟲病是組織臟器寄生蟲病，傳統(tǒng)檢測方法取材定點(diǎn)不易，難度較大，有創(chuàng)傷性，也給血吸蟲病的診斷帶了很大的困難。

生物醫(yī)學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，推動了血吸蟲病診斷技術(shù)的發(fā)展，并在靈敏、特異、快速，以及穩(wěn)定性方面體現(xiàn)出了明顯的優(yōu)勢，給血吸蟲的診斷帶來了新方法、新技術(shù)。本文綜述了針對血吸蟲病診斷的免疫學(xué)檢測新技術(shù)、核酸檢測新技術(shù)、傳感檢測新技術(shù)等方面的最新研究進(jìn)展。

1 免疫學(xué)檢測新技術(shù)

免疫診斷(immunodiagnosis)是應(yīng)用免疫學(xué)的理論、技術(shù)和方法診斷各種疾病和測定機(jī)體免疫狀態(tài)，是診斷檢測血吸蟲病的重要手段。近年來，由于我國對血吸蟲病的預(yù)防和控制的力度不斷加強(qiáng)，我國血吸蟲病感染人群和感染度也得到了大幅度的下降，急性感染和重度感染已較少見，但是湖沼型和山丘型的高山峽谷亞型流行區(qū)仍是血吸蟲病的主要流行地區(qū)，并且以隱性感染或者低度感染為主(周曉農(nóng)，2006)。傳統(tǒng)的病原學(xué)檢查已很難在糞便中查出病原體，免疫診斷由于有較好的靈敏度、快速、穩(wěn)定、方法靈活多樣等的優(yōu)點(diǎn)，已成為疫區(qū)血吸蟲診斷的主要途徑。生物醫(yī)學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，為尋找靈敏度更高，更快捷方便的免疫學(xué)檢測方法提供了技術(shù)支持。

1.1 磁珠酶聯(lián)免疫分析法

免疫磁珠(ImpetiCbead，IMB)是一種包被有免疫培基或特定化學(xué)集團(tuán)的球形磁性微粒，可特異性地與靶物質(zhì)結(jié)合使之成為具有磁響應(yīng)性的復(fù)合物。磁微粒分離酶聯(lián)免疫分析法(Magnetic affinity enzyme-linked immunoassay，MEIA)最早出現(xiàn)于1988年，利用磁性微球液相分離代替普通酶聯(lián)免疫微孔板包被法的固相分離，將磁分離與酶聯(lián)免疫技術(shù)相結(jié)合(Moscosoetal., 1988)。此法成為近年來發(fā)展起來的一項(xiàng)新的免疫學(xué)技術(shù)。

目前，磁珠酶聯(lián)免疫分析法也被應(yīng)用在血吸蟲檢測中，利用此法對人體血吸蟲抗體進(jìn)行檢測，其檢測敏感性較高，取得了良好的療效考察價值。與ELISA相比此法更加方便、快捷。重組日本血吸蟲SEA(Yuetal., 2012 a)、提取的谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(rSj26GST)(Yuetal., 2012b)和制備的Sj14-3-3蛋白(Yuetal., 2014)現(xiàn)已用于MEIA，比ELISA法特異性強(qiáng)、敏感度高的效果已被證實(shí)。該方法可替換ELISA法用于血吸蟲病低流行區(qū)的檢測。

Yu等(2012 a)利用MEIA研究建立了針對血吸蟲病檢測的SEA-MEIA方法。其將日本血吸蟲SEA與羧基磁性微球表面偶聯(lián)，將磁球表面的SEA作為捕獲抗原，用來檢測感染小鼠血清的抗體，同時也應(yīng)用于人血清抗體的檢測。結(jié)果表明：與傳統(tǒng)的SEA-ELISA相比，SEA-MEIA具有更高的平均P/N值(5.74 versus 4.13)，靈敏度較高，有望在血吸蟲病的現(xiàn)場檢測中推廣。

1.2 試紙條法

試紙條法由于其操作簡單，成本較低，可長期保存，不受實(shí)驗(yàn)條件限制的優(yōu)點(diǎn)，被逐步用于現(xiàn)場對血吸蟲病的快速篩查和診斷，如膠體染料試紙條法(DDIA)、乳膠微球標(biāo)記的試紙條法、膠體金免疫層析試紙條等。用于SEA制作的DDIA對血吸蟲病的檢測有較高的特異性、敏感性及較低的交叉反應(yīng)(Xuetal., 2011)，可用于推廣進(jìn)行低度血吸蟲病流行區(qū)的篩查。

盧福莊等(2013)研制了敏感、高效，實(shí)用性強(qiáng)的針對牛血吸蟲感染的檢測紙條。實(shí)驗(yàn)以乳膠微球標(biāo)記的兔抗牛 IgG 為探針，以可溶性抗原為檢測線，以羊抗兔 IgG 為質(zhì)控線，建立一種檢測牛日本血吸蟲病的試紙條檢測法。許瑞等(2015)利用膠體金標(biāo)記重組蛋白G，制備了用于家畜血吸蟲病檢測的膠體金免疫層析試紙條。

2 核酸檢測新技術(shù)

隨著聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)及相關(guān)技術(shù)的快速發(fā)展，核酸檢測也越來越深入可在血清學(xué)變化之前檢測出感染程度，并且更加微量、靈敏。近年來，由于核酸檢測所具有良好特性，使其在血吸蟲病早期感染的檢測中得到越來越多的關(guān)注，除常規(guī)的PCR方法之外，更多改進(jìn)方法被應(yīng)用臨床檢測，大大降低了檢出限，提高了檢出率。

2.1 實(shí)時定量熒光PCR

實(shí)時定量熒光PCR(Real-Time PCR)是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用不同熒光信號盡量檢測核酸的技術(shù)(Lietal., 2009)。Real-Time PCR技術(shù)成為生物定量分析的重要技術(shù)。在2008年，我國就有利用Real-time PCR檢測日本血吸蟲的報(bào)道，可在3 h內(nèi)完成對基因組檢測濃度為6.15 pg的檢測(Zhouetal., 2008)。近年，Huang等(2008)報(bào)道了關(guān)于采用Real-time PCR技術(shù)檢測不同水源中的日本血吸蟲尾蚴，設(shè)計(jì)了一對相應(yīng)引物，采用TaqMan探針技術(shù)，檢測極限低于尾蚴DNA當(dāng)量的50%，用Real-Time PCR檢測日本血吸蟲尾蚴不同濃度的重復(fù)樣本的結(jié)果與光鏡計(jì)數(shù)呈線性相關(guān)，此方法可用于疫水中日本血吸蟲尾蚴的檢測。

2.2 重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)

重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)(Recombinase polymerase amplification, RPA)就是在常溫下依賴于單鏈結(jié)合蛋白(Single strand DNA-binding protein, SSB)、鏈置換DNA聚合酶及能結(jié)合單鏈核酸的重組酶進(jìn)行核酸擴(kuò)增，并在恒溫條件下對模板上特定的靶序列DNA片段進(jìn)行擴(kuò)增(Rosseretal.，2015)。該技術(shù)也逐漸運(yùn)用到血吸蟲病的檢測研究中(樊曉旭等，2016)。Sun等(2016)利用RPA技術(shù)對感染日本血吸蟲患者糞便樣本中的SjR2序列進(jìn)行擴(kuò)增，其敏感度達(dá)5 fg，并與ELISA和IHA做對照分析，結(jié)果表明其特異性、敏感度均高于常規(guī)的ELISA和間接紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)(Indirect haemagglutination test, IHA)技術(shù)。Xing等(2017)采集了流行區(qū)日本血吸蟲感染者的糞便樣本，對其SjR2序列進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果顯示，該方法可在15 min內(nèi)檢測出日本血吸蟲的DNA，敏感度達(dá)0.9 fg。RPA技術(shù)適用于現(xiàn)場的檢測，對樣品的純度要求低、操作簡單、花費(fèi)時間少，而且實(shí)驗(yàn)結(jié)果肉眼可觀。

2.3 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(Loop-mediated isothermal amplification， LAMP)最早由日本的Notomi提出(Notomietal.，2000)，近年來由于其操作簡便、反應(yīng)時間短、特異性高并具有可視性等優(yōu)點(diǎn)得到越來越多關(guān)注。Feng等(2016)利用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)建立了針對日本血吸蟲釘螺的檢測方法，并達(dá)到了可視化。此方法可檢測出含1%的陽性釘螺樣本，并根據(jù)反應(yīng)的顏色改變來判斷檢測結(jié)果。Xu等(2012) 分別采用PCR、LAMP對20名正常人血清樣品30個血清學(xué)血吸蟲樣品DNA進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)LAMP的敏感性達(dá)96.7%，而PCR只有60%，表明LAMP優(yōu)于常規(guī)的PCR技術(shù)，對于血吸蟲病的早期診斷具有一定的價值。

3 傳感檢測新技術(shù)

隨著醫(yī)學(xué)檢測技術(shù)與化學(xué)技術(shù)、新型材料的快速發(fā)展和各種技術(shù)的互相滲透，也出現(xiàn)了新的血吸蟲病的檢測方法。利用傳感器這一高靈敏的信息獲取裝置與高特異性的免疫反應(yīng)相結(jié)合，構(gòu)建了一種新型的傳感檢測技術(shù)，此技術(shù)也廣泛的用于了寄生蟲的檢測。

3.1 電化學(xué)免疫傳感器

電化學(xué)傳感器因其較高的識別能力、制備簡單、高效等優(yōu)點(diǎn)是免疫傳感器中研究較早，傳感器種類多樣，是一種比較成熟的技術(shù)。利用這一方法，通過夾心式免疫反應(yīng)利用HBR催化H2O2成熟在晶振表面形成不溶性沉積物，放大檢測信號，制備了一種血吸蟲電化學(xué)免疫傳感器(Cheetal.，2008)。在此基礎(chǔ)上，Zeng等(2012)開發(fā)了基于印刷電極的日本血吸蟲免疫傳感器，采用循環(huán)伏安法和示差脈沖伏安法檢測兩種戊二醛交聯(lián)(GA)和殼聚糖戊二醛(Chit-GA)傳感器對血吸蟲抗原的不同滴度的敏感性。GA傳感器和Chit-GA傳感器檢測范圍分別為1/1000～1/400，1/1000～1/500，電流電壓與與血清效價成正比。此傳感器反應(yīng)靈敏，檢測抗體滴度線性范圍寬，并呈良好的線性關(guān)系。此外，新興的電化學(xué)免疫陣列(Electrochemical immunosensor arrays, ECISA)使用SEA和重組日本血吸蟲鈣結(jié)合蛋白(SjE16)做抗原來檢測血吸蟲抗體，結(jié)果表明敏感性100%，交叉反應(yīng)極低，可用于低感染區(qū)血清的大規(guī)模篩查(Dengetal.，2013)

3.2 光學(xué)免疫傳感器

貴金屬(如金)納米結(jié)構(gòu)的使用被作為光學(xué)生物傳感器結(jié)合檢測的方法已經(jīng)成為引人注目的途徑，隨著生物醫(yī)學(xué)技術(shù)的發(fā)展，納米金標(biāo)記技術(shù)也成為現(xiàn)代4大免疫標(biāo)記技術(shù)之一。納米金在免疫檢測領(lǐng)域中不僅可以作為電學(xué)標(biāo)記,同時還可以作為很好的光學(xué)標(biāo)記也發(fā)揮著越來越廣泛的作用。

利用納米金優(yōu)良的物理化學(xué)特性探索制備用于針對日本血吸蟲的光學(xué)免疫傳感器，對與日本血吸蟲病的早期診斷有重要意義。何鑫等(2015)構(gòu)建了固相金納米棒光學(xué)免疫傳感器，檢測早期不同時間段的感染日本血吸蟲的兔血清抗原。結(jié)果顯示，在檢測感染7 d后的兔血清抗原，納米金棒的傳感器呈陽性，而IHA檢測結(jié)果是陰性。此傳感器對感染日本血吸蟲病的兔血清抗原具有早期的識別能力。此方法不僅為血吸蟲病的早期診斷提供了新的有效的方法，同樣也可以用于其他早期診斷困難的寄生蟲病，值得進(jìn)一步研究和推廣。

4 展望

近年來，生物醫(yī)學(xué)各個學(xué)科的快速發(fā)展和互相滲透，也為日本血吸蟲病甚至寄生蟲病的檢測帶來了新的檢測方法。通過我們多年共同的努力，以及國家對寄生蟲預(yù)防和治療的大量投入，我國血吸蟲病防治取得了顯著成效，總體上呈下降趨勢(雷正龍等，2014)。但面對目前日本血吸蟲感染率和感染度的下降，如何做好低度感染的流行狀態(tài)下病人的快速診斷和早期診斷，仍是我們工作的重點(diǎn)?，F(xiàn)在檢測技術(shù)由于其靈敏度高，特異性強(qiáng)，制備簡單，對環(huán)境污染小等優(yōu)點(diǎn)，為我們提供了很多的新型檢測方法，但也容易出現(xiàn)交叉反應(yīng)，不同產(chǎn)品的質(zhì)量控制等問題亟待我們進(jìn)一步的研究。但新技術(shù)的出現(xiàn)，勢必為我國血吸蟲的預(yù)防、診斷、治療，提供了新的技術(shù)保障。