黑提葡萄組培快繁技術(shù)

（兵團(tuán)第九師林業(yè)工作管理站，新疆 額敏縣834601）

1 葡萄組織培養(yǎng)的研究與應(yīng)用

1.1 葡萄組培研究簡史

世界上關(guān)于葡萄組織培養(yǎng)快速繁殖體系建立工作已取得了跨越式的進(jìn)展，E．Clog[1]等、郎鳳紅[2]、張美玲[3]、陶建敏[4]等分別利用葡萄的葉片、葉柄、單芽莖段等外植體，通過器官發(fā)生途徑獲得了再生植株 ；M．Luci[5]等 、G．Reustle[6]等 、Y．M．Zhu[7]等 、C．K．SALIUNKHE[8]等分別利用葡萄的葉片、莖段等外植體及原生質(zhì)體，通過體胚發(fā)生方式獲得了完整植株，快速形成無性繁殖體系。

1.2 應(yīng)用前景及意義

快速擴(kuò)繁經(jīng)濟(jì)價值較高或者稀有的植物品種，受到區(qū)域、季節(jié)變化的局限，很難達(dá)到快繁的目的；尤其是在短時間內(nèi)需要達(dá)到一定數(shù)量，創(chuàng)造經(jīng)濟(jì)價值高的植物，則需要通過組織離體培養(yǎng)的方法才可以實現(xiàn)。組培作為新興技術(shù),已經(jīng)廣泛應(yīng)用于葡萄育種、葡萄種質(zhì)資源保存、葡萄生產(chǎn)等方面。近年來，新疆黑提葡萄發(fā)展非常迅速，對壯大新疆林果經(jīng)濟(jì)和提升百姓生活質(zhì)量水平起到了巨大的推動作用。對葡萄品種的選育和引進(jìn)，可在短時間內(nèi)提供大量優(yōu)質(zhì)種苗木，達(dá)到生產(chǎn)的需求[9]。

2 外植體的剪取、消毒

2.1 外植體的剪取

外植體剪取以春季和秋季為宜，選擇地上部分生命力旺盛的枝條莖段作為外植體，避免選擇在陰雨天剪取，晴天待露水曬干后剪取，剪取前噴施殺蟲劑和殺菌劑。將采回的黑提葡萄莖段（半木質(zhì)化，附帶腋芽）用自來水沖洗3～5次，剪去病、蟲、長勢弱枝和大葉片后再剪成2～3 cm Y字小型莖段，放入干燥滅菌的廣口瓶中，加入洗潔精清洗后將洗潔精沖洗干凈，最后用蒸餾水沖洗2～3遍。

2.2 外植體的消毒

在超凈工作臺上倒入無菌水浸泡并沖洗1次，緩慢倒出無菌水加入75%酒精浸泡7～8 s，快速倒出酒精以免損壞外植體，再使用無菌水沖洗2遍后加入0.1%升汞浸泡，放置7 min左右倒出，使用無菌水沖洗3～4次，取出高壓蒸汽滅菌的濾紙，將莖段放在濾紙上吸干水分，使用無菌剪剪去褐變枝端。外植體莖段消毒滅菌過程務(wù)必在超凈工作臺（無菌）進(jìn)行操作。

3 培養(yǎng)基的配方及制備

3.1 培養(yǎng)基的成分

離體組織培養(yǎng)期間，培養(yǎng)基能提供外植體生長主要的營養(yǎng)物質(zhì)和生長因子。

3.1.1 無機(jī)營養(yǎng)物

13種植物生長的必需的元素，即磷（P）、氮（N）、鈣（Ca）、鉀（K）、鎂（Mg）、鋅（Zn）、鉬（MO）、氯（Cl）、硫（S）、鐵（Fe）、硼（B）、錳（Mn）和銅（Cu），在培養(yǎng)基中加入的鹽類中全部含有。

3.1.2 有機(jī)營養(yǎng)物

有機(jī)營養(yǎng)物主要有2類，其中：有機(jī)營養(yǎng)物質(zhì)可為植物細(xì)胞提供碳、氫、氧、氮等必需元素，如糖類、氨基酸及酰胺類；生理活性物質(zhì)在植物的代謝過程中可起到一定的作用，如煙酸和肌醇等。

3.1.3 植物生長激素

植物生長激素包括人工合成生長激素物質(zhì)以及植物天然的5類激素物質(zhì)，其中，常用生長素有萘乙酸和吲哚乙酸，常用的細(xì)胞分裂素有6-芐基氨基嘌呤，常用的赤霉素類物質(zhì)，常用的乙烯類物質(zhì)有乙烯利和乙烯。

3.1.4 其他附加物

其他附加物成分對植物細(xì)胞生長有促進(jìn)作用，但不是植物細(xì)胞生長所必需。

固體培養(yǎng)基的必需成分為瓊脂，為降低組織培養(yǎng)物的有害代謝物濃度，可以加入適量的活性炭，以利于植物細(xì)胞生長；在快繁進(jìn)程中由菌類污染造成成百上千組培苗損失的現(xiàn)象較為普遍，適當(dāng)加入抗生素不僅能挽回大量培養(yǎng)物，而且也能節(jié)約大量的物力、時間及人力。

3.2 培養(yǎng)基的選定

不同植物體的不同生長階段所需的培養(yǎng)基種類不同，需針對不同階段進(jìn)行選擇。組培培養(yǎng)使用較廣泛的培養(yǎng)基主要有MS培養(yǎng)基、NN培養(yǎng)基及BR培養(yǎng)基等。其中，MS培養(yǎng)基主要作用于愈傷組織誘導(dǎo)組織分化等階段，葡萄組培常用MS培養(yǎng)基[10]。

3.3 培養(yǎng)基的制備

3.3.1 MS培養(yǎng)基母液的制備

3.3.1.1 母液A（大量元素）

使用電子天平稱取KNO3（19g）、NH4NO3（16.5g）、MgSO·4H2O（3.7 g）、KH2PO4（1.7 g）、CaCl·22H2O（4.4 g）放入不同燒杯。燒杯中加入少量蒸餾水?dāng)嚢杈鶆蚴顾幤烦浞秩芙?，再依次倒入容量瓶加蒸餾水定容至1 000 mL，充分搖勻。

3.3.1.2 母液B（微量元素）

使用電子天平稱取NaMoO4·2H2O（0.012 5 g）、H3BO3（0.31 g）、CuSO4·5H2O（0.001 25 g）、MnSO4·4H2O（1.115 g）、CoCL2·6H2O（0.001 25 g）、KI（0.041 5 g）、ZnSO4·7H2O（0.43 g）放入不同燒杯。 燒杯中加入少量蒸餾水?dāng)嚢杈鶆蚴顾幤烦浞秩芙?，再依次倒入容量瓶加蒸餾水定容至1 000 mL，充分搖勻。

3.3.1.3 母液C（鐵鹽）

使 用 電 子 天 平 稱 量FeSO4·7H2O（1.39 g）、Na2EDTA（1.85 g），放入不同燒杯。燒杯中加入少量蒸餾水?dāng)嚢杈鶆蚴顾幤烦浞秩芙?，再依次倒入容量瓶加蒸餾水定容至500 mL，充分搖勻。

3.3.1.4 母液D（有機(jī)附加物質(zhì)）

使用電子天平稱量煙酸（0.025 g）、肌醇（5.0 g）、VB1（0.005 g）、VB6（0.025 g）、甘氨酸（0.1 g），放入不同燒杯。燒杯中加入少量蒸餾水用玻璃棒攪勻使藥品充分溶解，再依次倒入容量瓶加蒸餾水定容至500 mL，充分搖勻。

3.3.2 激素的配制

6BA（0.5mg/mL）、IBA（0.5mg/mL）、NAA（0.5mg/mL），使用0.1mol/LNaOH或少量95%的酒精溶解。

3.3.3 MS培養(yǎng)基的熬制

在1 L水中加瓊脂6 g，糖30 g（水燒至沸騰后先加瓊脂再放糖），全部溶解后攪拌均勻再次定容至1 L，調(diào)節(jié)pH至5.8～6.4。

3.3.4 培養(yǎng)基的分裝

按照使用的目的和要求將培養(yǎng)基倒入規(guī)定的容器中，容器應(yīng)當(dāng)有一定的密閉性和透氣性，并且方便高壓蒸汽滅菌，適合植物生長。

3.3.5 培養(yǎng)基的滅菌

瓶裝培養(yǎng)基在121℃的溫度下進(jìn)行高壓蒸汽滅菌15 min。

3.3.6 培養(yǎng)基的存放

制備好的瓶裝培養(yǎng)基應(yīng)置于陰暗、低溫處存放，并標(biāo)注培養(yǎng)基類型編號以免混淆，宜盡早使用。

4 愈傷組織和瓶苗的培養(yǎng)

外植體培養(yǎng)2周左右會出現(xiàn)愈傷組織，應(yīng)關(guān)閉燈光或遮光處理，在黑暗條件下愈傷組織生長速度更快，培養(yǎng)基養(yǎng)分耗盡必須更換培養(yǎng)基進(jìn)行繼代培養(yǎng)；繼代培養(yǎng)過程中應(yīng)選擇不同的生長激素來調(diào)劑不同部位的生長情況：黑提葡萄莖尖愈傷誘導(dǎo)最適培養(yǎng)基為IBA 0.10 mg/L+1/2MS+6BA 1.0 mg/L，莖葉分化以IBA 0.10 mg/L+l/2MS+6BA 1.5 mg/L為宜，生根培養(yǎng)以IBA 1.0 mg/L+1/2MS為宜，黑提葡萄組織快繁中使用激素濃度不可過高。

5 瓶苗的移栽和鍛煉

當(dāng)黑提葡萄瓶苗生長至大量粗壯根系、有5～8片葉、高4～8 cm時，則將黑提葡萄瓶苗轉(zhuǎn)移至室內(nèi)自然光下鍛煉3 d，使其適應(yīng)溫室室內(nèi)環(huán)境，再將組培苗瓶蓋打開一半，在溫室內(nèi)練苗2 d，然后將瓶蓋全部打開1 d。從培養(yǎng)瓶中取出小苗，用清水洗掉根部附著的培養(yǎng)基，以免帶入蛭石導(dǎo)致根腐，移栽前將瓶苗根部快速蘸取低濃度生根劑和多菌靈后移栽于營養(yǎng)缽中，澆水浸透后覆蓋薄膜或搭建拱棚保濕，每2～3 h用噴壺噴1次葉面水（可加少量生根劑）；培養(yǎng)環(huán)境為20～25℃的溫室條件下，基質(zhì)溫度高于氣溫溫度最佳。經(jīng)過15 d后，黑提葡萄葉片轉(zhuǎn)綠增大，出現(xiàn)3～5片新綠嫩葉，新發(fā)出白色側(cè)根時移入苗床栽植，30 d后葉片逐漸增大，慢慢木質(zhì)化，成活率達(dá)95%以上，便可轉(zhuǎn)入常規(guī)栽培管理。

[1]CIOG E，PAUL B，BERNARD W．Plant regeneration by organogenesis in Vitis rootstock species[J]．Plant Cell Reports，1990，8（12）：726－728．

[2]郎鳳紅，何金柱，曹孜義．釀酒葡萄秋季消毒技術(shù)及影響成苗因素研究[J]．寧夏農(nóng)林科技，2012（5）：22－24．

[3]張美玲，楊國順，石雪暉，等．紅寶石無核和SO4單芽莖段的增殖與成苗培養(yǎng)[J]．中外葡萄與葡萄酒，2010（7）：28－30．

[4]陶建敏，莊智敏，章鎮(zhèn)，等．美人指葡萄不定芽離體誘導(dǎo)再生植株的研究[J]．果樹學(xué)報，2005，22（5）：551－553．

[5]LUCIA M，PAOLO B G，VALENTINO P，et al．Somatic embryogenesis from leaf and petiole derived callus of Vitis rupestris[J]．Plant Cell Reports，1993，12（4）：207－210．

[6]REUSTLE G，HARST M，ALLEWEDLDT G．Plant regeneration of grapevine（Vitissp．）protoplasts isolated from embryogenictissue[J]．Plant Cell Reports，1995，15（3－4）：238－241．

[7]ZHU Y M，HOSHINO，NAKANO M，et al．Highly efficient systemof plant regeneration from protoplasts of grapevine culture and activated charcoal[J]．Plant Science（Shannon），1997，123（1－2）：151－157．

[8]SALlUNKHE C K，RAO P S，MHATRE M．Induction of somatic embryogenesis and plantlets in tendrils of Vitis vinifera L[J]．Plant Cell Reports，1997，17（1）：65－67．

[9]張愛華，容新民，李玉國.組織培養(yǎng)脫毒技術(shù)在新疆葡萄快繁中的應(yīng)用[J].農(nóng)業(yè)科技通訊，2008（4）：49-51.

[10]于秋艷，王丹萍.葡萄的組培快繁技術(shù)[J].農(nóng)技服務(wù)，2016（17）：155.