天花粉蛋白對肝癌細胞的放射增敏作用及機制研究

陳幼芬，夏釹，田炳如

作者單位： 315400浙江省余姚，余姚市人民醫(yī)院

天花粉蛋白是從我國傳統(tǒng)中藥葫蘆科植物栝蔞中提取的I型單鏈核糖體失活蛋白，最初主要用于婦科疾病的治療。隨后研究發(fā)現(xiàn)，天花粉蛋白對眾多腫瘤具有抗瘤作用，提示天花粉蛋白可能成為腫瘤治療的一個新靶點。本研究采用天花粉蛋白處理人肝癌細胞株 HepG2細胞，旨在探討其對肝癌放射敏感性的影響及其可能作用機制。

陳幼芬，夏釹，田炳如.天花粉蛋白對肝癌細胞的放射增敏作用及機制研究

圖1 天花粉蛋白對放射誘導(dǎo)HepG2細胞凋亡的影響（Annexin V-FITC-PI雙染法

圖2 透射電鏡觀察HepG2細胞凋亡（A為正常細胞 B為凋亡細胞）

1 資料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株 人肝癌細胞株 HepG2由浙江大學醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院提供。

1.1.2 主要試劑與儀器 天花粉蛋白購自上海金山制藥有限公司。Annexin VFITCKit購自 Immunotech Company（France）。Epics-XLⅡ型流式細胞儀（Beckman-Coulter Company，USA），JEM-1230型透射電鏡（LEOLCompany，Japan）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) HepG2培養(yǎng)于含10%滅活胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，置37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)。取指數(shù)生長期細胞進行實驗。

1.2.2 MTT法檢測藥物毒性及適宜濃度 以每孔6×103個細胞接種于96孔板，貼壁后加入天花粉蛋白，其濃度設(shè)0、25、50、100、200 mol/L 5個濃度組，每個濃度組各取12、24、48、72h 4個時間點檢測，設(shè)不接種細胞的空白對照和只含 1‰DMSO的對照組，每濃度每時間點重復(fù)4孔。采用 MTT法在酶聯(lián)免疫檢測儀上測定490 nm處吸光度值（A），細胞存活率（%）=實驗孔A值/對照孔A值×100%。

1.2.3 克隆形成實驗分析放射增敏效應(yīng)

制備單細胞懸液，根據(jù)不同照射劑量接種適量細胞于75 mm2培養(yǎng)皿中，實驗分兩組：（1）單照組：細胞接種24h貼壁，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，室溫下分別接受0、2、4、6、8、10 Gy 的 6MV X-ray 照射；（2）聯(lián)合組：照射＋天花粉蛋白處理。細胞接種24h貼壁，聯(lián)合組更換含50 mol/L的天花粉蛋白培養(yǎng)液，兩組繼續(xù)培養(yǎng)24h，室溫下分別接受 0、2、4、6、8、10 Gy的6MV X-ray照射，照射后聯(lián)合組更換無藥培養(yǎng)液與單照組一起繼續(xù)培養(yǎng)14d。甲醇固定，姬姆薩染色，計數(shù)＞50個細胞克隆數(shù)。經(jīng)單純用藥校正后計算存活分數(shù)（SF），實驗結(jié)果為3次平均值。以多靶單擊數(shù)學模型擬合細胞存活曲線，計算參數(shù)平均致死劑量（D0）、準閥劑量（Dq）及放射增敏比（SER）值。

1.2.4 流式細胞術(shù)（FCM）檢測細胞凋亡率 實驗分4組：（1）未處理組；（2）單藥組：含50 mol/L的天花粉蛋白培養(yǎng)液培養(yǎng) 24 h；（3）單照組：6 Gy 照射劑量；（4）聯(lián)合組（照射+藥物）。各組取處理后細胞 1×106個，按Annexin V-FITCKit說明書操作，加PI和Annexin V-FITC雙染液上機檢測，利用Coulter公司的SystemⅡTM軟件處理結(jié)果，每次實驗均設(shè)陰性和陽性對照，并設(shè)3復(fù)孔。

1.2.5 透射電鏡觀察凋亡 收集聯(lián)合組HepG2細胞，2.5%戊二醛固定，2%瓊脂包埋，再用1%鋨酸固定，逐級乙醇脫水，氧化丙烯浸透，樹脂包埋，超薄切片機切片，透射電子顯微鏡下觀察并攝影。

1.3 統(tǒng)計學方法 應(yīng)用SPSS15.0統(tǒng)計軟件進行分析，計量資料用±標準差表示，多組比較采用方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗。計數(shù)資料采用2檢驗；P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 天花粉蛋白對HepG2細胞生長的影響 MTT法測定結(jié)果顯示，天花粉蛋白對 HepG2細胞有明顯的抑制生長作用，24 h其細胞存活率最高為（95.97±2.13）%（25 mol/L），最低為（64.20±2.29）%（200 mol/L)，IC50 為266.5 mol/L。為盡量避免藥物本身對細胞的毒性作用，在隨后的實驗中天花粉蛋白都采用50 mol/L濃度。

2.2 天花粉蛋白的放射增敏作用 天花粉蛋白可顯著增加 HepG2細胞的放射敏感性（圖1）。單照組和聯(lián)合組的D0值分別1.74、1.35Gy；Dq值分別為2.46、1.56 Gy；SER 為 1.30。

2.3 天花粉蛋白誘導(dǎo)凋亡 FCM 顯示單藥組的凋亡率為（6.03±0.98）%，單照組為（7.64±1.13）%，未處理組為（1.73±0.49）%，聯(lián)合組為（17.90±2.01）%；4組凋亡率差異有統(tǒng)計學意義（F=9.28，P＜0.05）。單藥組和單照組的凋亡率高于未處理組（均P＜0.05），聯(lián)合組凋亡率明顯高于單照組和單藥組（均P＜0.05）。見封四彩圖1。

2.4 透射電鏡觀察 經(jīng)藥物聯(lián)合照射處理后的細胞體積縮小，胞膜完整，但發(fā)生皺縮，染色質(zhì)凝聚、固縮、邊聚，部分出現(xiàn)核碎裂，胞質(zhì)出芽，凋亡小體形成。見封四彩圖2。

3 討論

天花粉蛋白是從中藥天花粉中提取純化的一種活性蛋白，已有研究提示具有抑制腫瘤細胞增殖，促進腫瘤細胞凋亡[1-3]；增強NK細胞的殺傷活性[4]以及免疫調(diào)節(jié)[5]等作用，有著良好的研究前景及應(yīng)用價值。本研究發(fā)現(xiàn)25～200 mol/L濃度的天花粉蛋白對HepG2細胞均有增殖抑制作用；天花粉蛋白聯(lián)合放射組的細胞生存率較單照組明顯降低，即天花粉蛋白對HepG2細胞具有明顯的放射增敏作用。

細胞凋亡是一種受基因調(diào)控的不同于細胞壞死的特殊類型的細胞死亡，在抗癌藥物的藥理機制研究中占有重要地位，近年來倍受醫(yī)學界的關(guān)注。齊躍東[1]的研究提示天花粉蛋白通過干擾人大腸癌細胞株 LoVo、人結(jié)腸癌細胞株SW-1116及人胃癌細胞株MKN-45的細胞增殖，誘發(fā)細胞凋亡來實現(xiàn)抗腫瘤作用。You等[6]的研究也提示天花粉蛋白增加TRAIL抵抗非小細胞肺癌的細胞凋亡及細胞周期阻滯。Zhang等[7]在對幾種傳統(tǒng)中藥對腫瘤研究中發(fā)現(xiàn)天花粉蛋白通多 Bcl-PARP通路誘導(dǎo)對肝癌細胞的凋亡誘導(dǎo)作用最為明顯。本研究發(fā)現(xiàn)天花粉蛋白通過誘導(dǎo)HepG2細胞的凋亡，實現(xiàn)抗腫瘤作用，與上述研究結(jié)果一致。

綜上所述，在腫瘤的放射治療中，放射導(dǎo)致細胞凋亡是放射誘導(dǎo)腫瘤細胞死亡的一種形式。放射誘導(dǎo)DNA損傷，激活的P53進行損傷修復(fù)，不可修復(fù)的損傷將激活凋亡信號通路誘導(dǎo)細胞凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)放射可誘導(dǎo)HepG2細胞的凋亡，且天花粉蛋白可進一步上調(diào)放射對 HepG2細胞的凋亡誘導(dǎo)作用；其增敏機制可能與上調(diào)細胞凋亡有關(guān)，相關(guān)機制有待進一步探討。ACS Appl Mater Interfaces,2017,9(32)：26648-26664.

圖1 HepG2細胞單照射和聯(lián)合天花粉蛋白作用后的生存曲線