人毛囊間充質(zhì)干細(xì)胞臨床應(yīng)用的研究進(jìn)展

周 丹,趙 輝,趙 洋,劉晉宇

(1.吉林大學(xué)第二醫(yī)院兒科，吉林 長(zhǎng)春 130041；2.吉林大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院衛(wèi)生毒理學(xué)教研室，吉林 長(zhǎng)春 130021)

毛囊是皮膚附屬器之一，起源于胚胎發(fā)育時(shí)期表皮與間充質(zhì)間相互作用。人毛囊不斷經(jīng)歷生長(zhǎng)期、退行期和靜止期，周而復(fù)始，形成毛囊周期。毛囊周期伴隨人類(lèi)一生，同時(shí)毛囊還表達(dá)胚胎干細(xì)胞標(biāo)志物sry相關(guān)HMG盒轉(zhuǎn)錄因子2(sry-related HMG box-containing transfactor2，SOX2)，因此毛囊被認(rèn)為是成體內(nèi)胚胎組織之外唯一存在的胚胎樣組織。毛囊中含有多種干細(xì)胞，包括角朊干細(xì)胞、黑色素干細(xì)胞、神經(jīng)脊干細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞。這些干細(xì)胞在時(shí)空上相互作用，共同維持毛囊的自我更新和毛囊周期正常運(yùn)行。其中毛囊來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞(hair follicle-derived mesenchymal stem cells, HF-MSCs)是成體干細(xì)胞家族成員之一，不僅表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)志物如CD44、CD73、CD90和CD105，還具有分化為脂肪、骨、軟骨、平滑肌和神經(jīng)等多種組織特異性細(xì)胞的潛能[1]。來(lái)源于人的HF-MSCs被稱(chēng)為人毛囊間充質(zhì)干細(xì)胞(human hair follicle-derived mesenchymal stem cells, hHF-MSCs)。人毛囊來(lái)源豐富、獲取方便、獲取微創(chuàng)且?guī)缀醪皇苣挲g的限制，因此作為自體干細(xì)胞來(lái)源具有其他成體組織來(lái)源的干細(xì)胞難以比擬的優(yōu)勢(shì)。毛囊干細(xì)胞已經(jīng)在臨床上用于脫發(fā)的治療[2]，近年來(lái)國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)hHF-MSCs的生物學(xué)和再生醫(yī)學(xué)方面在體內(nèi)及體外均進(jìn)行了一些研究，并取得了一定的進(jìn)展，但國(guó)外關(guān)于hHF-MSCs的綜述[3]較少，國(guó)內(nèi)尚未見(jiàn)相關(guān)綜述。本文對(duì)hHF-MSCs的臨床應(yīng)用前景做簡(jiǎn)要概述。

1 hHF-MSCs作為自體細(xì)胞用于制備誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(induced pluripotent stem cells, IPS)

干細(xì)胞的研究者們最早將研究焦點(diǎn)集中于胚胎干細(xì)胞。胚胎干細(xì)胞是指早期胚胎(原腸胚期之前)或原始性腺中分離出來(lái)的一類(lèi)細(xì)胞，其具有體外培養(yǎng)無(wú)限增殖、自我更新和發(fā)育成完整個(gè)體的潛能，屬于全能干細(xì)胞。但利用胚胎干細(xì)胞開(kāi)展再生醫(yī)學(xué)研究存在如下問(wèn)題：倫理限制、來(lái)源有限和致瘤性。為解決胚胎干細(xì)胞研究和應(yīng)用過(guò)程中存在的上述問(wèn)題，日本科學(xué)家[4-5]通過(guò)核移植技術(shù)在小鼠體內(nèi)導(dǎo)入4種轉(zhuǎn)錄因子Oct3/4、Sox2、c-Myc和Klf4，成功地將小鼠的體細(xì)胞重新編碼成為胚胎樣干細(xì)胞，即IPS。IPS的誕生不但可以解決胚胎干細(xì)胞的倫理和來(lái)源有限問(wèn)題，同時(shí)也可解決成體干細(xì)胞分化能力有限和異體來(lái)源存在免疫排斥反應(yīng)的問(wèn)題，為藥物篩選、毒理學(xué)和再生醫(yī)學(xué)研究提供了亞全能的自體干細(xì)胞來(lái)源，成為干細(xì)胞研究史上重要的里程碑。關(guān)于IPS的研究于2007—2008年被《Science》、《Cell》和《Nature》等權(quán)威雜志評(píng)選為年度重大科學(xué)進(jìn)展和最受人們關(guān)注的領(lǐng)域之一[6-7]。Muchkaeva等[8]及Wang等[9]分別通過(guò)導(dǎo)入Yamanaka應(yīng)用過(guò)的Oct3/4、Sox2、c-Myc和Klf4等4種轉(zhuǎn)錄因子，成功地將人毛囊真皮乳頭細(xì)胞和hHF-MSCs重新編程為IPS細(xì)胞。由hHF-MSCs重編程的hHF-IPS具有正常的二倍體核型，表達(dá)階段特異性胚胎表面抗原3(stage-specific embryonic antigens，SSEA-3)、SSEA-4、腫瘤排斥抗原1-60(tumor rejection antigen，Tra-1-60)和Tra-1-81等胚胎干細(xì)胞特異性標(biāo)志物及多潛能轉(zhuǎn)錄因子Nanog和Oct4等。hHF-IPS植入非肥胖糖尿病/重癥聯(lián)合免疫缺陷(non-obese diabetic-severe combined immune deficency，NOD-SCID)小鼠體內(nèi)，可產(chǎn)生外胚層、中胚層和內(nèi)胚層組織細(xì)胞成分的畸胎瘤。在此基礎(chǔ)上，Shi等[10]于2016年通過(guò)添加不同細(xì)胞因子對(duì)hHF-MSCs進(jìn)行4個(gè)階段培養(yǎng)誘導(dǎo)，具體如下：第1階段加入激活素A(activin A)，誘導(dǎo)hHF-IPS向內(nèi)胚層分化；第2階段加入成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子4(FGF-4)和骨形態(tài)發(fā)生蛋白4(BMP-4)促其向肝細(xì)胞特化；第3階段加入肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)促肝祖細(xì)胞增殖；第4階段加入腫瘤抑制素M(OSM)和地塞米松促肝細(xì)胞成熟。通過(guò)上述實(shí)驗(yàn)流程，最終在體外成功地將hHF-IPSC 分化為具有成熟肝細(xì)胞功能的肝樣細(xì)胞，有望為肝病的治療提供重要的自體肝細(xì)胞來(lái)源，具有重要的臨床應(yīng)用前景。

2 hHF-MSC的組織工程學(xué)應(yīng)用前景

Lako 等[11]首先通過(guò)向經(jīng)過(guò)致命性照射劑量的小鼠體內(nèi)移植鼠毛囊毛乳頭/鞘細(xì)胞重新建立了小鼠的造血系統(tǒng)，陸續(xù)有學(xué)者進(jìn)一步證實(shí)了嚙齒動(dòng)物毛囊毛乳頭/鞘細(xì)胞具有MSCs類(lèi)似的多向分化潛能[12]。Vivek 等[13]發(fā)現(xiàn)：HF-MSCs表達(dá) CD90、CD105、CD44 和CD73等間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志，但不表達(dá)造血細(xì)胞(CD34和CD45)和內(nèi)皮細(xì)胞(CD144)標(biāo)志。通過(guò)基因表達(dá)、功能分析和克隆實(shí)驗(yàn)[14-15]顯示：hHF-MSCs 可在體外分化成脂肪、骨和軟骨細(xì)胞，這與骨髓來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMMSC)的分化潛能相一致。BMMSC是目前研究最為廣泛、最受學(xué)者關(guān)注、取得研究成果最多，也是最有希望應(yīng)用于臨床的成體干細(xì)胞，由于hHF-MSCs與BMMSC的相似性[16]，因此hHF-MSCs的研究越來(lái)越受到人們的關(guān)注，尤其是hHF-MSCs在組織工程學(xué)上的應(yīng)用前景[17]。

與BMMSC類(lèi)似，HF-MSCs表達(dá)CD90、CD105、CD44和CD73等間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志，同時(shí)具有成脂、成骨和成軟骨細(xì)胞分化能力。除此之外，HF-MSC 還具有分化為平滑肌細(xì)胞、神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和黑色素細(xì)胞的潛能[18-19]。Yu等[20]將HF-MSCs 置于不含血清和堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)液中培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)HF-MSCs可形成保持?jǐn)?shù)代不分化的神經(jīng)球，并可維持其不斷向肌肉、神經(jīng)及黑色素細(xì)胞分化的能力。Peng等[21]利用血管平滑肌細(xì)胞肌球蛋白啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)綠色熒光蛋白的慢病毒質(zhì)粒，從hHF-MSCs中分離出血管平滑肌細(xì)胞，并以該細(xì)胞為種子細(xì)胞，構(gòu)建出世界上第一個(gè)人毛囊干細(xì)胞來(lái)源的組織工程小口徑血管。該組織工程血管對(duì)氯化鉀和去甲腎上腺素等激活劑的刺激產(chǎn)生收縮反應(yīng)[22-23]。進(jìn)一步研究[24]顯示：微小RNA(miR-18b)通過(guò)SMAD2信號(hào)通路，負(fù)調(diào)控TGF-β1誘導(dǎo)的hHF-MSCs向血管平滑肌細(xì)胞分化。該研究對(duì)hHF-MSCs分化過(guò)程中的信號(hào)通路和調(diào)節(jié)機(jī)制方面進(jìn)行了深入的探索，為其應(yīng)用于臨床打下基礎(chǔ)。

3 hHF-MSCs作為基因治療的載體細(xì)胞

BMMSC被證實(shí)具有易于外源性基因?qū)耄D(zhuǎn)染率高，穩(wěn)定、高效表達(dá)外源基因的特點(diǎn)，成為外來(lái)基因?qū)塍w內(nèi)良好的載體細(xì)胞。不僅如此，轉(zhuǎn)基因的MSCs 在體內(nèi)可以定向遷移到受損的病變部位，在激活內(nèi)源性祖細(xì)胞的同時(shí)，釋放一些生物因子，改善病變組織周?chē)奈h(huán)境，修復(fù)受損組織[25-29]。轉(zhuǎn)基因MSCs具有雙重作用：一方面表達(dá)目的基因，治療相關(guān)疾病；另一方面還可以通過(guò)旁分泌作用，修復(fù)重建病變受損的組織。Wu等[30]首次將hHF-MSCs作為糖尿病基因治療的靶細(xì)胞，通過(guò)慢病毒載體將釋放可控的人胰島素基因?qū)雋HF-MSCs中，制備出轉(zhuǎn)基因工程細(xì)胞。這種轉(zhuǎn)基因工程細(xì)胞仍表達(dá)CD44、CD73、CD90和CD105等MSCs 的特異性標(biāo)記物，同時(shí)具有向脂肪細(xì)胞、骨細(xì)胞分化的能力；移植到糖尿病模型鼠內(nèi)，在雷帕霉素的作用下釋放胰島素，逆轉(zhuǎn)糖尿病高血糖，開(kāi)辟了在臨床上轉(zhuǎn)基因治療糖尿病的新途徑，證明了HF-MSCs作為基因治療靶細(xì)胞治療相關(guān)疾病的可行性。本課題組通過(guò)應(yīng)用攜帶人肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(human hepatocyte growth factor，hHGF)基因的慢病毒轉(zhuǎn)染hHF-MSCs，構(gòu)建了具有過(guò)表達(dá)hHGF的轉(zhuǎn)基因hHF-MSCs(HGF-MSCs)。構(gòu)建的HGF-MSCs仍保留MSCs的生物學(xué)特征：表達(dá)MSC表面標(biāo)志，同時(shí)具有向骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞的分化潛能[31]，有望可以應(yīng)用于急慢性肝損害的修復(fù)治療。上述實(shí)驗(yàn)表明：hHF-MSCs可以通過(guò)病毒導(dǎo)入其他基因，并不影響其生物學(xué)特性。由此可見(jiàn)以自體的hHF-MSC作為基因治療載體細(xì)胞，具有巨大的臨床應(yīng)用潛能。

4 結(jié) 語(yǔ)

hHF-MSCs具有如下優(yōu)點(diǎn)：①來(lái)源優(yōu)勢(shì)。毛囊基本伴隨人的一生，來(lái)源豐富；②獲取優(yōu)勢(shì)。不管是BMMSC還是臍帶、脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞均存在獲取不便的問(wèn)題，如獲取骨髓、脂肪均是有創(chuàng)性操作，取材部位本身即有發(fā)生感染的危險(xiǎn)，而且取出標(biāo)本極易被外部環(huán)境污染，因此對(duì)取材后標(biāo)本的保存有極其嚴(yán)格的要求。而hHF-MSCs的獲取方式已經(jīng)由研究初期的取頭皮、毛囊發(fā)展成為直接拔取頭發(fā)，因此對(duì)機(jī)體造成的損傷微乎其微；③細(xì)胞分離方法優(yōu)勢(shì)。HF-MSCs的實(shí)驗(yàn)分離方法已經(jīng)成熟，方法簡(jiǎn)便，易于操作；④體外擴(kuò)增優(yōu)勢(shì)。利用生物反應(yīng)器技術(shù)，短期內(nèi)可將hHF-MSCs擴(kuò)增到數(shù)十億以上，且擴(kuò)增的細(xì)胞仍保留MSC原代生物學(xué)特征，因此完全滿(mǎn)足臨床應(yīng)用所需的干細(xì)胞數(shù)量和質(zhì)量[32]；⑤免疫原性低。hHF-MSCs取材于自體毛發(fā)而避免免疫排斥反應(yīng)；⑥倫理學(xué)優(yōu)勢(shì)。hHF-MSCs非異體取材，從而避免異體移植所導(dǎo)致的倫理學(xué)問(wèn)題。hHF-MSC的發(fā)現(xiàn)時(shí)間晚于其他干細(xì)胞，目前的實(shí)驗(yàn)研究很大部分是基于其他干細(xì)胞，如最為常用的BMMSC研究基礎(chǔ)之上進(jìn)行的，因此其存在如下缺點(diǎn)：①其作為體細(xì)胞向其他組織、細(xì)胞分化的誘導(dǎo)條件及信號(hào)通路尚在摸索中[33-35]，因此研究范圍有限；②作為轉(zhuǎn)基因治療手段在活體內(nèi)的安全性及穩(wěn)定性尚待進(jìn)一步證實(shí)；③目前國(guó)內(nèi)、外掌握HF-MSCs制備技術(shù)的實(shí)驗(yàn)室較少，因此獲得的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)相對(duì)較少，尚缺乏HF-MSCs的相關(guān)大數(shù)據(jù)。總之，HF-MSCs作為干細(xì)胞家族的一員，目前已經(jīng)取得的研究成果有力地證明了其將是器官移植、組織工程學(xué)和轉(zhuǎn)基因治療的種子細(xì)胞，具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。