新型分子診斷技術(shù)在動(dòng)物疫病檢測(cè)中的應(yīng)用與發(fā)展

莊向婷，白 軍，張振倉(cāng)

（楊凌職業(yè)技術(shù)學(xué)院，陜西 楊凌 712100）

隨著生命醫(yī)學(xué)和科學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，基于分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)病原體進(jìn)行測(cè)定的分子診斷技術(shù)，大大提高了動(dòng)物病原體的檢測(cè)水平，從分子水平探討疾病發(fā)生和發(fā)展的機(jī)制，為動(dòng)物疫病的預(yù)防、診斷和治療提供信息和決策的依據(jù)。分子診斷技術(shù)發(fā)展至今，主要分為傳統(tǒng)分子診斷技術(shù)（核酸雜交技術(shù)、聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)和限制性酶切技術(shù)等）和新型分子診斷技術(shù)（實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)、基因芯片技術(shù)和核酸擴(kuò)增技術(shù)等）。近些年來，一些新型分子診斷技術(shù)逐步實(shí)現(xiàn)了分子檢測(cè)的自動(dòng)化和高通量，并應(yīng)用于動(dòng)物疫病診斷，有效提高了疫病確診速度與準(zhǔn)確性，為及時(shí)控制疫情提供了決策依據(jù)。該文就目前所應(yīng)用的幾類新型分子診斷技術(shù)在動(dòng)物疫病檢測(cè)中的原理及實(shí)踐應(yīng)用進(jìn)行簡(jiǎn)單介紹和評(píng)論，并對(duì)其發(fā)展趨勢(shì)與前景作出展望。

1 新型分子診斷技術(shù)在病原檢測(cè)中的分類及應(yīng)用

病原體的檢測(cè)是動(dòng)物疫病確診的基石，對(duì)采取防控措施、提高療效、改善預(yù)后、降低費(fèi)用有著極其重要的作用。但是某些病原體造成的傳染病感染部位深、數(shù)量少、采樣困難，在臨床實(shí)驗(yàn)室病原微生物培養(yǎng)條件下，增長(zhǎng)緩慢或難以培養(yǎng)，導(dǎo)致檢出率不高。傳統(tǒng)分子診斷技術(shù)又存在操作步驟繁瑣、工作量大、周期長(zhǎng)等不足，無法滿足臨床早期、快速診斷以及治療、防控疾病的需要。隨著分子檢測(cè)技術(shù)的逐步發(fā)展，許多新型的分子診斷技術(shù)具有效率高、特異性強(qiáng)、敏感性高等優(yōu)勢(shì)，在傳染性疫病檢測(cè)領(lǐng)域的應(yīng)用逐漸成熟。

1.1 實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)

Higuchi于1992年提出實(shí)時(shí)觀測(cè)PCR反應(yīng)整個(gè)過程的構(gòu)想?；谄胀ǖ腜CR反應(yīng)，在進(jìn)行核酸擴(kuò)增的過程中，摻入到雙鏈核酸中的熒光基團(tuán)或者熒光染料隨著每一次的擴(kuò)增循環(huán)嵌入釋放熒光，通過對(duì)所釋放出的熒光強(qiáng)度實(shí)時(shí)檢測(cè)，并結(jié)合相應(yīng)的計(jì)算方法，從而得出待檢測(cè)樣品中目標(biāo)基因的含量，實(shí)現(xiàn)了PCR由傳統(tǒng)的定性到定量測(cè)定的轉(zhuǎn)化[1-2]。1995年美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司研制的首臺(tái)熒光定量PCR儀使熒光定量PCR技術(shù)走向市場(chǎng)化，在醫(yī)學(xué)、檢驗(yàn)檢疫等方面得到了快速的推廣應(yīng)用。

1.1.1 水解探針法：TaqMan熒光探針是特異性的寡核苷酸熒光探針，在兩端標(biāo)記有熒光報(bào)告基團(tuán)和熒光淬滅基團(tuán)。在探針完整時(shí)，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)吸收而檢測(cè)不到熒光。在PCR擴(kuò)增時(shí)，Taq酶的5′-3′外切酶活性將探針降解使得熒光基團(tuán)分離，釋放出熒光信號(hào)。目標(biāo)基因每擴(kuò)增一次就會(huì)有一個(gè)熒光基團(tuán)游離出來，從而實(shí)現(xiàn)熒光的逐步積累，進(jìn)而進(jìn)行PCR產(chǎn)物的定量測(cè)定。新型的TaqMan-MGB探針在3′端使用了無熒光的淬滅基團(tuán)，本身不產(chǎn)生熒光，大大降低了本底信號(hào)的強(qiáng)度。同時(shí)3′端的小分子修飾基團(tuán)使得探針的長(zhǎng)度縮短，可將探針的Tm值提高10℃，對(duì)單堿基突變的檢測(cè)靈敏性得到提高。TaqMan-MGB實(shí)時(shí)熒光定量分析法能夠快速、準(zhǔn)確地定量測(cè)定出目標(biāo)基因，且靈敏度高，特異性強(qiáng)，干擾因素少。

TaqMan技術(shù)已經(jīng)在病原體檢測(cè)、鑒別，畜禽產(chǎn)品的檢驗(yàn)、檢疫以及疫苗效力的測(cè)定上得到了較為廣泛的應(yīng)用。如Dovas等[3]建立了對(duì)H5N1禽流感病毒的實(shí)時(shí)熒光定量PCR測(cè)定方法，適用于H5N1禽流感病毒的高通量檢測(cè)，并可在臨床對(duì)疫病進(jìn)行快速檢測(cè)、診斷與推廣。曹偉偉等[4]通過對(duì)基因儲(chǔ)存庫(kù)中豬圓環(huán)病毒的基因序列進(jìn)行比較后，設(shè)計(jì)出能夠特異性檢測(cè)豬圓環(huán)病毒Ⅱ型的引物，成功建立了PCV-2的TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)方法，該方法特異性高，能夠?yàn)镻CV-2的防治提供快速的指導(dǎo)。何世成等[5]建立了采用雙重?zé)晒釸T-PCR技術(shù)來鑒別小反芻獸野毒與疫苗毒的區(qū)分方法，該方法檢測(cè)流程簡(jiǎn)單，重復(fù)性好，靈敏度高，節(jié)約成本，更為便捷，且可以將診斷時(shí)間縮短至1 h便可快速區(qū)別出野毒株和疫苗株，為小反芻獸疫的流行病學(xué)調(diào)查、感染監(jiān)測(cè)和疫苗評(píng)估提供快速有力的依據(jù)。

1.1.2 雜交探針法：分子信標(biāo)探針的本質(zhì)是莖環(huán)雙標(biāo)記寡核苷酸探針，所標(biāo)記的熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)因兩端的核酸互補(bǔ)配對(duì)而緊緊靠近。在PCR擴(kuò)增過程中，模板通過與特異性靶序列雜交而發(fā)生構(gòu)象變化，使得熒光基團(tuán)與淬滅基團(tuán)分開。熒光基團(tuán)被激發(fā)后，發(fā)出激發(fā)光子，熒光強(qiáng)度隨著擴(kuò)增產(chǎn)物的增加而積累，通過熒光儀的檢測(cè)進(jìn)行基因的定量分析。分子信標(biāo)技術(shù)目前已用于單核苷酸多態(tài)性檢測(cè)、病原體檢測(cè)等生物醫(yī)學(xué)和臨床研究領(lǐng)域。McKillen等[6]建立的分子信標(biāo)熒光定量PCR技術(shù)能夠快速鑒別非洲豬瘟（ASFV）病原體，對(duì)于目標(biāo)基因最低可檢測(cè)到2×101的復(fù)制。該方法能夠在同一個(gè)反應(yīng)過程中通過不同的熒光探針進(jìn)行多目標(biāo)的檢測(cè)，如同時(shí)快速、靈敏地進(jìn)行豬圓環(huán)病毒2型（PCV2）與豬細(xì)小病毒（PPV）的鑒別測(cè)定，為正確實(shí)施疫病防控措施提供了有效保障。

羅氏公司開發(fā)的熒光共振能量轉(zhuǎn)移（fluorescence resonance energy transfer，F(xiàn)RET）探針又稱為雙雜交探針，或者LightCycle探針，由2條和模板互補(bǔ)且相鄰的特異探針組成，是距離很近的2個(gè)熒光分子間產(chǎn)生的一種能量轉(zhuǎn)移現(xiàn)象。FRET探針復(fù)性時(shí)，2條特異探針雜交到模板上，相互靠近而產(chǎn)生檢測(cè)信號(hào)；升溫變性時(shí)，兩探針游離，兩基團(tuán)距離較遠(yuǎn)而檢測(cè)不到熒光信號(hào)，所以檢測(cè)的是實(shí)時(shí)信號(hào)，是可逆的，可以進(jìn)行熔解曲線的分析，還可以用于突變分析以及產(chǎn)物鑒別。此外，采用2條模板特異的探針，在檢測(cè)過程中不受非特異性產(chǎn)物的影響，因而專一性更高于傳統(tǒng)的PCR檢測(cè)方法。歐盟的合作實(shí)驗(yàn)室利用FRET技術(shù)建立了同時(shí)檢測(cè)口蹄疫所有7種血清型的定量實(shí)時(shí)RTPCR，測(cè)定靈敏度高，準(zhǔn)確性高。1.1.3 熒光引物：Amplifluor技術(shù)的基本原理是激發(fā)的熒光進(jìn)行分子能量轉(zhuǎn)移到受體成分導(dǎo)致熒光發(fā)射的淬滅。目標(biāo)特異性Amplifluor引物包含一個(gè)5′內(nèi)部互補(bǔ)序列，標(biāo)記有熒光發(fā)色團(tuán)和一個(gè)能量受體：4-（二甲胺）氮-苯磺酸（DABSYL）。3′端序列是目標(biāo)特異性引物區(qū)，Amplifluor引物由于內(nèi)部熒光發(fā)色團(tuán)和淬滅分子的緊密接近，只有低的熒光信號(hào)。在PCR擴(kuò)增循環(huán)過程中，Amplifluor發(fā)夾引物解折疊并產(chǎn)生熒光信號(hào)。根據(jù)擴(kuò)增循環(huán)中產(chǎn)生的熒光信號(hào)的強(qiáng)度與擴(kuò)增產(chǎn)物的量進(jìn)行定量分析。

由Invitrogen公司建立的LUM（light upon extention）技術(shù)采用類似分子信標(biāo)的發(fā)夾結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)引物，使引物同時(shí)起到熒光探針的作用。該技術(shù)不需要專門設(shè)計(jì)探針，因此可以節(jié)約成本，同時(shí)為實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)提供了寬松的條件。李軍等[7]設(shè)計(jì)的熒光雙鏈引物是利用2條完全互補(bǔ)的寡聚核苷酸雜交形成的雙鏈結(jié)構(gòu)，將其中一條用于標(biāo)記PCR擴(kuò)增的引物，稱為“正引物”，另一條與正引物完全互補(bǔ)，稱為“負(fù)引物”。該方法應(yīng)用于雞新城疫的檢測(cè)，成本低、特異性與重復(fù)性好，并能夠準(zhǔn)確定量樣品中的基因拷貝數(shù)，在臨床診斷、出入境檢驗(yàn)檢疫中有著廣闊的應(yīng)用前景。

1.2 基因芯片技術(shù)

20世紀(jì)80年代末，采用雜交法測(cè)定核酸序列的想法被提出，經(jīng)過生物醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)學(xué)科的快速發(fā)展，使基因芯片技術(shù)得到了推進(jìn)與應(yīng)用。基因芯片技術(shù)是建立在基因探針和核酸雜交技術(shù)之上，利用PCR技術(shù)制備檢測(cè)模板，采用原位合成或顯微點(diǎn)樣技術(shù)將大量核酸片段探針有序地固化于支持物表面，然后與標(biāo)記的待檢測(cè)靶基因片段雜交，通過對(duì)雜交信號(hào)的強(qiáng)度與分布進(jìn)行檢測(cè)和分析，從而獲得樣品的基因序列、含量、基因表達(dá)等。高密度基因芯片可以預(yù)先設(shè)計(jì)大量探針固定于載體上，同時(shí)對(duì)成千上萬個(gè)樣品進(jìn)行檢測(cè)，實(shí)現(xiàn)樣品的高通量檢測(cè)，縮短了實(shí)驗(yàn)進(jìn)程，提高了檢出率。在統(tǒng)一設(shè)置的條件下，設(shè)置多種熒光標(biāo)記探針，對(duì)多個(gè)樣品同時(shí)分析，減少了外界因素的干擾，從而提高檢測(cè)的準(zhǔn)確性。此外，基因芯片技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)、快速的全自動(dòng)檢測(cè)分析和高精密度、高靈敏度分析。

秦智鋒等[8]利用 39個(gè)目的片段，同時(shí)加入λDNA作為坐標(biāo)基因制備的基因芯片，可對(duì)臨床上癥狀相似的4種水皰性疾病進(jìn)行快速大批量的鑒別診斷。楊素等[9]利用分子克隆的方法分別獲得口蹄疫病毒、水皰性口炎病毒、藍(lán)舌病病毒、鹿流行性出血熱病毒和赤羽病病毒各一段高度保守的基因片段，將其固化在包被過的玻璃片上，制備成檢測(cè)芯片，實(shí)現(xiàn)了對(duì)該5種病毒的快速有效診斷。該方法檢測(cè)效率高，特異性強(qiáng)，靈敏度高，可應(yīng)用于對(duì)多種動(dòng)物傳染病的大規(guī)模篩檢、快速檢測(cè)和鑒別診斷，尤其是可用于進(jìn)出境動(dòng)物檢驗(yàn)檢疫。此外，基因芯片技術(shù)還被應(yīng)用于細(xì)菌分型的鑒定及耐藥性的測(cè)定[10]?；蛐酒夹g(shù)有高通量、多參數(shù)、高靈敏度與自動(dòng)化的優(yōu)點(diǎn)，但同時(shí)由于設(shè)備昂貴、基因芯片技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)化、成本高，以及待測(cè)靶探針標(biāo)記方法繁瑣等問題，目前其在動(dòng)物疫病檢測(cè)方面的應(yīng)用還受到一定的制約，隨著技術(shù)的不斷完善和成熟，檢測(cè)設(shè)備低廉化以及操作程序簡(jiǎn)約化，將來會(huì)為動(dòng)物疫病檢測(cè)帶來更大的飛躍。

1.3 核酸恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)

核酸恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)是將PCR擴(kuò)增反應(yīng)過程進(jìn)行恒溫控制的一種新型擴(kuò)增技術(shù)。相對(duì)于傳統(tǒng)的PCR技術(shù)，該反應(yīng)對(duì)儀器設(shè)備的要求簡(jiǎn)化，同時(shí)反應(yīng)時(shí)間大幅縮短，反應(yīng)結(jié)果肉眼可見。由于該技術(shù)潛在的巨大應(yīng)用前景促使了多種不同形式的恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的產(chǎn)生。

2000年 Notomi等[11]建立了環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增法（LAMP），通過識(shí)別靶序列上6個(gè)特異區(qū)域的引物和具有鏈置換特性的DNA聚合酶，在等溫條件下快速、高效、特異地?cái)U(kuò)增靶序列。LAMP在反應(yīng)過程中，能夠產(chǎn)生大量的白色焦磷酸鎂沉淀，而且可以通過焦磷酸鎂沉淀的產(chǎn)生量與DNA生成量之間的線性關(guān)系，對(duì)整個(gè)反應(yīng)進(jìn)行定量。Dukes等[12]采用RT-LAMP方法快速檢測(cè)口蹄疫病毒，能夠在22 min內(nèi)便可得到檢測(cè)結(jié)果，且可以檢測(cè)到僅10個(gè)拷貝的口蹄疫病毒。Imai等[13]利用RTLAMP建立了針對(duì)H5亞型的高致病性禽流感病毒的檢測(cè)方法，該方法的敏感性是傳統(tǒng)PCR的100倍。Chen等[14]建立了對(duì)豬繁殖與呼吸綜合征病毒的RT-LAMP檢測(cè)方法，與RT-PCR檢測(cè)手段相比，該方法更靈敏、更可靠、更便捷。

Compton[15]于 1991 年在 PCR 技術(shù)基礎(chǔ)上提出了核酸擴(kuò)增技術(shù)（NASBA），目前該技術(shù)已經(jīng)相對(duì)成熟地應(yīng)用于病原體與基因異常的檢測(cè)、動(dòng)物疫病診斷等領(lǐng)域當(dāng)中。Collins等[16-18]所建立的NASBA技術(shù)可以對(duì)口蹄疫的血清型進(jìn)行檢測(cè)，且實(shí)現(xiàn)了H7型禽流感的快速檢測(cè)，并通過改良使其能夠鑒別出高致病性禽流感和低致病性禽流感。我國(guó)2004年發(fā)布的系列標(biāo)準(zhǔn)GB/T 19439—2004《H5亞型禽流感病毒NASBA檢測(cè)方法》和GB/T 19440—2004《禽流感病毒NASBA檢測(cè)方法》均采用NASBA檢測(cè)方法對(duì)禽流感病毒進(jìn)行測(cè)定。

此外，建立在恒溫?cái)U(kuò)增基礎(chǔ)上的還有切口酶核酸恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù) （NEMA）、轉(zhuǎn)錄酶擴(kuò)增技術(shù)（TMA）、鏈置換擴(kuò)增技術(shù)（SDA）、滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)（RCA）、解旋酶擴(kuò)增技術(shù)（HDA）、實(shí)時(shí)熒光核酸恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)技術(shù)（SAT）等，這些技術(shù)因存在成本高等問題，目前還處于研究階段。相信隨著儀器設(shè)備的升級(jí)、成本的降低、技術(shù)的完善，這些技術(shù)將會(huì)更便捷地應(yīng)用于動(dòng)物疫病的檢測(cè)中。

1.4 其他分子診斷技術(shù)

隨著學(xué)科的交叉，分子生物學(xué)的日新月異，越來越多的新技術(shù)與PCR技術(shù)進(jìn)行結(jié)合，建立了實(shí)用效果越來越好的檢測(cè)技術(shù)，并已經(jīng)應(yīng)用到動(dòng)物疫病的檢測(cè)當(dāng)中。

2010年馬艷琴[19]建立了PCR-斑點(diǎn)雜交技術(shù)，設(shè)計(jì)了豬源支原體PCR通用外套引物和豬肺炎支原體種特異性內(nèi)套引物及地高辛標(biāo)記寡核苷酸探針，應(yīng)用于豬瘟活疫苗中豬肺炎支原體污染的檢測(cè)，相對(duì)于套式PCR法，敏感性更好，檢出率提高了10%。程安春等[20]建立了原位PCR（ISPCR）技術(shù)，對(duì)石蠟切片中鴨病毒性腸炎病毒（DEV）核酸進(jìn)行定位，該方法直觀、敏感、特異性強(qiáng)，在顯示核酸陽(yáng)性信號(hào)的同時(shí)，還能判別含有靶序列的細(xì)胞類型以及組織細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)特征與病理變化。楊利峰等[21]將PCR與免疫學(xué)技術(shù)聯(lián)用，建立了豬瘟RT-PCR ELISA診斷方法，克服了組織樣品中豬瘟病毒含量少而難以檢測(cè)的困難，為豬瘟的早期診斷和分子流行病學(xué)調(diào)查提供了一條新途徑。不同病原體診斷技術(shù)的相互聯(lián)用，進(jìn)一步提升了診斷的準(zhǔn)確性，為臨床疫病的確診與防治提供了決策依據(jù)。

2 新型分子診斷技術(shù)的發(fā)展趨勢(shì)與前景展望

動(dòng)物疾病檢測(cè)的快速有效性在臨床疫病的防控中起著非常重要的作用。傳統(tǒng)的分子診斷技術(shù)，如核酸雜交技術(shù)、限制性酶切技術(shù)、核酸片段多樣性分析等，存在操作步驟繁瑣、周期長(zhǎng)、成本高、有假陽(yáng)性或假陰性結(jié)果呈現(xiàn)等缺點(diǎn)，在動(dòng)物疫病診斷中的應(yīng)用受到了一定的限制。隨著分子檢測(cè)技術(shù)的不斷進(jìn)步，近年來建立在PCR技術(shù)基礎(chǔ)上的新型核酸診斷技術(shù)，具有敏感性高、特異性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)便、診斷快速等優(yōu)勢(shì)，已經(jīng)越來越多地被應(yīng)用于動(dòng)物疫病的檢測(cè)當(dāng)中。

多重?zé)晒釶CR和生物芯片技術(shù)等技術(shù)實(shí)現(xiàn)了一次反應(yīng)同時(shí)檢測(cè)多種病原的高效檢測(cè)，適用于混合感染和未知感染的篩查和快速診斷。隨著核酸提取、加樣檢測(cè)和分析等環(huán)節(jié)儀器裝置的自動(dòng)化研制，使得樣品的處置量、提取的穩(wěn)定性和自動(dòng)化程度提高。隨著儀器設(shè)備的研發(fā)，檢測(cè)成本的降低，技術(shù)成熟度的提高，適用于基層和現(xiàn)場(chǎng)使用的檢測(cè)技術(shù)將成為動(dòng)物疫病檢測(cè)的一個(gè)發(fā)展趨勢(shì)。同時(shí)，結(jié)合其他的診斷技術(shù)，更多新型診斷方法使檢測(cè)的樣品數(shù)量和病原體種類更多，涉及領(lǐng)域也會(huì)不斷增加，動(dòng)物的疫病檢測(cè)診斷將會(huì)更加快速、準(zhǔn)確、全面?，F(xiàn)代分子診斷技術(shù)不僅僅用于臨床診斷和鑒別診斷，其具有高通量、自動(dòng)化、精密化等特點(diǎn)，在大范圍的流行病學(xué)調(diào)查和分析方面也能夠發(fā)揮巨大的優(yōu)勢(shì)，為動(dòng)物疫病的傳播范圍和傳播途徑的研究提供支持，從而為動(dòng)物疫病的科學(xué)防控奠定基礎(chǔ)。

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