培養(yǎng)基血清質(zhì)量和濃度的不同對(duì)腸干細(xì)胞群分離培養(yǎng)的影響

劉冠琳，程躍，謝國(guó)海，嚴(yán)澤軍，袁鶴勝

作者單位： 315010寧波，寧波大學(xué)附屬寧波市第一醫(yī)院，寧波市泌尿系疾病轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

哺乳動(dòng)物的小腸黏膜上皮是機(jī)體營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收的主要場(chǎng)所，腸黏膜上皮終生進(jìn)行著不間斷的自我更新，因?yàn)槲挥谀c道隱窩部位的干細(xì)胞保持著旺盛的增殖分化能力。凋亡脫落及受損壞死的細(xì)胞與干細(xì)胞增殖、分化之間保持著動(dòng)態(tài)平衡，由此可見(jiàn)腸道干細(xì)胞在維持腸道屏障結(jié)構(gòu)和功能完整以及損傷后的修復(fù)中扮演著重要角色。因此，利用體外培養(yǎng)技術(shù)對(duì)腸干細(xì)胞進(jìn)行原代培養(yǎng)，有助于進(jìn)一步了解影響腸道干細(xì)胞增殖和分化的因素及機(jī)制，對(duì)臨床治療腸道損傷和某些代謝性疾?。ㄈ缑谀蛳到Y(jié)石）將有重要的意義[1-3]。血清的質(zhì)量和濃度對(duì)原代細(xì)胞的貼壁和生長(zhǎng)有著相當(dāng)大的影響，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)常用血清和其濃度進(jìn)行篩選，擬找到相對(duì)適合腸干細(xì)胞群分離培養(yǎng)的血清種類(lèi)及最佳濃度。報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 發(fā)情期昆明系小白鼠6只，雌性4只，雄性2只，購(gòu)自華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，2：1同籠交配，陰栓檢出日記為受孕第1天。

細(xì)胞培養(yǎng)基為用于細(xì)胞生長(zhǎng)的液體培養(yǎng)基。具體配制方法為：DMEM培養(yǎng)液中加入新生牛血清或胎牛血清（均購(gòu)自GIBYCO公司），血清的濃度分別為5%、10%、15%及20%。除此以外，8種培養(yǎng)基中還含有以下成分，表皮生長(zhǎng)因子20ng/ml，胰島素2g/ml，谷氨酰胺2 mmol/ml，青霉素及鏈霉素各100 U/ml。酶消化液的配制：本實(shí)驗(yàn)中腸干細(xì)胞的分離采用酶消化法，所用的酶消化液含有2種成分：透明質(zhì)酸酶（購(gòu)自Sigma公司，工作液濃度為100 U/ml），Ⅺ型膠原酶（購(gòu)自Sigma公司，工作液濃度為300U/ml）。

細(xì)胞清洗液的配制：細(xì)胞清洗液采用加入了5%新生牛血清的DMEM培養(yǎng)液。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 腸干細(xì)胞群的分離和培養(yǎng) 取孕17d昆明系小白鼠，采用斷頸法處死，先打開(kāi)腹腔取出胚胎置于無(wú)菌培養(yǎng)皿中。而后打開(kāi)胎盤(pán)取出胚胎鼠腸組織，置于細(xì)胞清洗液中，去除腸系膜，經(jīng)反復(fù)清洗（3次）后剪碎腸組織。將剪碎的腸組織用酶消化液進(jìn)行消化，20 min后采用離心法(1 000 r/min，5 min)終止消化；然后通過(guò)反復(fù)沉降（5次，1 min/次），去除絕大多數(shù)成纖維細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞等雜質(zhì)細(xì)胞；最后，將通過(guò)離心（1 000 r/min，5 min）獲得的細(xì)胞分別用8種細(xì)胞培養(yǎng)基溶解，種植于同一24孔板中（購(gòu)自Corning公司），放置在二氧化碳恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)。48h后進(jìn)行第1次換液，以后每72小時(shí)換液1次。連續(xù)觀察、記錄細(xì)胞生長(zhǎng)情況。封二彩圖1為經(jīng)分離后得到的腸絨毛細(xì)胞團(tuán)懸浮液，圖中可見(jiàn)分離出的單個(gè)細(xì)胞及腸絨毛細(xì)胞團(tuán)。

1.2.2 腸干細(xì)胞群的鑒定 將所得的原代細(xì)胞傳5代后（約25d），將細(xì)胞轉(zhuǎn)至事先裝有蓋玻片的24孔板中，行細(xì)胞爬片，每72小時(shí)換液1次。7 d后，固定細(xì)胞（固定液由丙酮和無(wú)水乙醇按1∶1配制）。將所得細(xì)胞爬片用角蛋白18亞型抗體及波形蛋白抗體（購(gòu)自Sigma公司）行免疫組化染色，以鑒定細(xì)胞的組織來(lái)源。

2 結(jié)果

2.1 腸干細(xì)胞群的形態(tài)及生長(zhǎng)方式 24～48h后，細(xì)胞開(kāi)始貼壁生長(zhǎng)。顯微鏡下可見(jiàn)，除采用10%新生牛血清組外，其他組細(xì)胞均含有大量呈梭狀的間質(zhì)細(xì)胞，上皮細(xì)胞所占比例不足5%（封二彩圖2）。而采用含10%的新生牛血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，則貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞絕大部分為上皮細(xì)胞。上皮樣細(xì)胞呈集落狀生長(zhǎng)，主要有三種集落。其中，由典型上皮構(gòu)成的集落約占30%（封二彩圖3），由扁平上皮細(xì)胞構(gòu)成的集落約占20%（封二彩圖4），2種細(xì)胞混合生長(zhǎng)的集落約占50%。

血清濃度為10%時(shí)，腸干細(xì)胞群在第3、4代達(dá)到生長(zhǎng)分化的頂峰；而后干細(xì)胞逐漸減少，成熟的腸上皮細(xì)胞逐漸增多，直至最終凋亡。經(jīng)1個(gè)多月的培養(yǎng)，傳至第7～8代，腸干細(xì)胞群開(kāi)始凋亡。上皮細(xì)胞在傳代生長(zhǎng)的過(guò)程中，細(xì)胞形態(tài)逐漸改變，有些細(xì)胞在形態(tài)上類(lèi)似于成纖維細(xì)胞等間質(zhì)細(xì)胞，但角蛋白18亞型抗體染色為陽(yáng)性。而其他組的細(xì)胞，可一直持續(xù)生長(zhǎng)，但經(jīng)過(guò)傳代，上皮細(xì)胞仍會(huì)逐漸減少。

2.2 腸干細(xì)胞群的鑒定 將采用含 10%的新生牛血清培養(yǎng)基培養(yǎng)出的腸干細(xì)胞群傳至第5代后，將獲得的細(xì)胞行細(xì)胞爬片后用角蛋白18亞型抗體（購(gòu)自Sigma公司）行免疫組化染色，結(jié)果為陽(yáng)性（封二彩圖5），而用波形蛋白抗體染色，其結(jié)果為陰性。同時(shí)，由于培養(yǎng)出的細(xì)胞群能進(jìn)行5次以上的傳代，說(shuō)明所培養(yǎng)的細(xì)胞中含有大量的有功能的腸干細(xì)胞。而其他組的細(xì)胞做相同的處理后，用角蛋白18亞型抗體行免疫組化染色，結(jié)果為陰性，而用波形蛋白抗體染色，其結(jié)果為陽(yáng)性。

3 討論

腸干細(xì)胞是位于小腸黏膜隱窩底部的未分化細(xì)胞，它以對(duì)稱(chēng)分裂和不對(duì)稱(chēng)分裂兩種方式來(lái)維持隱窩內(nèi)穩(wěn)定的干細(xì)胞數(shù)量,并通過(guò)短暫擴(kuò)增細(xì)胞，增殖分化成5種不同表型的終末細(xì)胞，即潘氏細(xì)胞、杯狀細(xì)胞、內(nèi)分泌細(xì)胞、腸吸收細(xì)胞和M細(xì)胞[4-5]。腸干細(xì)胞群的構(gòu)建對(duì)進(jìn)一步研究腸損傷和某些代謝性疾?。ㄈ缑谀蛳到Y(jié)石）有著重要的意義。原代細(xì)胞培養(yǎng)，最為困難的環(huán)節(jié)就是細(xì)胞的純化。以往國(guó)外文獻(xiàn)報(bào)道中，小鼠腸干細(xì)胞群的構(gòu)建，所得細(xì)胞群多為間質(zhì)細(xì)胞和上皮細(xì)胞混和生長(zhǎng)。這樣培養(yǎng)出來(lái)的細(xì)胞群固然有利于研究腸黏膜上皮的生長(zhǎng)分化機(jī)制，但卻給腸干細(xì)胞本身的研究以及基因治療方法的探索造成了不小的困難。就當(dāng)前的技術(shù)條件而言，獲得絕對(duì)純的腸干細(xì)胞是不可能的。但即使獲得組織學(xué)上相對(duì)純化的腸干細(xì)胞群，對(duì)進(jìn)一步的研究也十分有意義。

血清的質(zhì)量和濃度對(duì)原代細(xì)胞的貼壁和生長(zhǎng)有著相當(dāng)大的影響[6]，選擇合適的血清質(zhì)量和濃度有著十分重要的意義。國(guó)外相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道中，腸干細(xì)胞群的構(gòu)建一般采用的是10%的小牛血清[7]，如前所述，效果不甚理想。本研究通過(guò)對(duì)胎牛血清和新生牛血清的幾種常用血清濃度進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞培養(yǎng)基采用10%的新生牛血清時(shí)，貼壁細(xì)胞絕大部分為成集落狀生長(zhǎng)的上皮細(xì)胞，與國(guó)外報(bào)道的細(xì)胞形態(tài)基本符合，但雜質(zhì)細(xì)胞卻很少見(jiàn)到。由此可見(jiàn)，采用含10%新生牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)基進(jìn)行腸干細(xì)胞群的構(gòu)建可以獲得較為純化的腸干細(xì)胞群。當(dāng)然，具體機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

目前，腸道干細(xì)胞生物學(xué)研究仍存在一個(gè)缺憾，即還沒(méi)有一種得到公認(rèn)的、能用于分離和培養(yǎng)腸干細(xì)胞的特異性標(biāo)志物。因此，本實(shí)驗(yàn)只能通過(guò)細(xì)胞形態(tài)學(xué)、功能狀況以及免疫組化等3個(gè)方面綜合進(jìn)行細(xì)胞鑒定。如前所述，本次實(shí)驗(yàn)所培養(yǎng)出的細(xì)胞就形態(tài)學(xué)而言，已出現(xiàn)與國(guó)外文獻(xiàn)報(bào)道基本符合的3種細(xì)胞集落。就功能而言，細(xì)胞能存活1個(gè)月以上，且至少能傳7～8代，這說(shuō)明細(xì)胞群中必然含有大量的干細(xì)胞。國(guó)外相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，角蛋白18亞型在腸干細(xì)胞所在集落中特異性表達(dá)[7]。將傳代后的細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞爬片，行免疫組化染色，角蛋白18亞型抗體染色為陽(yáng)性，說(shuō)明細(xì)胞的組織學(xué)來(lái)源沒(méi)有錯(cuò)誤。由于間質(zhì)細(xì)胞波形蛋白染色多表現(xiàn)為陽(yáng)性，所以本研究中對(duì)所有的細(xì)胞均進(jìn)行波形蛋白染色，結(jié)果顯示，其他組細(xì)胞染色均為陽(yáng)性，而采用10%的新生牛血清培養(yǎng)的細(xì)胞染色結(jié)果為陰性，這更進(jìn)一步證明所獲得的細(xì)胞組織學(xué)來(lái)源的正確性。

綜上所述，腸干細(xì)胞群的構(gòu)建可以達(dá)到在組織學(xué)上的純化，這不僅僅是一種方法學(xué)上的改進(jìn)，對(duì)于腸干細(xì)胞本身的研究以及基因治療方法的探索都有著重要的意義。