PD-1/PD-Ls在EBV陽性T/NK淋巴組織增殖性疾病中的表達(dá)及臨床意義*

胡俊霞 陳清江 張旭東 李文才 王冠男 王欣 董萌 吳少璇 馬咪靜 尹美鳳楊萬秋 丁夢(mèng)杰 張明智 朱利楠

EBV陽性T/NK淋巴組織增殖性疾?。跡pstein-Barr virus-positive T/natural killer（NK）-cell lymphoprolif?erative disease，EBV（+）-T/NK-LPD］是指 EB 病毒（Epstein-Barr virus，EBV）感染的一組淋巴組織疾病，Ohshima等［1］根據(jù)細(xì)胞形態(tài)和克隆性可分為Ⅰ級(jí)反應(yīng)期（多形性和多克?。?、Ⅱ級(jí)交界期（多形性和單克?。┖廷蠹?jí)腫瘤期（單形性和單克?。餐瑯?gòu)成連續(xù)的疾病譜系。EBV（+）-LPD分為B細(xì)胞型和T/NK細(xì)胞型，B細(xì)胞型可分為：淋巴樣肉芽腫、慢性活動(dòng)性EBV感染（chronic active Epstein-Barr virus infections CAEBV）-B細(xì)胞型、EBV（+）B細(xì)胞-LPD等；T/NK細(xì)胞型可分為：CAEBV-T/NK細(xì)胞型、種痘樣水皰?。╤ydroa vaccin?iforme-like disease HVD）、蚊叮超敏反應(yīng)（hypersensitivity to mosquito bites，HMB）等［2］。程序性細(xì)胞死亡蛋白-1（programmed cell death protein 1，PD-1）為CD28共刺激受體超家族成員，參與外周耐受的誘導(dǎo)和維持，并在自身免疫、移植免疫、感染性免疫和腫瘤免疫的調(diào)節(jié)中起關(guān)鍵作用［3］，而程序性細(xì)胞死亡蛋白-1配體（programmed death-ligand 1，PD-L1）（B7-H1/CD274）和程序性細(xì)胞死亡蛋白-2配體（programmed death-ligand 2，PD-L2）（B7-DC/CD273）為B7家族共刺激分子重要成員，研究發(fā)現(xiàn)其通過與其受體PD-1互相作用，傳遞負(fù)性調(diào)控信號(hào)誘導(dǎo)腫瘤抗原特異性T細(xì)胞的凋亡和免疫無能，促使腫瘤的免疫逃逸［4-6］。目前，PD-1、PD-L1和PD-L2在淋巴瘤等惡性腫瘤中的機(jī)制研究較多，但在EBV（+）-T/NK-LPD疾病（譜）中的研究較少。因此，本研究針對(duì)17例不同分級(jí)和類型的EBV（+）-T/NK-LPD患者標(biāo)本進(jìn)行PD-1、PD-L1和PD-L2檢測(cè)并探討其臨床意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標(biāo)本來源 收集鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院2013年1月至2017年12月診斷為EBV（+）-T/NK-LPD石蠟包埋組織17例。其中，男性12例，女性5例，年齡10～82歲，平均年齡29歲；Ⅰ級(jí)4例，Ⅱ級(jí)7例，Ⅲ級(jí)3例，種痘水皰病樣淋巴組織增殖性疾病3例。

1.1.2 主要試劑 鼠抗人PD-1單克隆抗體、免疫組織化學(xué)SP染色試劑盒和DAB顯色劑均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；兔抗人PD-L1多克隆抗體、兔抗人PD-L2多克隆抗體均購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學(xué)SP法檢測(cè)PD-1、PD-L1和PDL2蛋白表達(dá) 石蠟包埋組織切片，常規(guī)脫蠟，置于0.01 mmoL/L pH6.0的檸檬酸鹽95℃高壓鍋15 min抗原修復(fù)，待自然冷卻至室溫后PBS沖洗3次、暴露抗原、H2O2處理，兔抗人PD-L1多克隆抗體（1：120稀釋）、抗PD-1單克隆抗體（1：100稀釋）及抗PD-L2多克隆抗體（1：150稀釋）4℃孵育過夜，PBS代替一抗作陰性對(duì)照；二抗孵育30 min后DAB顯色、蘇木素復(fù)染、鹽酸酒精分化、透明，最后中性樹膠封片。

1.2.2 免疫組織化學(xué)結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn) 所有免疫組織化學(xué)陽性結(jié)果均呈顯著棕黃色，PD-1、PD-L1和PD-L2陽性物定位于細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)中，均在高倍鏡下隨機(jī)選擇5個(gè)視野計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞數(shù)，每個(gè)視野至少計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞。參照腫瘤組織中PD-1、PD-L1和PD-L2表達(dá)的計(jì)數(shù)方法，結(jié)合染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞百分比來評(píng)定陽性病例。腫瘤組織中PD-L1和PD-L2陽性細(xì)胞染色強(qiáng)度分級(jí)：無著色0分，淡黃色1分，棕黃色2分，棕褐色3分；5個(gè)視野陽性細(xì)胞平均百分?jǐn)?shù)作為該例陽性細(xì)胞百分比，將其分級(jí)：＜25%1分，25%～50%2分，＞50%3分。兩項(xiàng)結(jié)果相乘得分≥2分為陽性，＜2分為陰性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。表達(dá)率比較采用Fisher確切概率法，等級(jí)資料采用Spearman秩相關(guān)分析。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PD-1、PD-Ls表達(dá)與預(yù)后之間的關(guān)系

經(jīng)Fisher確切概率法分析，PD-1、PD-L2的表達(dá)與預(yù)后無顯著相關(guān)性（均P＞0.05，表1），PD-L1表達(dá)與預(yù)后呈正相關(guān)（P＜0.05）。

2.2 Spearman秩相關(guān)分析PD-1、PD-Ls與病理分級(jí)之間的相關(guān)性

結(jié)果顯示PD-1、PD-L1和PD-L2的相關(guān)系數(shù)分別為r=0.141（P＞0.05）、r=-0.563（P＜0.05）和r=-0.149（P＞0.05），提示PD-1與PD-L2表達(dá)與病理分級(jí)之間無顯著相關(guān)性，而PD-L1的表達(dá)與病理分級(jí)之間呈負(fù)相關(guān)，PD-L1的表達(dá)與病理分級(jí)之間的相關(guān)關(guān)系具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，表2）。

2.3 PD-L1和PD-L2在EBV（+）-T/NK-LPD組織中陽性表達(dá)與臨床病理學(xué)的特征關(guān)系

本研究對(duì)17例EBV（+）-T/NK-LPD病理組織標(biāo)本檢測(cè)PD-Ls表達(dá)情況，考慮到EBV（+）-T/NK-LPD仍來源于淋巴細(xì)胞組織。因此，對(duì)PD-1在本疾病中的表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，在17例組織標(biāo)本中，PD-1表達(dá)陽性12例（圖1），PD-L1表達(dá)陽性6例（圖2），PD-L2表達(dá)陽性5例（圖3）。PD-L1和PD-L2的表達(dá)與年齡、性別、LDH水平及Ki-67的表達(dá)水平之間無顯著相關(guān)性（P＞0.05，表3）。

表1 PD-1、PD-L1和PD-L2的表達(dá)與預(yù)后之間的關(guān)系

表2 PD-1、PD-L1和PD-L2的表達(dá)與病理分級(jí)之間的相關(guān)性

圖1 PD-1在EBV（+）-T/NK-LPD中陽性表達(dá)（SP法×200）

圖2 PD-L1在EBV（+）-T/NK-LPD中陽性表達(dá)（SP法×200）

圖3 PD-L2在EBV（+）-T/NK-LPD中陽性表達(dá)（SP法×200）

表3 PD-L1、PD-L2表達(dá)與臨床病理特征之間的關(guān)系

3 討論

EBV屬于人皰疹病毒γ亞科的DNA病毒，1964年由Epstein和Barr首次在Burkitt淋巴瘤細(xì)胞株中發(fā)現(xiàn)，與多種人類惡性腫瘤有關(guān)［7］。EBV為一種在全球范圍內(nèi)廣泛感染的皰疹病毒，人群中感染率在90%以上，呈潛伏感染狀態(tài)并持續(xù)終生［8］。EBV具有嗜淋巴細(xì)胞和上皮細(xì)胞的特性，主要感染B淋巴細(xì)胞或鼻咽部的上皮細(xì)胞，亦可感染T細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞，引起的疾病主要包括鼻咽癌及EBV陽性的淋巴組織疾病，后者疾病中包括性質(zhì)涵蓋良性、交界性、腫瘤性的EBV（+）-T/NK-LPD，如種痘樣水泡病樣EBV（+）NK/T細(xì)胞淋巴組織增殖性疾?。℉V-NK/T-LPD）、蚊蟲叮咬超敏性EBV（+）NK/T細(xì)胞淋巴組織增殖性疾?。跰BH-EBV（+）NK/T-LPD］等［9］。慢性活動(dòng)性EB病毒感染（chronic active Epstein-Barr virus infections，CAEBV）是指持續(xù)超過6個(gè)月并且非免疫缺陷患者中的慢性活動(dòng)性EBV感染相關(guān)的嚴(yán)重進(jìn)行性淋巴組織增生性疾病［10］。2008年將此名詞更正為“EBV（+）-LPD”。根據(jù)主要病變細(xì)胞成分不同分為B細(xì)胞型［EBV（+）B-LPD］、T/NK細(xì)胞型［EBV（+）-T/NKLPD］兩種類型。在中亞/南美洲和墨西哥的東亞人和美洲原住民中，EBV感染的T細(xì)胞和NK細(xì)胞的克隆擴(kuò)增和轉(zhuǎn)化是主要的致病表現(xiàn)，而在少數(shù)西方患者中，EBV感染的B細(xì)胞擴(kuò)增是EBV（+）-LPD的主要特征［11］。

PD-1為CD28共刺激受體超家族成員，主要在活化的CD4、CD8T細(xì)胞、B細(xì)胞、單核細(xì)胞、自然殺傷（NK）細(xì)胞和樹突細(xì)胞（DC）上表達(dá)［12-15］。PD-L1和PD-L2為PD-1的配體，兩者雖同屬B7家族，但具有不同的表達(dá)模式：PD-L1可在造血細(xì)胞、非造血細(xì)胞及腫瘤和腫瘤微環(huán)境中廣泛誘導(dǎo)［16］；而PD-L2僅在少數(shù)細(xì)胞類型，如APC和Th2細(xì)胞上表達(dá)［17］。PD-1及其配體PD-L1/PD-L2是一組負(fù)性共刺激分子，其相互作用抑制T細(xì)胞受體（T-cell receptor，TCR）介導(dǎo)的抗原受體信號(hào)傳導(dǎo)，包括T細(xì)胞增殖、細(xì)胞因子產(chǎn)生和細(xì)胞毒性等，在誘導(dǎo)和維持外周耐受以及維持T細(xì)胞的穩(wěn)定性及完整性方面具有重要作用。另外，也可以抑制癌細(xì)胞的T效應(yīng)細(xì)胞增殖與功能，從而對(duì)抗病毒和抗腫瘤免疫具有不利影響［18］。同時(shí)，該通路的激活可使腫瘤局部微環(huán)境發(fā)生改變，T細(xì)胞免疫效應(yīng)降低，從而介導(dǎo)腫瘤發(fā)生免疫逃逸，促進(jìn)腫瘤生長［19］。經(jīng)研究證實(shí)，包括尿路上皮腫瘤、卵巢癌、乳腺癌、宮頸癌和血液系統(tǒng)惡性腫瘤等多種腫瘤中存在PD-1/PD-Ls抑制通路參與，從而逃避免疫監(jiān)視；研究發(fā)現(xiàn)血液系統(tǒng)惡性腫瘤高表達(dá)PD-L1，并且PDL2在較小程度上表達(dá)，與不良預(yù)后相關(guān)［3］。NK/T細(xì)胞淋巴瘤、部分彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤等多種淋巴瘤的發(fā)生、發(fā)展均與EBV密切相關(guān)［20］，EBV編碼的潛伏膜蛋白-1（latent membrane protein-1，LMP-1）的表達(dá)促進(jìn)AP1和JAK-STAT信號(hào)通路激活，導(dǎo)致PD-L1在上述疾病中均高表達(dá)［21］。Chen等［22］研究發(fā)現(xiàn)，PD-L1在經(jīng)典的霍奇金淋巴瘤、結(jié)外NK/T淋巴瘤中的表達(dá)均＞80%，在EBV陽性鼻咽癌中表達(dá)高達(dá)90%，在EBV陽性彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤中達(dá)100%。因此，在EBV陽性的淋巴瘤中PD-L1呈顯著的高表達(dá)狀態(tài)。EBV（+）-T/NK-LPD為一組淋巴組織增殖性疾病譜，隨著疾病進(jìn)展可由良性病變轉(zhuǎn)變成為腫瘤性病變，腫瘤期相當(dāng)于進(jìn)展為淋巴瘤或白血?。?3］。PD-L1、PD-L2在EBV（+）-T/NK-LPD疾病譜中的表達(dá)與臨床病理學(xué)特征及病理分級(jí)是否相關(guān)，目前尚未明確。

本研究對(duì)17例EBV（+）-T/NK-LPD病理組織標(biāo)本檢測(cè)PD-Ls表達(dá)情況，考慮到EBV（+）-T/NK-LPD仍來源于淋巴細(xì)胞組織。結(jié)果顯示在17例組織標(biāo)本中，PD-1表達(dá)陽性12例，PD-L1表達(dá)陽性6例，PDL2表達(dá)陽性5例。PD-1、PD-L2表達(dá)與預(yù)后無顯著相關(guān)性（P＞0.05），PD-L1表達(dá)與預(yù)后呈正相關(guān)（P＜0.05）。PD-L1、PD-L2的表達(dá)與年齡、性別、LDH水平及Ki-67的表達(dá)水平之間無顯著相關(guān)性（P＞0.05）。PD-1與PD-L2的表達(dá)與病理分級(jí)之間無顯著相關(guān)性（r=0.141，-0.149，均P＞0.05），而PD-L1的表達(dá)與病理分級(jí)之間呈負(fù)相關(guān)（r=-0.563），PD-L1的表達(dá)與病理分級(jí)之間的相關(guān)關(guān)系具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。本研究結(jié)果提示雖然PD-1的表達(dá)與預(yù)后、病理分級(jí)之間無顯著相關(guān)性，但在EBV（+）-T/NK-LPD中高表達(dá)，PD-1/PD-Ls信號(hào)通路抑制劑可能成為該疾病譜的新治療方案。然而，有研究表明［24-25］，如肺、消化道腫瘤，PD-1/PD-Ls信號(hào)通路抑制劑療效與腫瘤組織PD-1、PD-Ls的表達(dá)無關(guān)。

綜上所述，PD-L1的表達(dá)與預(yù)后呈正相關(guān)，提示生存患者的PD-L1表達(dá)率高于死亡患者；PD-L1的表達(dá)與病理分級(jí)之間呈負(fù)相關(guān)，隨著病理分級(jí)的增高，PD-L1的表達(dá)反而降低。由于本研究病例數(shù)較少，結(jié)果可能存在偏差。因此，本研究結(jié)果僅為臨床治療提供理論依據(jù)，今后亟需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本進(jìn)行PD-L1、PD-L2表達(dá)檢測(cè)以及臨床應(yīng)用PD-1抗體的研究，從而明確PD-1/PD-Ls信號(hào)通路抑制劑對(duì)EBV（+）-T/NK-LPD的療效。