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    Tctex-1基因?qū)δI癌786-O細(xì)胞生物功能影響及其機(jī)制研究

    2018-02-13 07:50:38汪寧王榮江鐘歡湯建兒陳煜高建國
    現(xiàn)代泌尿生殖腫瘤雜志 2018年6期
    關(guān)鍵詞:小室腎癌通路

    汪寧 王榮江 鐘歡 湯建兒 陳煜 高建國

    腎癌是泌尿生殖系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一,其發(fā)病率約占全身惡性腫瘤的3%[1]。腎癌缺乏放化療敏感性,治療方式以根治性手術(shù)為主,如出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移則延誤最佳治療時機(jī)[2],因此尋找有效的腎癌標(biāo)志物對指導(dǎo)疾病診斷、治療及判斷預(yù)后都具有重要的臨床意義。動力蛋白輕鏈家族包括Tctex-1(Dynlt-1)、Dynlt-3、Dynll-1、Dynll-2、Dynrb-1、Dynrb-2。Tctex-1的編碼基因位于6q25.2,分子量12 kDa,含有113AA,是由2個α螺旋和4個β鏈組成的二聚體。它主要富集在間質(zhì)成纖維細(xì)胞的高爾基體上,同時在間期微管和核膜上也能檢測到[3]。文獻(xiàn)報道Tctex-1參與人乳頭瘤病毒等感染從而影響宮頸癌的發(fā)生過程[4],然而,Tctex-1與腎細(xì)胞癌的作用機(jī)制尚不明確。本研究通過沉默Tctex-1基因觀察對腎癌786-O細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲能力的影響,并探索其下游信號通路,為腎癌的治療提供可能的靶點(diǎn)。

    材料與方法

    一、材料

    Tctex-1、Wnt和VDAC1抗體購自英國Abcam公司;786-O細(xì)胞株購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫;脂質(zhì)體LipofectamineTM2000購自美國Invitrogen公司;細(xì)胞增殖-毒性檢測試劑盒(Cell Counting Kit-8,CCK-8)購自日本同仁化學(xué)株式會社;Transwell小室購自美國Corning公司;Matrigel基質(zhì)膠購自美國BD公司。

    二、體外化學(xué)合成小干擾RNA(siRNA)

    應(yīng)用Ambion公司提供的網(wǎng)上在線工具設(shè)計Tctex-1特異性的siRNA。序列:5′-TCAGATGGACAGTCCGAAGG-3′(反義),5′-ATGCGTTAAAGATGGAAGACTTC-3′(正義)。

    三、細(xì)胞轉(zhuǎn)染與實(shí)驗(yàn)分組

    常規(guī)消化收集細(xì)胞后,將細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板。待細(xì)胞生長至密度為70%~80%時,按照LipofectamineTM2000說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染。實(shí)驗(yàn)分為Tctex-1-siRNA轉(zhuǎn)染組及陰性對照組。

    四、Western blot檢測Tctex-1、Wnt和VDAC1蛋白表達(dá)水平

    轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞,提取總蛋白,按每條泳道總蛋白30 μg加樣,于SDS-PAGE凝膠電泳后轉(zhuǎn)至PVDF膜,5%脫脂奶粉封閉2 h,一抗4 ℃孵育過夜,二抗室溫孵育2 h,ECL化學(xué)發(fā)光試劑(美國ProteinSimple公司)檢測結(jié)果。

    五、CCK-8檢測Tctex-1對786-O細(xì)胞增殖能力的影響

    將轉(zhuǎn)染48 h后的786-O細(xì)胞以200 μl/孔(約5×103個細(xì)胞)鋪于96孔板,置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng),并分別在細(xì)胞貼壁后的1、2、3、4 d后按照CCK-8說明書向各孔中加入CCK-8與無血清培養(yǎng)液(1∶10)混合物110 μl,避光孵育30 min后于酶標(biāo)儀450 nm波長處檢測每孔的光密度(OD)值。

    六、Transwell實(shí)驗(yàn)檢測786-O細(xì)胞遷移及侵襲能力

    24孔板中先加入600 μl含20%胎牛血清的對應(yīng)培養(yǎng)液,取200 μl(1.5×108/L)轉(zhuǎn)染48 h后的細(xì)胞懸液加入Transwell小室,侵襲實(shí)驗(yàn)取200 μl(2.0×108/L)的轉(zhuǎn)染48 h后的細(xì)胞懸液加入Transwell小室,事先將Matrigel膠與無血清培養(yǎng)液按1∶6比例稀釋配制出混合液,取50 μl混合液平鋪于Transwell小室中。將小室放入有培養(yǎng)液的24孔板中,繼續(xù)培養(yǎng)12 h后取出小室吸干其中的液體,移到90%甲醇中固定30 min,用結(jié)晶紫染色30 min,用棉簽擦凈小室底部,然后將小室倒過來背朝上晾干,于顯微鏡下拍照,取5個隨機(jī)視野,統(tǒng)計每個隨機(jī)視野中的細(xì)胞個數(shù)。

    七、統(tǒng)計學(xué)方法

    結(jié) 果

    一、Western blot檢測786-O細(xì)胞中Tctex-1、Wnt和VDAC1蛋白的表達(dá)

    轉(zhuǎn)染組(Tctex-1-siRNA組)中Tctex-1蛋白的相對表達(dá)量為(0.185±0.041),對照組(NCi組)為(0.762±0.065);Tctex-1-siRNA組中Wnt蛋白的相對表達(dá)量為(0.302±0.034),NCi組為(0.819±0.049);Tctex-1-siRNA組中VDAC1蛋白的相對表達(dá)量為(0.208±0.051),NCi組為(0.688±0.050)。Western blot檢測結(jié)果顯示,與NCi組相比,Tctex-1-siRNA組中Tctex-1、Wnt和VDAC1蛋白表達(dá)量明顯降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)(圖1)。

    二、CCK-8法檢測Tctex-1基因?qū)?86-O細(xì)胞增殖能力的影響

    CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,在2、3、4 d 3個時間點(diǎn)Tctex-1-siRNA組OD值與NCi組相比,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(2 dP<0.05,3、4 dP<0.01)(圖2)。表明沉默Tctex-1基因的表達(dá),786-O細(xì)胞增殖能力明顯降低。

    三、Transwell實(shí)驗(yàn)檢測Tctex-1基因?qū)?86-O細(xì)胞遷移及侵襲能力的影響

    如圖3所示,Tctex-1-siRNA組中遷移細(xì)胞數(shù)為(63±6)個,NCi組中遷移細(xì)胞數(shù)為(132±11)個,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01);而Tctex-1-siRNA組中侵襲細(xì)胞數(shù)為(45±5)個,NCi組中侵襲細(xì)胞數(shù)為(105±9)個,差異亦有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。表明沉默Tctex-1基因的表達(dá),786-O細(xì)胞遷移及侵襲能力明顯降低。

    圖1 Western blot檢測Tctex-1-siRNA組與NCi組中Tctex-1、Wnt及VDAC1蛋白表達(dá)

    圖2 CCK-8法檢測Tctex-1-siRNA組與對照組中細(xì)胞增殖能力情況(*P<0.05;**P<0.01)

    圖3 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測Tctex-1-siRNA組與NCi組中細(xì)胞遷移及侵襲能力情況(×400)

    討 論

    胞質(zhì)動力蛋白是由輕鏈、中間鏈、重鏈等組成的多亞基蛋白復(fù)合體,能將生物能轉(zhuǎn)化為機(jī)械能,通過微管運(yùn)動進(jìn)行物質(zhì)運(yùn)輸。在有絲分裂中胞質(zhì)動力蛋白可促進(jìn)中心體分離、核膜解體、紡錘體組裝[5-6];還能與動力激活蛋白相結(jié)合,從而驅(qū)動染色體分離以及膜性細(xì)胞器運(yùn)輸。Tctex-1作為一種重要的細(xì)胞因子,參與多個生物學(xué)過程,如介導(dǎo)逆行囊泡運(yùn)輸、參與直接的物質(zhì)運(yùn)輸、參與免疫功能調(diào)節(jié)、病毒感染、細(xì)胞的破骨過程等,同時也參與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及遷移過程[7]。研究發(fā)現(xiàn)Tctex-1在90%的乳腺癌中高表達(dá),并作為p21活化酶1的底物,與Pak1形成復(fù)合物促進(jìn)乳腺癌發(fā)生、生長及乳腺癌細(xì)胞存活[8],提示Tctex-1可能是一種促癌因子。

    利用免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Tctex-1和VDAC1有相互作用,并且通過免疫熒光技術(shù)發(fā)現(xiàn)Tctex-1與VDAC1密切相關(guān)[9]。Tctex-1與VDAC1的相互作用能在缺氧的環(huán)境抑制線粒體通透性增加。而多種惡性腫瘤的VDAC1表達(dá)增加與HK結(jié)合產(chǎn)生抗凋亡作用,腫瘤細(xì)胞處于一種缺氧環(huán)境,這提示在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中可能有Tctex-1與VDAC1的相互作用使腫瘤抗凋亡。而本研究中發(fā)現(xiàn)Tctex-1-siRNA轉(zhuǎn)染組中VDAC1蛋白表達(dá)量明顯降低,這提示抑制Tctex-1表達(dá)能抑制下游通路因子VDAC1表達(dá),從而影響腫瘤細(xì)胞凋亡與侵襲。

    通過酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Tctex-1與Dkk-3相互作用。免疫熒光實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Tctex-1與Dkk-3共定位于人成纖維細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)附近[10-12]。研究表明Dkk-3是Wnt信號通路的拮抗因子,Dkk-3可通過Wnt/β-catenin經(jīng)典通路來抑制腫瘤發(fā)展[13]。而本研究中發(fā)現(xiàn)Tctex-1-siRNA轉(zhuǎn)染組中Wnt蛋白表達(dá)量明顯降低,這提示Tctex-1可能與Dkk-3相互作用,從而作用于下游通路信號因子Wnt,影響腫瘤細(xì)胞增殖與轉(zhuǎn)移。

    本研究利用脂質(zhì)體瞬時轉(zhuǎn)染方法干擾786-O細(xì)胞中Tctex-1蛋白表達(dá),結(jié)果顯示Tctex-1對腎癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲具有調(diào)控作用。Tctex-1-siRNA轉(zhuǎn)染組中Tctex-1蛋白表達(dá)低于陰性對照組,說明Tctex-1-siRNA成功抑制了786-O細(xì)胞中Tctex-1蛋白表達(dá)。在此基礎(chǔ)上,進(jìn)一步利用CCK-8法、細(xì)胞遷移及侵襲實(shí)驗(yàn)觀察了抑制Tctex-1蛋白表達(dá)對786-O細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力的影響,研究發(fā)現(xiàn)沉默Tctex-1蛋白后786-O細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力受到抑制,說明Tctex-1作為促癌基因存在,這為Tctex-1成為腎癌的潛在治療靶點(diǎn)提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù),也為探討Tctex-1參與腎癌發(fā)生、發(fā)展作用機(jī)制搭建了研究基礎(chǔ)。

    本研究從生物功能上證實(shí)沉默Tctex-1基因表達(dá)可以有效抑制腎癌細(xì)胞的增殖,降低其遷移及侵襲能力,從機(jī)制上證實(shí)沉默Tctex-1基因可以有效抑制下游信號通路因子Wnt、VDAC1基因表達(dá)。由此可見Tctex-1基因與腎癌具有相關(guān)性,干擾Tctex-1基因的表達(dá)可能成為治療腎癌的一個新靶點(diǎn),下一步工作將從腎癌的組織表達(dá)以及動物實(shí)驗(yàn)做進(jìn)一步深入探討。

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