Iss融合蛋白的免疫預(yù)防潛力分析

樊 琛，曾慶華，王 雷，郭興峰，孫小凡，鄭煥芹

(聊城大學(xué)農(nóng)學(xué)院，山東聊城 252059)

某些大腸埃希菌(Escherichiacoli)的致病菌株可引起人畜共患的細(xì)菌性傳染病，病型復(fù)雜，這些傳染病中危害最大的是急性敗血型。大腸埃希菌的毒力是由多種毒力因子共同作用的，包括黏附素、1型菌毛、毒素、外膜蛋白、ColV質(zhì)粒、補(bǔ)體抗性、鐵轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)、宿主細(xì)胞表面改變因子等[1-4]。在敗血型大腸桿菌病中，菌體必須具備抵抗血清抑菌作用和殺菌作用的能力，并能夠在宿主血液環(huán)境中增殖。iss基因編碼的外膜蛋白可以調(diào)節(jié)細(xì)菌表面對補(bǔ)體敏感的位點(diǎn)，導(dǎo)致細(xì)菌表面排斥補(bǔ)體，使菌體具有抵抗宿主血清中補(bǔ)體溶菌作用的能力[5-7]。動物血液中，游離鐵濃度極低，不利于細(xì)菌增殖，因此菌體需要具備獲得鐵的能力才能夠在宿主血液中增殖。ybtA基因及chuA基因被認(rèn)為與雞致病性大腸埃希菌(APEC)的鐵采集系統(tǒng)有關(guān)[8-13]。iss基因由于其序列的高保守性，被認(rèn)為具有亞單位疫苗的潛力。近年來，多項(xiàng)研究致力于將Iss蛋白研發(fā)為亞單位疫苗[14-16]，但其保護(hù)機(jī)理不明。Iss蛋白免疫動物是否也能對敗血型大腸埃希菌其他毒力因子(如ybtA基因、chuA基因編碼產(chǎn)物)發(fā)揮抑制作用尚無相關(guān)研究數(shù)據(jù)。作為單一毒力因子，Iss蛋白能否起到廣泛的免疫保護(hù)作用而應(yīng)用于商業(yè)生產(chǎn)也缺乏試驗(yàn)依據(jù)。目前尚無Iss亞單位疫苗在生產(chǎn)實(shí)際中應(yīng)用的報(bào)道。因此僅采用Iss蛋白這一單一毒力因子制備亞單位疫苗是否具有實(shí)際應(yīng)用潛力，還需要更多的試驗(yàn)數(shù)據(jù)來支持。本研究采用Iss融合蛋白免疫14日齡雛雞，分別進(jìn)行動物試驗(yàn)和體外血清抗性試驗(yàn)，并比較免疫后的動物血清對iss基因、ybtA基因及chuA基因轉(zhuǎn)錄的影響，分析Iss融合蛋白在雞大腸桿菌病免疫預(yù)防中的應(yīng)用潛力及不足之處，以期為Iss蛋白作為亞單位疫苗的研究積累數(shù)據(jù)資料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 雞大腸埃希菌HO2株分離自黑龍江某發(fā)病雞場，經(jīng)中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所鑒定為強(qiáng)毒株，血清型為O2，由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)預(yù)防獸醫(yī)教研室保存，于170 mL/L甘油中-70 ℃冷凍保存[5]；CVCC1553購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，血清型O78，其iss基因序列與HO2菌株的一致。經(jīng)實(shí)驗(yàn)室早前雛雞致死試驗(yàn)、雞胚致死試驗(yàn)、血清抗性試驗(yàn)檢測，2株菌雛雞致死率均為100%、雞胚致死率均為70%，確定2株菌為強(qiáng)致病性血清抗性菌株[17]。

1.1.2 試劑 LB肉湯、麥康凱瓊脂，青島高科技園海博生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；SDS-PAGE蛋白電泳試劑盒和膠回收試劑盒，中科瑞泰(北京)生物科技有限公司產(chǎn)品產(chǎn)品；兔抗雞IgY H&L (HRP) ，Abcam公司產(chǎn)品產(chǎn)品；TMB染色液，Beyotime Biotechnology公司產(chǎn)品產(chǎn)品；脫脂奶粉，伊利乳業(yè)有限責(zé)任公司產(chǎn)品產(chǎn)品；RNA酶抑制劑及dNTP Mixture，TaKaRa公司產(chǎn)品產(chǎn)品；細(xì)胞細(xì)菌總RNA提取試劑盒，天根生化科技(北京)有限公司產(chǎn)品產(chǎn)品；SYBR○RGreen Realtime PCR Master Mix、反轉(zhuǎn)錄酶，東洋紡(上海)生物科技有限公司產(chǎn)品；純化的Iss融合蛋白為聊城大學(xué)食品安全實(shí)驗(yàn)室前期制備，切膠純化產(chǎn)物。

1.1.3 試驗(yàn)用動物 1日齡雛雞，購自聊城陽谷養(yǎng)雞場，飼養(yǎng)至14日齡進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2 方法

1.2.1 抗血清的制備 純化的Iss融合蛋白0.100 mg與等量弗氏佐劑乳化。14日齡雛雞分2組，分別為對照組和免疫組。每組10只，每隔1周肌肉注射免疫1次，四免后5 d，采血分離血清，于-20℃保存?zhèn)溆?。對照組僅注射佐劑。血清臨用前56℃、30 min滅活補(bǔ)體[1,2,8]。

1.2.2 動物體內(nèi)試驗(yàn) 每株待測菌中，14日齡雛雞分3組，分別為空白組、對照組和試驗(yàn)組。 先按照1.2.1方法免疫，四免后7 d進(jìn)行攻毒試驗(yàn)。攻毒試驗(yàn)時，將待測細(xì)菌于LB液體培養(yǎng)基中37℃搖床過夜培養(yǎng)，培養(yǎng)物用PBS洗2次，并用PBS懸浮。每只雛雞肌肉注射0.2 mL菌液(約109CFU)，每組10只?？瞻捉M不免疫不攻毒，對照組僅注射佐劑并攻毒，試驗(yàn)組免疫并攻毒。連續(xù)觀察7 d，記錄死亡和發(fā)病情況[15-16]。

1.2.3 抗血清效價檢測 純化的融合蛋白用包被液稀釋至10 μg/mL，每孔100 μL。待檢血清倍比稀釋，二抗1∶5 000稀釋。采用常規(guī)間接ELISA檢測抗體效價[1,5]。

1.2.4 間接ELISA 新鮮培養(yǎng)的菌體以全菌體的方式用包被液稀釋至108個/mL，每孔100 μL。抗血清1∶100稀釋，二抗1∶5 000稀釋。反應(yīng)時間、溫度等條件與常規(guī)間接ELISA相同，TMB顯色[1,5]。

1.2.5 凝集試驗(yàn) 用生理鹽水按1∶10、1∶20、1∶40、1∶80、1∶160、1∶320稀釋抗血清，加入等量1×109個/mL的菌液，觀察是否有凝集現(xiàn)象。

1.2.6 抗Iss血清對菌株血清抗性抑制作用的檢測 按1∶100接待測菌于LB中，并分別按1∶100加入56℃ 30 min滅活的Iss蛋白抗血清及陰性對照血清，于37℃培養(yǎng)至對數(shù)期。取1 mL對數(shù)期菌液于8 000 r/min離心5 min，0.6 mol/L NaCl溶液洗2次。9 g/L生理鹽水重懸混勻，倍比稀釋至106CFU/mL。取0.1 mL菌液加入0.5 mL生理鹽水、0.4 mL新鮮雞血清混合，混合物于37℃溫育。分別于0、2 h取樣涂板，37℃培養(yǎng)18 h后平板計(jì)數(shù)，記錄菌落數(shù)[1,3]。按下式計(jì)算：

試驗(yàn)組： Δlg=lg(2 h)-lg(0 h)

對照組： Δlg=lg(2 h)-lg(0 h)

抑制作用：ΔΔlg=Δlg(試驗(yàn)組)-Δlg(對照組)

同時于0、2 h取樣，采用實(shí)時熒光定量PCR檢測相關(guān)基因mRNA的表達(dá)水平。

1.2.7 實(shí)時熒光定量PCR RNA提取及反轉(zhuǎn)錄按試劑盒說明書和實(shí)驗(yàn)室常規(guī)方法進(jìn)行；real-time PCR中，擴(kuò)增相應(yīng)目的片段的引物序列為：iss基因上游引物5′-GCCGCTCTGGCAATGCTTATTACA-3′，下游引物5′-TCCTTTGGTGTTACTGCTGTCGGT-3′；ybtA基因上游引物5′-CCGATTCGAGAGCATTACCC-3′，下游引物5′-CAACAGCAGTGGGAGTCGAT-3′；chuA上游引物5′-CAGATAACAAAAGGAGCAAGGC-3′，下游引物5′-CTGACGATAATACTCACCGCC-3′；GAPDH基因上游引物5′-CATCGTTTCCAACGCTTCCT-3′，下游引物5′-ACCTTCGATGATGCCGAAGTT-3′。反應(yīng)條件95℃ 3 min；95℃ 10 s，56℃ 30 s，39個循環(huán)。結(jié)果用△Ct表示[13]。

2 結(jié)果

2.1 體內(nèi)攻毒試驗(yàn)結(jié)果

雛雞肌肉注射細(xì)菌后，注射CVCC1553及HO2菌株的試驗(yàn)組和對照組雞只均出現(xiàn)腹瀉癥狀，注射CVCC1553的組在觀察期間無死亡，注射HO2的組在觀察期間試驗(yàn)組和對照組各死亡1只；空白組未出現(xiàn)腹瀉癥狀及死亡(表1)。剩余雞只采血檢測血液中細(xì)菌含量，結(jié)果顯示,僅HO2菌株攻毒的對照組和試驗(yàn)組血樣中檢出大腸埃希菌，且對照組和試驗(yàn)組的活菌數(shù)相近，均為3 CFU/10 mL～4 CFU/10 mL；CVCC1553菌株攻毒的對照組和試驗(yàn)組血樣中均未檢出大腸埃希菌。表明Iss融合蛋白免疫14日齡雛雞未產(chǎn)生明顯的保護(hù)作用。

2.2 抗血清對菌株血清抗性抑制體外試驗(yàn)結(jié)果

待測菌株分別于抗血清及陰性對照血清中溫育后，再與新鮮雞血清混合。HO2菌株的抗血清組及陰性血清組的菌體與新鮮血清混合0 h的活菌數(shù)相近， 2 h后兩組活菌數(shù)差異明顯，抗血清組活菌數(shù)明顯低于陰性血清組的。而CVCC1553菌株的抗血清組及陰性血清組與新鮮血清混合0、2 h的活菌數(shù)均相近，結(jié)果用△△lg表示(表1)。

本試驗(yàn)中，平板計(jì)數(shù)的誤差通?！?.200。采用95%置信區(qū)間分析，上限為0.176，下限為-0.158。HO2菌株的△△lg明顯小于下限(-0.158)，可認(rèn)為抗血清組及陰性血清組菌體在加入新鮮血清培養(yǎng)2 h后的活菌數(shù)有明顯差異，即抗血清組菌體的血清抗性受到抑制。CVCC1553菌株的△△lg大于下限，小于上限，表明抗血清未對菌體的血清抗性產(chǎn)生抑制。

表1 體外血清抗性抑制試驗(yàn)及體內(nèi)攻毒試驗(yàn)結(jié)果

2.3 間接ELISA及凝集試驗(yàn)結(jié)果

經(jīng)間接ELISA檢測，抗血清的效價為1∶100。采用全菌體包被ELISA檢測時，抗血清及陰性血清的待測樣孔ΔOD 492 nm<0.050，P/N<2.1，皆為陰性。在凝集試驗(yàn)中，各稀釋濃度均未出現(xiàn)凝集現(xiàn)象。說明融合蛋白免疫雛雞產(chǎn)生了相應(yīng)的抗體，但抗體效價較低。全菌體包被間接ELISA及凝集試驗(yàn)皆為陰性，表明抗血清與全菌體直接結(jié)合的作用較弱。

2.4 實(shí)時熒光定量PCR結(jié)果

抗血清組及陰性對照血清組培養(yǎng)至對數(shù)期的菌體，與新鮮血清混合后分別于0、2 h取樣，采用實(shí)時熒光定量PCR檢測iss、ybtA及chuA基因的mRNA轉(zhuǎn)錄水平，看家基因?yàn)镚APDH，結(jié)果用△Ct表示(表2)。

表2 實(shí)時熒光定量PCR檢測結(jié)果

△Ct越大則樣本拷貝數(shù)越小。由表2可知，HO2菌株iss、ybtA及chuA基因的△△Ct0 h>0，即0 h時抗血清組△Ct0 h均大于陰性血清組，抗血清組的iss、ybtA及chuA基因mRNA拷貝數(shù)低于陰性血清組。表明HO2菌株與抗血清培養(yǎng)后，抗血清對其iss、ybtA及chuA基因mRNA的轉(zhuǎn)錄水平均產(chǎn)生抑制。CVCC1553菌株iss、ybtA及chuA基因△△Ct0 h<0或接近0，顯示抗血清對CVCC1553菌株這些基因的轉(zhuǎn)錄未產(chǎn)生明顯的抑制作用。這與體外血清抗性抑制試驗(yàn)結(jié)果一致。提示Iss抗血清可能通過抑制iss等相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，降低毒力因子的表達(dá)，從而抑制菌株的血清抗性。但其抑制作用在不同菌株中的效果差異較大。

3 討論

血清對大腸埃希菌的抑菌作用和殺菌作用可能受到莢膜抗原、脂多糖和特定外膜蛋白等因素影響。抑制菌株的血清抗性或/和降低菌株在血液中的增殖，可減緩大腸桿菌病的進(jìn)程，尤其是減少敗血癥的發(fā)生。iss基因編碼的外膜蛋白可以通過調(diào)節(jié)細(xì)胞表面上對補(bǔ)體復(fù)合體敏感的位點(diǎn)，導(dǎo)致細(xì)胞表面排斥補(bǔ)體，使菌體具有抗血清補(bǔ)體溶菌能力[5-7]。體外試驗(yàn)中，僅HO2菌株的血清抗性被抗血清抑制。在添加補(bǔ)體之前，抗血清和陰性血清組的活菌數(shù)無顯著差異；但添加補(bǔ)體后，活菌數(shù)出現(xiàn)明顯差異。說明抗體并沒有直接殺死細(xì)菌，也不抑制其增殖。推測，抗血清是通過減少Iss蛋白在菌體表面的表達(dá)導(dǎo)致菌體血清抗性下降，進(jìn)而有利于補(bǔ)體發(fā)揮殺菌作用，因此在加入含補(bǔ)體的新鮮血清后，抗血清組的活菌數(shù)明顯下降。采用間接ELISA及凝集試驗(yàn)分析菌株與抗血清的結(jié)合程度，結(jié)果全菌體包被的間接ELISA和凝集反應(yīng)均為陰性，表明抗體與全菌體的直接結(jié)合反應(yīng)較弱；也說明抗血清直接與菌體結(jié)合并導(dǎo)致菌體死亡或增殖抑制的可能性較低。由于Iss蛋白錨定在細(xì)胞膜上，而不是游離在細(xì)胞質(zhì)中，即使采用超聲裂解等手段，也不能確定所有Iss蛋白均完全暴露，因此不利于間接ELISA的定量分析，僅適于定性分析。ybtA基因及chuA基因的表達(dá)產(chǎn)物被認(rèn)為與雞致病性大腸埃希菌的鐵采集系統(tǒng)有關(guān)，可調(diào)節(jié)菌體在血清中的鐵獲得能力，有利于菌體在血清中的增殖[8-12]。實(shí)時熒光定量PCR檢測基因的mRNA表達(dá)顯示，抗血清對HO2菌株iss、ybtA及chuA基因的mRNA轉(zhuǎn)錄水平產(chǎn)生抑制，但對CVCC1553菌株此3種基因的mRNA轉(zhuǎn)錄未產(chǎn)生明顯抑制，此結(jié)果與血清抗性抑制試驗(yàn)結(jié)果一致。結(jié)合實(shí)時熒光定量PCR、ELISA、凝集試驗(yàn)及血清抗性試驗(yàn)結(jié)果，推測菌體在增殖分裂過程中受到抗血清的影響，抑制了基因的轉(zhuǎn)錄，使菌體對血清環(huán)境敏感性提高。但I(xiàn)ss抗血清的抑制作用在不同菌株間的差異較大，本試驗(yàn)中的2株菌iss基因序列相同、血清型不同，Iss抗血清對菌株血清抗性的抑制作用與iss基因序列及血清型的關(guān)系還需要采用更多試驗(yàn)樣本進(jìn)行探討。

雖然Iss抗血清在體外試驗(yàn)中表現(xiàn)出對HO2菌株血清抗性的抑制作用，但在體內(nèi)攻毒試驗(yàn)中雞只經(jīng)肌肉注射HO2菌株后，對照組與試驗(yàn)組雞只死亡率沒有差別，發(fā)病情況基本一致，血樣中細(xì)菌活菌數(shù)相近。表明Iss融合蛋白免疫14日齡雛雞未表現(xiàn)免疫保護(hù)作用。Lynne A M等[15]采用GST-Iss融合蛋白免疫14日齡雛雞，2周后用O1、O2、O78血清型大腸埃希菌菌株攻毒，結(jié)果僅O78型菌株攻毒組出現(xiàn)死亡，其中未免疫組死亡3只、免疫組死亡1只(每組12只)；其他組雞只均無死亡。他們認(rèn)為無死亡的雞只中，免疫組的病變程度比未免疫組的輕，因此認(rèn)為Iss蛋白具有免疫保護(hù)作用及做亞單位疫苗的潛力。本研究中，菌株HO2(血清型O2)免疫組和未免疫組均死亡1只雞；CVCC1553菌株(血清型O78)攻毒組均未出現(xiàn)死亡，并且免疫組與未免疫組雞只的病變程度無明顯差異。這可能與菌株差異有關(guān)；但主要因素應(yīng)是大腸埃希菌的毒力是受多毒力因子控制的，單一毒力因子制備的亞單位疫苗的免疫效果和保護(hù)潛力存疑。與血清抗性有關(guān)的基因較多，如iss、traT、K1莢膜、LPS合成基因、ompA等[13]。因此，選用遺傳上較保守的基因(如iss基因)制備亞單位疫苗對大腸桿菌病進(jìn)行預(yù)防雖然是較好的思路，有望克服現(xiàn)有疫苗不能進(jìn)行有效交叉免疫保護(hù)的缺陷，但單一基因的亞單位疫苗對動物的保護(hù)作用是有限。這也解釋了為什么有關(guān)亞單位疫苗的相關(guān)論文較多，但卻幾乎沒有后續(xù)實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用的報(bào)道[14]。探討多基因聯(lián)合的亞單位疫苗可能具有更好的實(shí)際意義。

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