腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)方法研究進(jìn)展

張穎聰，張 澤，于洪偉，桑卓琦，常 東

（1. 上海市浦東醫(yī)院 復(fù)旦大學(xué)附屬浦東醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海 201399；2. 上海市浦東新區(qū)浦南醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海 201399）

腫瘤具有高死亡率、高轉(zhuǎn)移率和高復(fù)發(fā)率，是危害人類健康的重大疾病。診斷腫瘤的傳統(tǒng)方法有病理組織活檢、核磁共振成像（magnetic resonance imaging ，MRI）、電子計(jì)算機(jī)斷層掃描（computed tomography ，CT）、B超、X線胸片、內(nèi)鏡檢查等。這些檢查對(duì)于腫瘤早期的檢測(cè)效果十分有限，部分檢測(cè)方法不僅價(jià)格昂貴，且會(huì)給患者帶來痛苦。因此，在腫瘤早期階段開展快速、有效的檢測(cè)十分必要，不僅可以達(dá)到早發(fā)現(xiàn)、早治療的目的，還可以改善患者就醫(yī)體驗(yàn)。腫瘤標(biāo)志物的篩檢對(duì)于腫瘤早期檢測(cè)具有重要意義[1]。

腫瘤標(biāo)志物是指由腫瘤組織或宿主與腫瘤相互作用所產(chǎn)生的一類活性物質(zhì)，能夠提示腫瘤存在與生長(zhǎng)變化。腫瘤標(biāo)志物常常存在于血清、細(xì)胞、尿液、體液或組織中，常見的有癌胚蛋白、腫瘤抗原、酶類標(biāo)志物、激素、糖類抗原等。腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)具有操作便捷、標(biāo)本易獲取、非侵入性、價(jià)格低廉、易于動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)疾病等優(yōu)點(diǎn)。腫瘤標(biāo)志物的檢測(cè)對(duì)于腫瘤的預(yù)防、早期診斷與鑒別診斷、輔助腫瘤分類、疾病監(jiān)測(cè)、指導(dǎo)治療和預(yù)后判斷有重要作用，可有效彌補(bǔ)其他醫(yī)學(xué)技術(shù)對(duì)腫瘤診斷、治療及預(yù)后判斷的不足[2]。腫瘤標(biāo)志物種類繁多，檢測(cè)方法也各異，本文將幾種常見腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)方法的研究進(jìn)展作一綜述。

1 放射免疫分析

放射免疫分析是一種傳統(tǒng)的檢測(cè)腫瘤標(biāo)志物的方法，是將放射性核素檢測(cè)技術(shù)與抗原抗體結(jié)合特異性的特點(diǎn)相結(jié)合，以定量微量物質(zhì)。放射免疫分析多使用放射性核素125I，因其具有放射性高、易標(biāo)記、衰變過程中釋放的射線易于被檢測(cè)等優(yōu)勢(shì)，逐漸替代了3H和14C而被廣泛使用。放射性核素標(biāo)記具有高靈敏度、易于商品化等優(yōu)勢(shì)，曾被廣泛應(yīng)用，但與其他方法[3]相比，存在試劑盒使用壽命短、有放射性污染風(fēng)險(xiǎn)等缺點(diǎn)，目前已逐漸被其他檢測(cè)方法取代。

2 化學(xué)發(fā)光免疫分析

化學(xué)發(fā)光免疫分析是目前常用和較為成熟的腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)技術(shù)，其利用化學(xué)發(fā)光物質(zhì)作為標(biāo)記物，根據(jù)發(fā)光信號(hào)的強(qiáng)度來判斷待測(cè)物質(zhì)的量。自1928年德國(guó)化學(xué)家Albrecht發(fā)現(xiàn)魯米諾的化學(xué)發(fā)光特性后，該檢測(cè)技術(shù)由于靈敏度高、快速、線性范圍廣、儀器結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、適合小型化、無放射性危害等優(yōu)點(diǎn)得到不斷發(fā)展[4-5]。化學(xué)發(fā)光免疫分析為化學(xué)發(fā)光法，使用直接發(fā)光物質(zhì)（如吖啶酯 ）標(biāo)記抗體，或使用酶類催化劑（如辣根過氧化物酶）[6]標(biāo)記抗原抗體。將化學(xué)發(fā)光技術(shù)與微芯片電泳化學(xué)發(fā)光（microchip-electrophoresis chemiluminescence，MCE-CL）等技術(shù)聯(lián)合使用，具有效率高、分析快、自動(dòng)化程度高、需要更少樣品和試劑的優(yōu)點(diǎn)[7-8]。

傳統(tǒng)化學(xué)免疫分析采用酶標(biāo)技術(shù)，用辣根過氧化物酶催化魯米諾的免疫測(cè)定技術(shù)曾被廣泛使用，目前的免疫測(cè)定系統(tǒng)通常使用信號(hào)探針標(biāo)記抗體并進(jìn)一步測(cè)量目標(biāo)分析物濃度。但這類天然酶具有穩(wěn)定性差、來源有限、對(duì)環(huán)境變化敏感、易受環(huán)境影響而變性等缺點(diǎn)，且標(biāo)記過程通常會(huì)損害抗體分子的生物活性，因而基于金屬及金屬?gòu)?fù)合物[9-10]、磁性納米顆粒[11]、量子點(diǎn)[12]等催化發(fā)光底物的無酶免疫系統(tǒng)[13]不斷發(fā)展，將電化學(xué)技術(shù)和化學(xué)發(fā)光相結(jié)合檢測(cè)腫瘤標(biāo)志物，兼具了化學(xué)發(fā)光的高靈敏度和電化學(xué)的時(shí)間、空間可控性[14-15]的優(yōu)點(diǎn)。有研究人員以CuS納米粒子作為過氧化物酶模擬物，設(shè)計(jì)了一種新型的無標(biāo)記化學(xué)發(fā)光（chemiluminescence，CL）免疫方法測(cè)定甲胎蛋白，與基于酶標(biāo)的CL免疫測(cè)定法相比，提出的無標(biāo)記測(cè)定模式更簡(jiǎn)單、價(jià)廉、快速。采用無標(biāo)記的CL免疫測(cè)定法測(cè)定甲胎蛋白的線性范圍為0.1～60 ng / mL，檢出限為0.07 ng / mL，且此CL免疫測(cè)定系統(tǒng)顯示出良好的特異性、可接受的重復(fù)性和良好的準(zhǔn)確性[16]。

3 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)

酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)是一項(xiàng)臨床上已普及的檢測(cè)技術(shù)，這一技術(shù)將抗原或抗體包被于固相支持物上，將酶標(biāo)抗原或抗體加入抗原抗體復(fù)合物中，通過底物使酶顯色來達(dá)到檢測(cè)目的。不同的研究人員會(huì)采用不同的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)策略，如使用單克隆多克隆抗體[17]及嵌合抗體[18]來開發(fā)腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)試劑盒。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)被開發(fā)后其檢測(cè)系統(tǒng)得到不同的優(yōu)化，如凝集素及生物素-親和素系統(tǒng)[19]在酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)中的應(yīng)用大大增強(qiáng)了其檢測(cè)的敏感性，熒光素酶夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)系統(tǒng)[20]也使檢測(cè)的敏感性不斷增強(qiáng)。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)不僅適用于對(duì)單一分析物的測(cè)定，在多個(gè)分析物同時(shí)存在時(shí)，同樣具有良好的適用性[21]。

除酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)外，越來越多的研究集中于開發(fā)具有酶樣活性的模擬酶[22]。ZHANG等[23]以Cu2+作為助催化劑，利用Cu2+/Ag-AgI復(fù)合物作為催化劑具有在可見光下使3,3′,5,5′-四甲基聯(lián)苯胺（3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine，TMB）顏色產(chǎn)生變化的特性，構(gòu)建了夾心型比色法，通過監(jiān)測(cè)TMB溶液的顏色變化以定量癌胚抗原的水平，其開發(fā)的比色免疫測(cè)定在血清樣品分析中表現(xiàn)出良好的選擇性、重復(fù)性和穩(wěn)定性。

4 免疫傳感器

免疫傳感器一直備受腫瘤研究者關(guān)注和青睞。將特異性免疫反應(yīng)與生物傳感技術(shù)相結(jié)合形成的生物傳感器，其生物識(shí)別部分來自抗原與抗體的特異性識(shí)別和結(jié)合作用，通過理化換能器和信號(hào)放大裝置將生物信號(hào)轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘?hào)用于檢測(cè)。與其他幾種檢測(cè)方法相比，免疫傳感器具有靈敏度高、操作方便、設(shè)備簡(jiǎn)單、成本低、可實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)檢測(cè)等優(yōu)勢(shì)。目前，免疫傳感器大部分處于試驗(yàn)階段，正向高通量、商品化發(fā)展，以滿足臨床大樣本檢測(cè)的要求，隨著技術(shù)的不斷成熟，有望成為腫瘤標(biāo)志物的新型檢測(cè)手段。

金屬納米材料由于擁有獨(dú)特的光學(xué)、電子和催化特性常被用于構(gòu)建免疫傳感器[24-25]。LIU等[26]使用多孔鉑納米顆粒和PdPt納米籠同時(shí)測(cè)定腫瘤標(biāo)志物癌胚抗原和甲胎蛋白，利用多孔鉑納米顆粒較大的表面積和較強(qiáng)的導(dǎo)電性，PdPt納米籠優(yōu)異的催化性能及高負(fù)載能力，增強(qiáng)和放大響應(yīng)信號(hào)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)雙重分析物的靈敏測(cè)定。另外，使用納米合金材料制作的傳感器，與使用單一金屬材料相比具有更好的生物相容性，金屬之間良好的協(xié)同作用使傳感器催化性能進(jìn)一步被放大。ZHANG等[27]使用PdPt納米顆粒，以石墨烯片和多壁碳納米管作為傳感平臺(tái)，組成納米復(fù)合物修飾電極，來測(cè)定腫瘤標(biāo)志物潛伏膜蛋白-1，比單獨(dú)使用Pd納米粒子具有更高的過氧化物酶活性，PdPt凹面不僅可以提供較大的表面積，還可以提供更豐富的催化反應(yīng)活性位點(diǎn)。

碳納米材料，包括單壁碳納米管、多壁碳納米管、石墨烯、碳納米纖維、碳球等，由于其良好的力學(xué)性能、較高的化學(xué)穩(wěn)定性、特殊的電學(xué)性質(zhì)、優(yōu)異的機(jī)械性能和良好的導(dǎo)熱性被廣泛用于免疫傳感器的制造，制造的傳感器具有響應(yīng)速度快、電子傳遞速率高、負(fù)載量大、吸附性好、催化活性等優(yōu)點(diǎn)。LIANG等[28]研制了以雙層酶修飾碳納米管作為標(biāo)記的夾心型免疫傳感器，利用層層自組裝技術(shù)將辣根過氧化物酶裝配到多壁碳納米管上，實(shí)現(xiàn)了信號(hào)放大，為臨床分析的超靈敏檢測(cè)提供了有力的支持。

聚合物復(fù)合材料由于良好的氧化還原性能，被作為免疫傳感器信號(hào)指示劑[29-30]。TANG等[31]用聚多巴胺-PB2+（PDA-Pb2 +）納米復(fù)合材料作為氧化還原體系，用殼聚糖 - 金納米復(fù)合材料涂覆電極，對(duì)癌胚抗原進(jìn)行敏感性的電流分析。利用聚合物復(fù)合材料制作的免疫傳感器，因聚合物復(fù)合材料摻雜帶來的半導(dǎo)體或?qū)w性質(zhì)，其活性可被調(diào)節(jié)，摻雜/去摻雜的可逆過程使其可檢測(cè)不同的分析對(duì)象，擴(kuò)大了檢測(cè)范圍。

免疫傳感器的制備除上述幾種材料外，還常引入其他具有不同功能的材料來提高性能。如利用量子點(diǎn)高表面活性、小尺寸及對(duì)光、電、溫度等敏感的特性，構(gòu)建的傳感器靈敏度較高[32-33]；利用磁性納米粒子的磁效應(yīng)構(gòu)建的傳感器抗干擾性好[34]；利用介孔材料良好的孔隙結(jié)構(gòu)和界面結(jié)構(gòu)構(gòu)建的傳感器，能夠保持酶良好的活性和功能性；利用水凝膠構(gòu)建的傳感器穩(wěn)定性好，水溶性高，能夠?qū)ν饨绱碳ぎa(chǎn)生響應(yīng)并產(chǎn)生相應(yīng)變化[35]。此外，利用羥基磷灰石（hydroxyapatite，HAP）納米顆粒，利用HAPNPs與鉬酸鹽的反應(yīng)檢測(cè)甲胎蛋白，構(gòu)建的傳感器選擇性好、靈敏度高，且成本低[36]。

5 蛋白組學(xué)

蛋白組學(xué)是近年來興起的腫瘤研究領(lǐng)域熱點(diǎn)之一，以蛋白質(zhì)為核心，對(duì)蛋白質(zhì)的表達(dá)模式和功能模式進(jìn)行研究。蛋白組學(xué)技術(shù)具有高通量、微型化、自動(dòng)化的優(yōu)勢(shì)，目前被廣泛用于臨床腫瘤學(xué)研究，為腫瘤標(biāo)志物的研究提供了良好的平臺(tái)，但同時(shí)具有檢測(cè)成本昂貴、對(duì)技術(shù)人員操作要求高等缺點(diǎn)。

5.1 雙向電泳

雙向電泳是蛋白組學(xué)的經(jīng)典技術(shù)，是利用蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)和不同相對(duì)分子質(zhì)量來分離蛋白質(zhì)的一門技術(shù)。雙向電泳是蛋白組學(xué)的核心技術(shù)之一，能夠通過染色強(qiáng)度得到蛋白質(zhì)翻譯后修飾的信息，能夠同時(shí)分離數(shù)千種蛋白質(zhì)。但其有不能分辨低拷貝數(shù)蛋白、檢測(cè)蛋白比估計(jì)總蛋白數(shù)少、耗時(shí)長(zhǎng)、操作過程繁瑣等缺點(diǎn)，不能實(shí)現(xiàn)完全自動(dòng)化，研究者常將其與質(zhì)譜技術(shù)聯(lián)用以分離、鑒定蛋白質(zhì)[37]，即將蛋白質(zhì)用雙向電泳分離后，運(yùn)用質(zhì)譜技術(shù)進(jìn)行逐一鑒定，這也成為蛋白組學(xué)研究的核心技術(shù)。相差凝膠電泳在雙向電泳的基礎(chǔ)上利用不同的染色對(duì)2個(gè)樣本進(jìn)行標(biāo)記，通量更高，提高了凝膠間的可比性，工作效率得到提升。

5.2 質(zhì)譜技術(shù)

質(zhì)譜技術(shù)是將物質(zhì)離子化，根據(jù)不同質(zhì)荷比進(jìn)行時(shí)間和空間的分離，進(jìn)而獲得樣品的相對(duì)分子質(zhì)量、分子結(jié)構(gòu)等多種信息的分析方法。由于其具有高分辨力、高精度等特點(diǎn)被廣泛用于多個(gè)領(lǐng)域。近年來，常用色譜-質(zhì)譜技術(shù)，因其兼具了色譜的分離能力和質(zhì)譜的鑒定能力，能夠?qū)Φ鞍踪|(zhì)進(jìn)行準(zhǔn)確、快速的分析和定量[39-40]。基質(zhì)輔助激光解吸飛行時(shí)間質(zhì)譜和電噴霧電離質(zhì)譜是經(jīng)過改進(jìn)的質(zhì)譜技術(shù)，前者利用基質(zhì)吸收激光的能量，得到肽質(zhì)量指紋譜，通過檢索數(shù)據(jù)庫(kù)以鑒定蛋白質(zhì)；后者利用電噴霧法，液相化多肽以鑒定蛋白質(zhì)。這2種方法能保證電離時(shí)樣品分子的完整性，不會(huì)使離子碎片化。

5.3 蛋白質(zhì)芯片

蛋白質(zhì)芯片是近十年來新興的分析技術(shù)，即在支持物表面排列蛋白質(zhì)探針以捕獲目標(biāo)蛋白，再通過檢測(cè)器進(jìn)行定性或定量分析。根據(jù)載體性質(zhì)不同，可分為固相蛋白質(zhì)芯片和液相蛋白質(zhì)芯片，臨床上常用來篩選和尋找腫瘤標(biāo)志物。反相蛋白質(zhì)芯片也是蛋白組學(xué)高通量方法[41]。蛋白質(zhì)芯片不僅可用來研究蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的相互作用，還可研究蛋白質(zhì)與核苷酸間的相互作用，具有通量高、速度快、靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)。DUAN等[42]設(shè)計(jì)了一種蛋白質(zhì)芯片，使用膠體納米金標(biāo)記葡萄球菌屬蛋白A作為指標(biāo)，應(yīng)用免疫金銀染色增強(qiáng)技術(shù)擴(kuò)增檢測(cè)信號(hào)，此蛋白質(zhì)芯片可在不存在交叉反應(yīng)的情況下檢測(cè)乙型肝炎病毒抗體和丙型肝炎病毒抗體，并可在40 min內(nèi)提供結(jié)果，速度相對(duì)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)等方法更快。YANG等[43]開發(fā)了一種微陣列芯片，首次使用硅和水凝膠作為微陣列的載體，構(gòu)成的芯片具有二氧化硅和水凝膠兩者的優(yōu)點(diǎn)。

5.4 表面增強(qiáng)激光解析及電離飛行時(shí)間質(zhì)譜

表面增強(qiáng)激光解析及電離飛行時(shí)間質(zhì)譜是將質(zhì)譜與蛋白質(zhì)分離技術(shù)相結(jié)合的技術(shù)，能夠檢測(cè)到其他傳統(tǒng)方法檢測(cè)不到的蛋白質(zhì)，只需少量樣品，檢測(cè)時(shí)間短且重復(fù)性高，可分析復(fù)雜樣品。該技術(shù)基于特殊芯片的表明增強(qiáng)吸附作用，將樣品蛋白質(zhì)吸附到芯片上后，將結(jié)合蛋白質(zhì)解離成核電離子以繪制質(zhì)譜圖。將健康人與腫瘤患者的蛋白圖譜進(jìn)行比較，能夠發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)的蛋白質(zhì)。JIN等[44]開發(fā)了一種對(duì)糖類抗原19-9正常的胰腺癌患者與健康或良性個(gè)體進(jìn)行診斷和鑒別診斷的方法，使用與CM10芯片聯(lián)合的表面增強(qiáng)激光解吸及電離飛行時(shí)間質(zhì)譜分析相關(guān)樣品，生成了具有不同蛋白質(zhì)的診斷模型。

6 分子生物學(xué)方法

檢測(cè)腫瘤標(biāo)志物的分子生物學(xué)方法包括聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）、熒光原位雜交技術(shù)（fluorescence in situ hybridization， FISH）、逆轉(zhuǎn)錄PCR、單鏈構(gòu)象多態(tài)性 （single-strand conformation polymorphism，SSCP）、多種測(cè)序技術(shù)等。分子生物學(xué)技術(shù)具有高通量，特異性強(qiáng)、敏感性高等優(yōu)勢(shì)，但也存在價(jià)格昂貴、檢測(cè)周期長(zhǎng)等缺點(diǎn)。

PCR是目前被廣泛使用的一種簡(jiǎn)單、敏感、高效、特異和快速的，能在體外擴(kuò)增DNA的技術(shù)。由經(jīng)典PCR衍生出的技術(shù)被廣泛應(yīng)用于腫瘤標(biāo)志物的檢測(cè)，如逆轉(zhuǎn)錄PCR被用于口咽癌[45]、結(jié)直腸癌[46]、前列腺癌[47]、肺癌[48]等多種腫瘤的檢測(cè)。甲基化特異性PCR是一種檢測(cè)特異位點(diǎn)甲基化的技術(shù)[49]，檢測(cè)DNA甲基化敏感性極高，KOIKE等[50]發(fā)現(xiàn)甲基化特異性PCR對(duì)于胃癌標(biāo)志物的檢出率高于逆轉(zhuǎn)錄PCR。此外，多種PCR衍生技術(shù)如擴(kuò)增融合PCR、實(shí)時(shí)熒光定量PCR等也被運(yùn)用于腫瘤標(biāo)志物的檢測(cè)。

FISH以標(biāo)記的特異寡聚核苷酸片段作為探針，根據(jù)核酸堿基配對(duì)原理，將標(biāo)記的探針與單鏈核酸片段配對(duì)，在熒光顯微鏡下觀察目標(biāo)序列的分布。FISH雖屬于低通量檢測(cè)，但目前已被用于檢測(cè)腫瘤細(xì)胞[51]、突變?nèi)旧w[52]、染色體重排[53]，在腫瘤生物標(biāo)志物檢測(cè)和個(gè)體化醫(yī)療方面具有重要意義。

7 液體活檢

液體活檢是一種從血液等非實(shí)性樣本中取樣，用于診斷和檢測(cè)腫瘤的方法。液體活檢技術(shù)主要包括循環(huán)腫瘤細(xì)胞（circulating tumor cell，CTC）檢測(cè)、循環(huán)腫瘤DNA （circulating tumor DNA， ctDNA）檢測(cè)、外泌體檢測(cè)等。與組織活檢相比，液體活檢能夠早期篩查、檢測(cè)腫瘤標(biāo)志物，克服了腫瘤的時(shí)空異質(zhì)性，具有無創(chuàng)、易反復(fù)取樣、操作簡(jiǎn)便、可實(shí)時(shí)監(jiān)控等優(yōu)點(diǎn)，但同時(shí)也有價(jià)格昂貴、檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)不統(tǒng)一等缺點(diǎn)。CTC檢測(cè)目前主要使用的是免疫細(xì)胞化學(xué)方法，但CTC極低的豐度及其異質(zhì)性使其面臨著技術(shù)挑戰(zhàn)。ctDNA檢測(cè)主要采用分子生物學(xué)方法，但ct DNA具有易降解、含量低等缺點(diǎn)，為精準(zhǔn)檢測(cè)帶來困難。外泌體檢測(cè)在腫瘤診斷方面顯示出良好的應(yīng)用前景，是具有發(fā)展?jié)摿Φ脑\斷方法，但其提取及操作尚無統(tǒng)一流程，檢測(cè)系統(tǒng)有待進(jìn)一步完善，以滿足臨床大規(guī)模樣本檢測(cè)的需要。

8 總結(jié)

腫瘤標(biāo)志物作為臨床上腫瘤輔助診斷、治療參考以及預(yù)后判斷的重要指標(biāo)，目前在應(yīng)用上愈發(fā)廣泛，臨床對(duì)檢測(cè)技術(shù)的要求也不斷發(fā)展。不僅有大量靈敏度或特異性更高的標(biāo)志物被發(fā)現(xiàn)，而且在檢測(cè)方法上也緊跟臨床工作需求而不斷發(fā)展。不同檢測(cè)方法均有其優(yōu)勢(shì)與不足，如何對(duì)不同方法進(jìn)行整合，提高腫瘤標(biāo)志物的檢出能力，是研究者們需關(guān)注和探索的問題。能夠在腫瘤早期檢出低含量腫瘤標(biāo)志物，永遠(yuǎn)是臨床腫瘤診斷的主要需求。不管使用何種材料，使用何種方法，提高檢測(cè)的敏感性和特異性及穩(wěn)定性永遠(yuǎn)是腫瘤標(biāo)志物研發(fā)所追求的目標(biāo)。