耳蝸干細(xì)胞移植聯(lián)合中藥干預(yù)對感音性耳聾治療效果的影響

周 衛(wèi)，何慶文（武漢市第六醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科，武漢 430015）

據(jù)相關(guān)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，我國絕大部分聽力語言殘疾者均為感音性耳聾[1-3]。感音性耳聾常見的病因多為耳蝸與耳蝸后等部位出現(xiàn)病變，如噪聲性聾、藥物中毒性聾、老年性聾、先天性感音性耳聾等[4-6]。由于人類毛細(xì)胞的再生能力相對較弱，再加上毛細(xì)胞的損傷不可逆，故感音性耳聾在臨床上的治療一直比較棘手。近年來，有學(xué)者研究報道稱用中藥加以干預(yù)對感音性耳聾治療能有效解決上述問題[7-8]。本文旨在探討耳蝸干細(xì)胞移植聯(lián)合中藥干預(yù)對感音性耳聾治療效果的影響，為臨床上感音性耳聾患者的治療提供一定的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)計(jì) 隨機(jī)選取正常健康成年并且耳廓反射靈敏的豚鼠120只，雌雄兼有，清潔級，體質(zhì)量（221±32）g。其中20只含藥血清制備，100只用于造模；另外選20只剛出生豚鼠（P0）用于耳蝸干細(xì)胞的培養(yǎng)，體質(zhì)量為（6.1±0.6）g。將感音性耳聾豚鼠分成空白對照組，耳蝸干細(xì)胞移植組和干細(xì)胞移植+中藥干預(yù)組，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)為隨機(jī)對照動物實(shí)驗(yàn)。

1.2 主要試劑及儀器 美國Sigma公司生產(chǎn)的胰蛋白酶、MyosinⅦA抗體、Nestin抗體、BrdU抗體，美國Gibco公司生產(chǎn)的堿性成纖維生長因子、B27、胎牛血清。金壇市恒豐儀器廠生產(chǎn)的恒溫水浴箱；美國Healfare公司生產(chǎn)的二氧化碳培養(yǎng)箱；吳江市凈化設(shè)備總廠生產(chǎn)的凈化等級100級超凈工作臺；德國Leica公司生產(chǎn)的熒光顯微鏡、倒置顯微鏡以及丹麥生產(chǎn)的聽覺腦干電位儀。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 分組及建模 取清醒狀態(tài)下的雙耳聽閾正常的豚鼠放于籠內(nèi)，并將其固定于消聲室自由聲場中。其中豚鼠雙耳距離脈沖噪聲聲源（間隔時間為20 s，脈寬為0.25 ms，壓力峰值為180.0 dB SPL）15 cm，暴露次數(shù)為300次。在完成噪聲暴露后1周，對上述豚鼠進(jìn)行ABR相關(guān)測試，并將20、16、8、4 kHz各頻率，豚鼠雙耳ABR閾值不小于60 dB SPL的豚鼠選為此次研究的備選動物。隨機(jī)將感音性耳聾豚鼠分成空白對照組（n = 30），耳蝸干細(xì)胞移植組（n = 30）和干細(xì)胞移植+中藥干預(yù)組（n =30）。

1.3.2 干細(xì)胞培養(yǎng) 取20只出生不久的豚鼠，使用2 mL 10%的水合氯醛進(jìn)行腹腔注射麻醉后將內(nèi)耳耳蝸取出，并將相關(guān)血管及表面結(jié)締組織去除，將Corti器進(jìn)行分離，反復(fù)用HBSS液進(jìn)行多次沖洗，然后剪成碎片，在37 ℃下用胰蛋白酶將上述碎片進(jìn)行消化，25 min后用銅網(wǎng)（200目）進(jìn)行過濾，將濾液置于離心機(jī)上進(jìn)行離心4 min，轉(zhuǎn)速設(shè)置為1000 r/min，并用吸管對離心后的濾液進(jìn)行輕柔吹打，裝入培養(yǎng)瓶，置于體積分?jǐn)?shù)為5%、環(huán)境溫度為37 ℃的CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中，半量培養(yǎng)基每隔3 d進(jìn)行一次置換，每隔7 d左右進(jìn)行一次傳代，免疫熒光鑒定以BrdU和Nestin進(jìn)行。

1.3.3 歸芪地黃湯含藥血清 歸芪地黃湯中包括當(dāng)歸、黃芪、澤瀉、茯苓、山藥、牡丹皮、山茱萸、熟地黃8味藥，根據(jù)相關(guān)成方常用劑量（2:4:3:3:3:4:4:8）進(jìn)行配伍而成。在1～6 d早晚各以劑量為20 mL/kg灌胃方式給實(shí)驗(yàn)豚鼠給藥，經(jīng)眼眶采血在第7天一次給藥全天劑量后1 h進(jìn)行。并將所采集的血液置于4 ℃環(huán)境下靜置1 h，然后置于離心機(jī)上進(jìn)行離心20 min，轉(zhuǎn)速設(shè)置為1 000 r/min，將上述分離后的血清置于56 ℃進(jìn)行滅活30 min后過濾分裝，濾膜為微孔濾膜，保存于-20 ℃冰箱中備用。

1.3.4 耳蝸干細(xì)胞移植 干細(xì)胞移植在造模后3個月進(jìn)行，將豚鼠麻醉后切開左耳后分層，鉆取耳蝸底周鼓階外側(cè)壁下方一個0.2 mm的小孔，經(jīng)小孔注入細(xì)胞濃度為4.0×108/L的 細(xì)胞懸液10 μL；對照組注入生理鹽水作為空白對照；干細(xì)胞移植+中藥干預(yù)組則注入細(xì)胞濃度為3.5×108/L含藥血清的細(xì)胞懸液10 μL（體積分?jǐn)?shù)為10%）。完成注入后，對鉆孔進(jìn)行封堵，將切口逐層進(jìn)行縫合，術(shù)后并予抗生素預(yù)防感染。

1.3.5 聽閾測試 在完成耳蝸干細(xì)胞移植后7 d，28 d，56 d，10%的水合氯醛進(jìn)行腹腔注射麻醉后固定豚鼠，

在其顱頂放置記錄電極，左耳乳突放置參考電極，右耳乳突放置接地電極，使用交替短聲（0.10 ms）對豚鼠進(jìn)行刺激。對相關(guān)ⅴ波波形及閾值進(jìn)行觀察記錄。1.3.6 免疫熒光染色 以Nestin免疫熒光染色鑒定培養(yǎng)干細(xì)胞成功后，使用BrdU對細(xì)胞核進(jìn)行標(biāo)記移植，用MyosinⅦA免疫熒光染色檢測在完成標(biāo)記移植后7 d、28 d、56 d分化的毛細(xì)胞，使用熒光顯微鏡進(jìn)行鏡下觀測，并對鏡下視野均值進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對本次數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)的分析，采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示計(jì)量資料，并采用方差分析的方法對組間計(jì)量資料的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。P＜0.05為組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 感音性耳聾模型 經(jīng)過連續(xù)噪聲刺激后實(shí)驗(yàn)豚鼠出現(xiàn)不同程度的聽力下降、體質(zhì)量下降以及煩躁，在完成噪聲暴露后1周，對上述豚鼠進(jìn)行ABR相關(guān)測試發(fā)現(xiàn)均不小于80 dB SPL，顯微鏡鏡下可見內(nèi)耳毛細(xì)胞部分出現(xiàn)死亡、萎縮和倒伏見圖1（插頁二）。

2.2 耳蝸干細(xì)胞的鑒定及培養(yǎng) 在熒光顯微鏡下可見原代豚鼠耳蝸干細(xì)胞在培養(yǎng)皿中生長狀況良好，單細(xì)胞外觀呈類圓形，培養(yǎng)至4 d后有成團(tuán)趨勢，見圖2（插頁二）；干細(xì)胞經(jīng)Nestin熒光染色檢測顯示為陽性，此細(xì)胞增殖良好，經(jīng)BrdU標(biāo)記細(xì)胞核后確定所培養(yǎng)皿中生長的細(xì)胞為干細(xì)胞。

2.4 免疫熒光檢測結(jié)果及ABR閾值測定 耳蝸干細(xì)胞移植組和干細(xì)胞移植+中藥干預(yù)組在進(jìn)行干預(yù)后均可觀測到MyosinⅦA陽性細(xì)胞及Nestin 陽性細(xì)胞，與耳蝸干細(xì)胞移植組比較，干細(xì)胞移植+中藥干預(yù)組的MyosinⅦA陽性細(xì)胞及Nestin 陽性細(xì)胞數(shù)量顯著升高，經(jīng)比較2組之間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；在進(jìn)行干預(yù)后，耳蝸干細(xì)胞移植組和干細(xì)胞移植+中藥干預(yù)組ABR 檢測數(shù)值均出現(xiàn)下調(diào)，與耳蝸干細(xì)胞移植組比較，干細(xì)胞移植+中藥干預(yù)組豚鼠的聽力顯著改善。

3 討論

感音性耳聾會對患者的學(xué)習(xí)、人際之間的交往、生活、工作產(chǎn)生不同程度的影響。若2歲前小兒發(fā)生感音性耳聾，聾啞癥的發(fā)生率將會大大提高[9-11]。歸芪地黃湯是由當(dāng)歸、黃芪、澤瀉、茯苓、山藥、牡丹皮、山茱萸、熟地黃8味藥根據(jù)相關(guān)成方常用劑量進(jìn)行配伍而成[12-13]。有學(xué)者研究報道稱用中藥加以干預(yù)對感音性耳聾治療能有效解決上述問題[14]。

研究結(jié)果顯示，在免疫熒光檢測結(jié)果方面，耳蝸干細(xì)胞移植組和干細(xì)胞移植+中藥干預(yù)組在進(jìn)行干預(yù)后均可觀測到MyosinⅦA陽性細(xì)胞及Nestin 陽性細(xì)胞；2組豚鼠鼓階內(nèi)Nestin陽性細(xì)胞球數(shù)量均隨著時間的延長而出現(xiàn)逐漸的下降，但與耳蝸干細(xì)胞移植組比較，干細(xì)胞移植+中藥干預(yù)組的MyosinⅦA陽性細(xì)胞及Nestin 陽性細(xì)胞數(shù)量顯著升高，經(jīng)比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），提示歸芪地黃湯干預(yù)感音性耳聾可以明顯提高耳蝸干細(xì)胞的存活率，效果較為明顯；通過對豚鼠ABR 閾值進(jìn)行檢測本研究還發(fā)現(xiàn)，在完成耳蝸干細(xì)胞移植后28 d 耳蝸干細(xì)胞移植組和干細(xì)胞移植+中藥干預(yù)組的聽力恢復(fù)迅速，速度到達(dá)峰值，ABR閾值下降速度也相應(yīng)達(dá)到最大。在完成干細(xì)胞移植后的56 d 對2組豚鼠ABR閾值進(jìn)一步進(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn)聽力均有相應(yīng)進(jìn)一步的好轉(zhuǎn)，但幅度較緩。與耳蝸干細(xì)胞移植組比較，干細(xì)胞移植+中藥干預(yù)組豚鼠的聽力顯著改善。在完成耳蝸干細(xì)胞移植后7 d對3組豚鼠ABR閾值進(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn)，與空白對照組相比，耳蝸干細(xì)胞移植組和干細(xì)胞移植+中藥干預(yù)組閾值出現(xiàn)輕微的下降，但3組閾值差異不大，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。我們分析，這與在完成耳蝸干細(xì)胞移植后7 d干細(xì)胞分化為毛細(xì)胞的數(shù)量相應(yīng)出現(xiàn)減少有關(guān)[15]。后面我們也從熒光顯微鏡下幾乎不見MyosinⅦA 陽性細(xì)胞而見到大量的Nestin 陽性細(xì)胞證實(shí)了我們的分析。另外我們發(fā)現(xiàn)，耳蝸干細(xì)胞在完成移植后開始大量的分化為毛細(xì)胞，在完成移植后30 d達(dá)到分化峰值，與耳蝸干細(xì)胞移植組比較，干細(xì)胞移植+中藥干預(yù)組的存活率及分化率都明顯升高，表明歸芪地黃湯干預(yù)能夠有效提高耳蝸干細(xì)胞的存活率以及分化為毛細(xì)胞的比例，具有臨床應(yīng)用價值。

綜上所述，耳蝸干細(xì)胞移植聯(lián)合中藥干預(yù)對感音性耳聾治療效果明顯，歸芪地黃湯干預(yù)不僅可以明顯提高耳蝸干細(xì)胞的存活率，還可以明顯提高其分化為毛細(xì)胞的比例，具有臨床應(yīng)用價值。

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