葫蘆種子無菌苗組培體系建立

樓均威+張香琴+宋慧

摘要：【目的】建立葫蘆種子無菌苗組培體系，為葫蘆高頻再生體系提供外植體?！痉椒ā恳院J種子為材料，研究了（A）完整種子、（B）切半種子、（C）萌發(fā)種子和（D）剝殼種仁四種種子處理方式和升汞滅菌時(shí)間對(duì)無菌苗獲得的影響。【結(jié)果】葫蘆種子種皮堅(jiān)硬，直接作為外植體滅菌困難。接種葫蘆完整種子和切半種子，均表現(xiàn)為污染率高（4.4%和51.1%）而萌發(fā)率低（0%和4.4%）；接種萌發(fā)種子雖然萌發(fā)率最高（100%）但污染率也最高（66.7%）；種子經(jīng)過剝殼處理和0.1%升汞消毒5min，污染率低（0%）、萌發(fā)率高（84.4%）?！窘Y(jié)論】剝殼種仁是獲得葫蘆無菌苗的最佳外植體，經(jīng)0.1%升汞滅菌5min，接入MS培養(yǎng)基可高效獲得無菌苗，而（A）完整種子、（B）切半種子和（C）萌發(fā)種子均不宜作為獲取葫蘆無菌苗的外植體。

關(guān)鍵詞：葫蘆；種仁；無菌苗

中圖分類號(hào)：S642文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：1003-4374（2017）01-0047-03

Abstract：【Objective】In order to establish a sterile seedling generation system of Lagenaria siceraria so that explants can be provided for the high frequency regeneration system of Lagenaria siceraria.【Method】This experiment，with Lagenaria siceraria seeds as its subjects，studies how the four forms of Lagenaria siceraria seeds [（A）intact seeds，（B）half seeds，（C）germinating seeds and （D）husk-free seeds]and the time span of sterilizing with mercuric chloridge effect on the acquisition of germ-free buds.【Result】In result，as the husk of Lagenaria siceraria seeds is hard，the explants produced by seeds with husk are hard to sterilize.The intact seeds and half seeds have high pollution rate （4.4% and 51.1%）and low germinating rate （0% and 4.4%）；though the germinating seeds had the highest germinating rate （100%），they have the highest pollution rate （66.7%）too；the seeds without husk which are sterilized with 0.1% mercuric chloridge solution for 5 minutes are not polluted，and 84.4% of those seeds are germinated.【Conclusion】In conclusion，husk-free seeds are the ideal explants which can provide germ-free buds through being cultivated in MS culture media after being sterilized with 0.1% mercuric chloridge solution for 5 minutes，and （A）intact seeds，（B）half seeds and （C）germinating seeds are not the suitable explants for being cultivated as Lagenaria siceraria germ-free buds.

Key words： Lagenaria siceraria；husk-free seeds；germ-free buds葫蘆（Lagenaria siceraria），隸屬葫蘆科葫蘆屬，別名瓠子、扁蒲、瓠瓜。它根系發(fā)達(dá)，高抗西瓜枯萎病，作為砧木已廣泛應(yīng)用于西瓜嫁接生產(chǎn)[1]，有效提高西瓜的適應(yīng)性。培育抗病耐逆、抗早衰的砧木品種一直是葫蘆育種的重要目標(biāo)，但經(jīng)過長(zhǎng)期定向選育，葫蘆種群遺傳背景日漸狹窄，很多優(yōu)異抗性在日益惡化的生態(tài)條件下逐漸退化，大大降低葫蘆抗性育種的親本選擇范圍，減緩選育進(jìn)程[2-3]。

轉(zhuǎn)基因技術(shù)是種質(zhì)創(chuàng)新和品種改良的便捷途徑，建立無菌苗組培體系更是利用遺傳轉(zhuǎn)化導(dǎo)入優(yōu)良基因的重要前提[4]。瓜類作物中，西瓜、黃瓜、甜瓜和南瓜具有較高經(jīng)濟(jì)價(jià)值，研究較深入，已經(jīng)成功建立了離體再生體系[5-9]，葫蘆因?yàn)榻陙砟軌蜃鳛檎枘居行Ы鉀Q瓜類生產(chǎn)連作障礙問題，逐漸得到重視，但是建立葫蘆無菌苗組培體系、高頻再生體系等基礎(chǔ)研究還很薄弱，制約了轉(zhuǎn)基因技術(shù)在葫蘆抗性育種中的應(yīng)用。為此，本試驗(yàn)旨在參考其他瓜類作物相關(guān)研究的基礎(chǔ)上，以葫蘆種子為材料，建立無菌苗組培體系。

1材料和方法

1.1試驗(yàn)材料

葫蘆種子由寧波市農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所繁育提供。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1外植體處理方式選擇顆粒飽滿、大小一致的葫蘆種子，利用四種方式處理外植體（圖1），包括（A）完整種子、（B）切半種子、（C）萌發(fā)種子和（D）剝殼種仁。

1.2.2外植體滅菌時(shí)間種子處理后，首先用清水洗凈，在超凈工作臺(tái)上用75%酒精表面消毒30s，無菌水清洗一次，置于0.1%升汞中消毒，消毒時(shí)間分別設(shè)置5、15、10、20和30min（見表1），之后用無菌水清洗4次。每個(gè)處理以5顆種子/瓶的接種密度，接種于MS培養(yǎng)基上，重復(fù)三次。接種后在光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)，條件為25℃和12h/d光周期。

1.2.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析分別在接種7天、20天和30天，統(tǒng)計(jì)污染種子數(shù)目、萌發(fā)種子數(shù)目和無菌苗數(shù)，依照下列公式計(jì)算污染率、萌發(fā)率。

污染率=（污染種子數(shù)/接種數(shù)目）×100%

萌發(fā)率=（萌發(fā)種子數(shù)/接種數(shù)目）×100%

2結(jié)果與分析

2.1種子處理方式對(duì)葫蘆無菌苗再生的影響

由表2分析可知，葫蘆種子處理方式不同，萌發(fā)率和污染率也不同。按照萌發(fā)率由高到低排列四種處理方式，依次是萌發(fā)種子（100%）、剝殼種仁（84.4%）、切半種子（4.4%）和完整種子（0%）；外植體污染率越小表明消毒效果越好，四種處理污染率由低到高依次是剝殼種仁（0%）、完整種子（4.4%）、切半種子（51.1%）和萌發(fā)種子（66.7%）。萌發(fā)種子接種后萌發(fā)率最高，污染率也最高，表明萌發(fā)種子不適宜作為外植體應(yīng)首先被排除；完整種子種殼堅(jiān)硬，滅菌5min污染率即為0，但是種殼厚較大地阻礙了水分和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)有效滲入，種子萌發(fā)困難，且葫蘆種皮顏色深、接種7天后釋放的色素導(dǎo)致培養(yǎng)基褐化嚴(yán)重，因此完整種子也不適宜作為外植體（圖1A）；接種切半葫蘆種子后培養(yǎng)基褐化減輕，但是污染率高萌發(fā)率低，切半種子仍不是最適宜的種子處理方式。最終確定剝殼種仁是獲得葫蘆無菌苗的最佳外植體處理方式，種仁經(jīng)過消毒，接種后污染率為0%，培養(yǎng)一周后種仁萌發(fā)形成長(zhǎng)勢(shì)良好的無菌苗（見圖2B），成苗數(shù)最多。

2.2外植體種仁滅菌時(shí)間對(duì)無菌苗的影響

從表3可以看出，葫蘆種仁滅菌5min污染率即為0，說明種仁直接與升汞接觸消毒效果好。隨著消毒時(shí)間的延長(zhǎng)，種子萌發(fā)率下降，并出現(xiàn)受升汞毒害現(xiàn)象，表現(xiàn)為胚根生長(zhǎng)受抑制、下胚軸不生長(zhǎng)或者生長(zhǎng)短小、子葉失綠、嚴(yán)重彎曲或者黃化等畸形無菌苗（見圖3）。因此，對(duì)葫蘆種仁消毒時(shí)，消毒時(shí)間以5min為宜。

3結(jié)論與討論

外植體處理是獲得無菌材料的第一步，種子是理想的研究材料，具有取材方便、易于消毒等優(yōu)點(diǎn)，李蕾等[4]和付秋實(shí)等[10]分別選取飽滿黃瓜和甜瓜種子，未去種皮，利用2%NaClO消毒15分鐘，培養(yǎng)3～4天獲得無菌苗；任桂紅[11]利用0.1%升汞消毒南瓜種仁，培養(yǎng)7天后獲得無菌苗。

葫蘆種子種皮堅(jiān)硬，直接作為外植體滅菌困難。本試驗(yàn)接種葫蘆完整種子和切半種子，均表現(xiàn)為污染率高（4.4%和51.1%）而萌發(fā)率低（0%和4.4%）；接種萌發(fā)種子雖然萌發(fā)率最高（100%）但污染率也最高（66.7%），因此確定這些方式不適宜用于處理葫蘆種子進(jìn)行組織培養(yǎng)。葫蘆種子應(yīng)當(dāng)與南瓜種子一樣，采取剝殼處理。試驗(yàn)結(jié)果表明，葫蘆種仁經(jīng)過75%酒精表面消毒30s，再置于0.1%升汞中消毒5min，無菌水清洗后接種污染率最低（0%）、萌發(fā)率高（84.4%），無菌苗長(zhǎng)勢(shì)好。

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