肥厚型心肌病的基因治療研究進(jìn)展

蔣顯超 綜述 王強 審校

(北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 國家心血管病中心 阜外醫(yī)院小兒心臟外科，北京 100037)

肥厚型心肌病(hypertrophic cardiomyopathy,HCM)是導(dǎo)致猝死、心力衰竭及心房顫動(合并腦栓塞性卒中)的重要原因之一[1-3]。HCM全球發(fā)病率超過0.2%，意味著全球患者總數(shù)達(dá)1 200萬[4]。目前HCM治療是基于癥狀改善的藥物及非藥物治療：其中藥物治療包括β受體阻滯劑、非二氫砒啶類鈣離子通道阻滯劑等，而非藥物治療主要包括室間隔消融治療及室間隔肥厚技術(shù)切除手術(shù)(Morrow手術(shù))等；但上述治療不能抑制心肌肥厚的進(jìn)展，患者最終發(fā)展為難治性心力衰竭。近年來，隨著HCM分子生物學(xué)機制研究的不斷深入及心肌特異性病毒載體的發(fā)現(xiàn)，基因治療作為一種新思路逐漸出現(xiàn)在人們的視野。

1 HCM遺傳學(xué)基礎(chǔ)

HCM是一種單基因常染色體顯性遺傳性疾病[5]。HCM心肌肥厚是由于編碼肌節(jié)蛋白的基因突變，導(dǎo)致心肌收縮裝置鈣離子敏感性增高或心肌細(xì)胞壓力增加而誘發(fā)的一種“代償性”表現(xiàn)[6]。目前研究顯示，發(fā)生于11個編碼肌節(jié)或者相鄰Z盤之間區(qū)域粗、細(xì)肌絲收縮蛋白基因的約1 400個突變與HCM發(fā)病相關(guān)。其中70%的基因突變發(fā)生于β肌球蛋白重鏈(其編碼基因名稱MYH7)及肌球蛋白結(jié)合蛋白C[cardiac myosin-binding protein C，cMyBP-C(其編碼基因名稱MYBPC3)]，而肌鈣蛋白T(其編碼基因名稱TNNT2)和其他幾種相對少見基因突變各占5%[5,7]。

2 HCM基因治療

基因治療的理論基礎(chǔ)主要包括三個方面：(1)替換、彌補異常基因或致病通路蛋白；(2)增強或抑制某些特定基因的表達(dá)；(3)剪接致病基因片段，恢復(fù)正常蛋白表達(dá)。

合理的心臟基因靶向治療包括合適載體的選擇、目的基因構(gòu)建和器官靶向的載體運輸系統(tǒng)。其中載體通常為病毒，能將目的基因帶入靶細(xì)胞中；目的基因是治療的主要成分。而基因的靶向運載可通過心肌注射和冠狀動脈內(nèi)灌注實現(xiàn)。目前采用心臟特異啟動子構(gòu)建目的基因，可最大限度降低治療副作用，減少非靶器官內(nèi)基因表達(dá)等不良后果。

2.1 病毒載體的選擇

從20世紀(jì)90年代初開始研究將基因轉(zhuǎn)移到心肌細(xì)胞。初始策略是直接心肌注射裸DNA質(zhì)粒，但目的基因僅可在特定區(qū)域表達(dá)1～2個月[8]，無法達(dá)到長期穩(wěn)定的表達(dá)，而心肌特異性病毒載體的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用成功解決了上述難題。目前常用的病毒載體包括：慢病毒、腺病毒、腺相關(guān)病毒(adeno-associated viruses,AAVs)。慢病毒具備強大的心肌細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)能力，誘發(fā)免疫原性反應(yīng)極低，改良的慢病毒可進(jìn)一步避免宿主基因組插入突變的風(fēng)險，目前已嘗試用于治療多種人類疾病的治療[9-12]。腺病毒的基因包裝能力強大，但其在宿主細(xì)胞中表達(dá)時限短，且可誘發(fā)強烈的免疫和炎癥反應(yīng)，在臨床試驗運用較少。而AAVs能在心肌細(xì)胞中長期穩(wěn)定表達(dá)，誘發(fā)免疫原性反應(yīng)弱；對AAVs載體進(jìn)行基因修飾，讓其無法整合到宿主細(xì)胞基因組中，確保其可在宿主細(xì)胞中維持?jǐn)?shù)年，并持續(xù)穩(wěn)定表達(dá)[13]。

2.2 基因治療的分子生物學(xué)技術(shù)

2.2.1 基因置換

基因置換是通過輸入治療基因并促進(jìn)其表達(dá)來彌補或替換缺失和無功能蛋白。肌質(zhì)網(wǎng)蛋白、心肌肌質(zhì)網(wǎng) Ca2+-ATP酶2a(sarcoplasmic reticulum Ca2+-ATPase 2a,Serca2a)及受磷蛋白(PLB)在肌質(zhì)網(wǎng)鈣離子再攝取中起到重要作用，Serca2a/PLB比值降低可影響肌質(zhì)網(wǎng)鈣泵的活性，這些對于維持心肌正常的舒張功能起到重要作用。Jagatheesan等[14]將原肌球蛋白基因突變的HCM小鼠，與編碼嵌合蛋白小鼠雜交發(fā)現(xiàn)，通過修復(fù)收縮蛋白，改變鈣敏感性可以阻止心肌肥厚的病理生理進(jìn)程。隨后，Pea等[15]的研究指出，絕大多數(shù)由細(xì)肌絲蛋白突變所致的HCM都存在肌絲蛋白對鈣離子敏感性增加及舒張功能紊亂的特點，導(dǎo)致壓力敏感所致心肌肥厚的通路激活。通過病毒載體進(jìn)行Serca2a基因轉(zhuǎn)移，可上調(diào)Serca2a基因表達(dá)，改善Serca2a/PLB比值，進(jìn)而改善心肌細(xì)胞的舒張功能，延緩心肌肥厚和心肌纖維化。

心肌肌節(jié)橫橋動力學(xué)異?？蓪?dǎo)致心肌細(xì)胞壓力負(fù)荷增加，同樣可激活心肌肥厚通路。MYBPC3基因突變可導(dǎo)致cMyBP-C表達(dá)，使橫橋動力學(xué)表現(xiàn)異常，產(chǎn)生嚴(yán)重的心肌收縮功能障礙，導(dǎo)致HCM發(fā)生。Merkulov等[16]通過特異性慢病毒載體進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移，增加HCM小鼠MYBPC3基因表達(dá)水平，改善橫橋異常動力學(xué)，改善心肌收縮功能，進(jìn)而延緩或逆轉(zhuǎn)心肌肥厚及心肌纖維化病理進(jìn)程。近日,Prondzynski等[17]將全長MYBPC3 cDNA導(dǎo)入由MYBPC3基因突變所致HCM患者多功能干細(xì)胞誘導(dǎo)分化而來的異常心肌細(xì)胞，提高cMyBP-C表達(dá)水平，也成功抑制心肌肥厚。

2.2.2 基因沉默

基因沉默是通過RNA干擾技術(shù)，降低突變蛋白表達(dá)，以達(dá)到治療效果。可用于顯性負(fù)性效應(yīng)所致功能獲得型或缺失型突變或蛋白高表達(dá)所致的獲得性疾病中。研究人員發(fā)現(xiàn)，一些RNA抑制劑(微小RNA或非編碼RNA)可特異性抑制mRNA翻譯、促進(jìn)mRNA降解。Jiang等[18]將特異性的RNA抑制劑通過病毒載體AAV9(AAV-9-cTnT-EGFP-RNAi)導(dǎo)入剛出生的MYH6基因突變所致的HCM動物模型中，可延緩HCM臨床表型。近年來，Klattenhoff等[19]發(fā)現(xiàn)一種新型長非編碼RNA(Braveheart,Bvht)，這種RNA對于新生中胚層發(fā)育成為心臟至關(guān)重要，并且Bvht也是核心心血管基因網(wǎng)絡(luò)激活，以及一種稱為中胚層后蛋白(mesoderm posterior 1，MesP1)下游功能所必需的元件，MesP1是常見多能心血管祖細(xì)胞的主要調(diào)控因子。隨后，Han等[20]發(fā)現(xiàn)染色質(zhì)重塑蛋白(Brg1)可調(diào)節(jié)心肌發(fā)育、分化及基因表達(dá)，其作用在成年時終止。若Brg1被壓力負(fù)荷激活，可導(dǎo)致心肌肥厚的發(fā)生，激活水平與疾病嚴(yán)重性及肌球蛋白重鏈轉(zhuǎn)變相關(guān)。該研究團(tuán)隊發(fā)現(xiàn)一批長鏈非編碼RNA(lncRNA)，通過拮抗Brg1的作用，阻礙病理性心肌肥厚。正常成年心臟中肌球蛋白重鏈基因(MYH7)可通過心臟特異性反義轉(zhuǎn)錄，剪切產(chǎn)生一批豐富的lncRNA分子，稱作MyHEART or Mhrt(Myosin Heavy Chain Associated RNA Transcripts)；Mhrt可拮抗Brg1對染色質(zhì)的作用。同時，在心臟受到致病刺激時，被激活的Brg1會與某些蛋白組成Brg1-Hdac-Parp復(fù)合體，該復(fù)合體會與Mhrt的啟動子結(jié)合，抑制Mhrt轉(zhuǎn)錄。Mhrt對Brg1的抑制以及Brg1-Hdac-Parp復(fù)合體同Mhrt啟動子的結(jié)合，組成一個完整的心臟保護(hù)性的反饋回路[20]。在Mhrt研究的基礎(chǔ)上，Yang等[21]通過微陣列分析，找出了一系列與HCM相關(guān)的lncRNAs，極大地豐富了HCM相關(guān)的lncRNAs譜，促進(jìn)了基因沉默技術(shù)的發(fā)展。

2.2.3 外顯子跳躍

外顯子缺失是基因編碼區(qū)突變導(dǎo)致疾病發(fā)生的主要原因，如能將外顯子重新恢復(fù)到基因轉(zhuǎn)錄本中，將會給許多疾病的治療帶來曙光。Gedicke-Hornung等[22]通過外顯子跳躍治療技術(shù)，利用特異性病毒載體將介導(dǎo)外顯子跳躍的反義寡核苷酸(antisense oligonucleotide，AON)轉(zhuǎn)導(dǎo)至新生小鼠的心肌細(xì)胞，成功抑制了MYBPC3基因突變所致異常轉(zhuǎn)錄mRNA的表達(dá)，增加了缺失外顯子的表達(dá)，也成功抑制了心肌肥厚的進(jìn)展。

2.2.4 反式剪接

反式剪接通過將兩條不同pre-mRNA的外顯子連接，使mRNA發(fā)生嵌合修復(fù)，進(jìn)而轉(zhuǎn)錄成正常蛋白。反式剪切介導(dǎo)的基因治療已用于多項研究中[23-25]。近期,Prondzynski等[17]證明反式剪接在由MYBPC3基因突變所致HCM患者多功能干細(xì)胞誘導(dǎo)分化而來的肥厚的心肌細(xì)胞中可實現(xiàn)；但由于剪接效能低，治療效果不明顯。在MYBPC3基因突變的HCM模型中，通過PTMs(pre-trans-splicing molecule)可實現(xiàn)整條MYBPC3 mRNA任意位點突變的修復(fù)；故理論上說，可治愈40%～60%的HCM患者[26-27]。此外，與AON介導(dǎo)的外顯子跳躍不同，反式剪接可實現(xiàn)cMyBP-C蛋白全長及功能性修復(fù)，修復(fù)更容易且迅速。

2.3 器官靶向的載體運輸系統(tǒng)

基因轉(zhuǎn)導(dǎo)主要由載體的靶向性決定，但基因遞送技術(shù)也起關(guān)鍵作用。應(yīng)用最廣泛的方法是心肌注射和冠狀動脈內(nèi)灌注，二者各有優(yōu)劣，目前尚未達(dá)成共識。

心肌內(nèi)注射是以導(dǎo)管為基礎(chǔ)的微創(chuàng)手術(shù)方法，可將攜帶目的基因的病毒直接注射到組織中，提高載體的局部濃度。目前使用這種方法難以實現(xiàn)載體區(qū)域均勻擴(kuò)散，給藥后轉(zhuǎn)染的細(xì)胞比例也無法達(dá)到治療效果。而冠狀動脈內(nèi)灌注通過冠狀動脈插管實現(xiàn)，可將攜帶目的基因的載體傳遞至整個心臟。然而，由于冠狀循環(huán)速度快，載體的注射效能可能會降低。目前，該方法已在CUPID試驗中成功應(yīng)用，因此其安全性已在人類中得到驗證[28-31]。

2.4 基因治療的局限性

HCM基因治療研究的不斷深入，將面臨更多的挑戰(zhàn)：在基因轉(zhuǎn)移技術(shù)中，如何嚴(yán)格控制載入目的基因的效應(yīng)，減少毒副作用或外源性蛋白過度表達(dá)；在基因沉默技術(shù)中，如何抑制目標(biāo)蛋白表達(dá)的過度降低；同時未來需要找到更加專一的心臟靶向病毒，減少其他組織對“脫靶”病毒載體的攝?。恍枰庾R到錯誤攝取可能會損害其他組織細(xì)胞功能及病毒載體的植入可導(dǎo)致潛在插入突變事件。另外，多數(shù)研究結(jié)果均未在更高級的哺乳動物中進(jìn)一步證實，每次需注射的病毒劑量、劑量-效應(yīng)關(guān)系、再次注射的時間間隔需要進(jìn)一步探索。多數(shù)研究顯示，只有對出生1 d的動物進(jìn)行基因治療，才能有效地抑制或延緩HCM進(jìn)程，目前仍缺乏臨床前期HCM的線索，早期診斷、干預(yù)困難重重；一些抑制效應(yīng)亦會隨時間推移逐漸消失，且不能逆轉(zhuǎn)已肥厚的心肌。

3 基因治療的臨床初期實踐

Serca2可控制肌質(zhì)網(wǎng)與細(xì)胞質(zhì)間鈣離子流動，對調(diào)節(jié)心肌舒張有重要作用；重癥心力衰竭肌質(zhì)網(wǎng)活性調(diào)節(jié)蛋白的缺乏，是心臟進(jìn)行性收縮和舒張功能衰竭的重要機制。CUPID研究是第一個將基因轉(zhuǎn)移技術(shù)用于人類治療的臨床研究。研究中，人們利用經(jīng)皮冠狀動脈治療裝置將攜帶有肌質(zhì)網(wǎng)活性調(diào)節(jié)蛋白基因(Serca2 cDNA)的腺病毒1(AAV1)植入重癥心力衰竭患者心臟中。

在開放標(biāo)簽的CUPIDⅠ期研究中，9例心力衰竭患者接受AAV1-Serca2治療；9例患者共分3組，每組3人，分別給予低、中、高劑量病毒。其中1例中等劑量患者死亡，死亡原因與病毒無關(guān)，余下8例患者無不良反應(yīng)。6例患者心力衰竭癥狀、左室功能、N 末端腦鈉肽有所改善；余下2例患者體內(nèi)存在病毒抗體，對治療無反應(yīng)[28]。CUPIDⅡ期雙盲安慰劑對照研究共納入39例心力衰竭患者。相比安慰劑組，高劑量組在12個月時，心血管事件發(fā)生率(HR=0.12，P=0.003)及住院時間(0.4 d vs 4.5 d，P=0.05)顯著下降[29]。3年后，這項研究顯示出了安全性和有效性：試驗組存活患者(7/25)的比例多于安慰劑組(6/14)，尤其在高劑量組(1/9)；與安慰劑組相比，高劑量組心血管事件下降了82%(P=0.048)；對3例高劑量組患者進(jìn)行心肌細(xì)胞活檢，證實了治療基因的存在[30]；但是在納入更多受試者的CUPIDⅡb期多中心隨機雙盲對照研究中，應(yīng)用相同治療方法，進(jìn)行為期1年的隨訪發(fā)現(xiàn)，未能改善心力衰竭患者臨床進(jìn)程及射血分?jǐn)?shù)，最終宣告失敗[31]。然而，該研究為未來治療心臟疾病提供了一個新思路；同時也證實，在人體中，利用特異性病毒載體進(jìn)行基因治療是安全可行的。

綜上，發(fā)現(xiàn)與該治療相關(guān)的靶基因Serca2a亦是心肌肥厚下游通路相關(guān)基因之一，是否能通過此方式設(shè)計新基因藥物改善HCM患者心肌肥厚進(jìn)程值得研究；有效的病毒治療劑量仍需繼續(xù)探索；對于有家族史的患者，早期干預(yù)是否能更大程度地改善患者預(yù)后，這一科學(xué)問題也值得進(jìn)一步探究。

4 總結(jié)與啟示

前述基因治療最新研究成果指明單基因突變所致的HCM基因精準(zhǔn)化治療的廣闊前景和新的希望。同時發(fā)現(xiàn)，目前對HCM基因治療都是以動物模型為基礎(chǔ)，缺乏大型哺乳動物相關(guān)研究；基因治療總原理是“對因治療”，即“缺什么，補什么；表達(dá)過度，施行抑制”的原則。事實上，臨床上大多數(shù)患者基因突變情況并不明確，且進(jìn)行大規(guī)模的突變基因篩查十分不現(xiàn)實。所以，可從更加實際的角度出發(fā)，避開尋找海量突變基因，將上述研究的理論依據(jù)運用于臨床。通過上述的研究成果，可對流出道梗阻型先天性心臟病患兒(如法洛四聯(lián)癥、HCM等)進(jìn)行相關(guān)主要“高表達(dá)或低表達(dá)”基因或蛋白篩查，依據(jù)“缺什么，補什么；表達(dá)過度，施行抑制”的治療原則，對相關(guān)主要基因進(jìn)行靶向調(diào)節(jié)，延緩心肌肥厚程度，改善梗阻癥狀，使患者存活較長時間后，再行手術(shù)治療，以降低手術(shù)難度和風(fēng)險，改善患兒預(yù)后，并達(dá)到預(yù)防術(shù)后復(fù)發(fā)的目的。

HCM基因治療的研究成果，為今后HCM的基因靶向精準(zhǔn)治療提供了大量的科學(xué)依據(jù)，同時也為臨床治療肥厚梗阻型先天性心臟病提供了新的治療理念與思路。同時，最新HCM調(diào)控蛋白Brg1與心肌保護(hù)序列Mhrt基因的發(fā)現(xiàn)，也為今后探索HCM早期識別的生化標(biāo)志物、治療新靶點及設(shè)計相應(yīng)靶點藥物指明方向。

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