云南紅河州小反芻獸疫的血清學(xué)及分子流行病學(xué)調(diào)查

張容萍，王 薇，劉佳升，李曉紅，段銳銳，鄭玉芳，陳培富*

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，云南昆明 650201；2.紅河州動(dòng)物疫病控制中心，云南蒙自 661100)

小反芻獸疫(Peste des petits ruminants，PPR)俗稱(chēng)羊瘟，是一種以發(fā)熱、眼和鼻漿(膿)液性分泌物、壞死性口腔炎、胃腸炎和支氣管肺炎為特征的急性、接觸性傳染病[1]。該病后期因動(dòng)物繼發(fā)細(xì)菌或寄生蟲(chóng)感染，病死率很高，最高可達(dá)100%[2]，由此造成巨大經(jīng)濟(jì)損失[3]。其病原為副黏病毒科(Paramyxoviridae)麻疹病毒屬(Morbillivirus)中的小反芻獸疫病毒(Peste des petits ruminants virus，PPRV)，有明顯的淋巴組織和上皮組織嗜性。該病毒粒子呈圓形，由核衣殼蛋白(N)、磷蛋白(P)、大蛋白(L)等成分構(gòu)成[4]。PPRV分為4個(gè)基因系[5]，但只有1個(gè)血清型[6]。該病毒主要感染山羊和綿羊，引起的臨床癥狀和病理變化與牛瘟(Rinderpest，RP)極為相似，抗原性與RPV相近并具有血清學(xué)交叉保護(hù)作用[7]，甚至可引起牛無(wú)癥狀和不排毒的自然感染，于是有人曾提出PPRV是牛瘟病毒(Rinderpest virus，RPV)適應(yīng)小反芻獸的一個(gè)變種的說(shuō)法[8]，但后來(lái)證明并不同于RPV[9]。由于可使用RP疫苗預(yù)防PPR[10]，很多國(guó)家和地區(qū)忽視了對(duì)PPR的研究和防控，并由于PPRV不斷變異使RP疫苗不再提供交叉保護(hù)作用，以致形成PPR在非洲和亞洲快速擴(kuò)散的局面。

2006年初，孟加拉國(guó)、印度、尼泊爾、巴基斯坦、哈薩克斯坦、塔吉克斯坦、蒙古等鄰近國(guó)家先后暴發(fā)大規(guī)模PPR疫情[11-12]。2007年，PPR首先傳入我國(guó)西藏，2013年年底擴(kuò)散至新疆，隨后僅僅2個(gè)月，就在甘肅、內(nèi)蒙古、寧夏、湖南、遼寧、安徽和重慶7個(gè)省份發(fā)生。截止2014年年底，我國(guó)共有22個(gè)省份261個(gè)縣發(fā)生疫情，總體呈從西向東擴(kuò)散趨勢(shì)[13-14]，其中云南發(fā)病數(shù)最多[15]。從2017年起，PPR已被我國(guó)農(nóng)業(yè)部列入國(guó)家強(qiáng)制免疫計(jì)劃。為了解小反芻獸疫在紅河州的流行情況及防控現(xiàn)狀，我們對(duì)近年采集自當(dāng)?shù)氐臉悠?，?yīng)用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)和反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)進(jìn)行小反芻獸疫的血清學(xué)及分子流行病學(xué)調(diào)查。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物樣品 樣品包括來(lái)自2014年3月—2016年10月接種新疆天康公司小反芻獸疫減毒疫苗(Nigeria 75/1弱毒株)的山羊血清和組織，具體包括采集自紅河州13個(gè)縣市、132個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)抽檢的免疫羊血清920份，采集自紅河州10個(gè)縣市、132個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)采集的結(jié)膜分泌物及鼻、口腔、直腸等拭子，以及淋巴結(jié)、扁桃體、脾、肺、大腸等組織215份。

1.1.2 主要試劑和儀器 ELISA試劑盒，國(guó)家級(jí)動(dòng)物蟲(chóng)媒病檢測(cè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室產(chǎn)品；Arthos 2010型酶標(biāo)儀，鄭州博賽安圖公司產(chǎn)品；蛋白酶K，MERCK公司產(chǎn)品；AxyPrep體液病毒，Axygen公司產(chǎn)品；10×one step RNA PCR buffer，寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品；dNTP Mixture，上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司產(chǎn)品；PCR儀，Tadvanced公司產(chǎn)品。

1.1.3 引物及參考序列 以GenBank EU360596.1為參考序列，設(shè)計(jì)擴(kuò)增病毒N基因大、小片段的PCR引物。小片段正向引物(PPRV-F1)為T(mén)CT CGG AAA TCG CCT CAC AGA CTG，反向引物(PPRV-R1)為CCT CCT CCT GGT CCT CCA GAA TCT，預(yù)期擴(kuò)增片段長(zhǎng)度339 bp。大片段(含全長(zhǎng)N基因)正向引物為(PPRV-F2)GAG GAG GAG GAG CAA GAT CTC TGA TT，反向引物(PPRV-R2)為T(mén)CT CGT CAC TGA TTT CGA CAG AGG GT，預(yù)期擴(kuò)增片段長(zhǎng)度1 694 bp。用于比對(duì)的國(guó)內(nèi)外毒株參考序列有17條(表1)。

表1 PPRV參考毒株

1.2 方法

1.2.1 ELISA競(jìng)爭(zhēng)法檢測(cè)血清抗體 待血液凝固，收集血清，放入4℃冰箱保存。按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定血清抗體，由酶標(biāo)儀讀取OD值，計(jì)算抑制百分率(PI)值，PI=100-(被檢血清平均OD值/單克隆抗體對(duì)照平均OD值)×100。結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：PI≥50的為PPRV感染陽(yáng)性(50～79之間為弱陽(yáng)性，大于80為強(qiáng)陽(yáng)性)；PI<50的為PPRV感染陰性。

1.2.2 RT-PCR擴(kuò)增分析PPRV核酸片段

1.2.2.1 RNA的提取 取一小塊組織病料，剪碎后放入一個(gè)1.5 mL滅菌Eppendorf管，加入200 μL組織裂解液，用大口徑槍頭吹打混勻；然后加入20 μL蛋白酶K，顛倒使之充分混勻；將裂解物放置在55℃水浴3 h或者直至組織消化完全。按AxyPrep體液病毒DNA/RNA小量試劑(離心柱型)使用說(shuō)明，提取病毒RNA，置-80℃凍存?zhèn)溆没蛄⒓醋龇崔D(zhuǎn)錄。

1.2.2.2 RT-PCR擴(kuò)增 按照RT-PCR一步法試劑盒說(shuō)明書(shū)，配制50 μL反應(yīng)體系，其中10×One step RNA PCR buffer 5 μL，MgCl2(25 mmol/L)10 μL，dNTP Mixture(10 mmol/L)5 μL，RNase inhibitor(40 U/μL)1 μL，AMV RNase XL(5 U/μL)1 μL，AMV-OptimizedTaq(5 U/μL)1 μL，F(xiàn)orward primer(20 pM)1 μL，Reverse primer(20 pmol/L)1 μL，RNase-free H2O 24 μL，RNA模板1 μL。擴(kuò)增條件：42℃ 60 min；94℃ 5 min；94℃ 1 min，55℃ 30 s，72℃ 30 s,共35個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min。取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行10 g/L瓊脂糖凝膠電泳，應(yīng)用BDA live分析系統(tǒng)檢查擴(kuò)增結(jié)果。切下含有目的條帶的凝膠塊，放入離心管，按DNA回收純化試劑盒操作純化，置-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 陽(yáng)性RT-PCR產(chǎn)物測(cè)序鑒定及序列的分析比對(duì) 選取N基因大片段擴(kuò)增呈陽(yáng)性的PCR產(chǎn)物，送樣由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行雙向核苷酸序列測(cè)定。應(yīng)用DNA Star軟件將所獲7條核苷酸序列和搜索自GenBank的17條PPRV參考序列保存為*.Seq和*.Pro格式文件，并調(diào)用MegAlign程序進(jìn)行Clustal W模式比對(duì)，然后在Veiw菜單中Sequence Distance和Phylogenetic Tree提取序列比對(duì)結(jié)果和進(jìn)化樹(shù)圖。結(jié)合毒株時(shí)空分布情況，分析紅河州PPRV毒株的來(lái)源及演變特征。

2 結(jié)果

2.1 ELISA檢測(cè)結(jié)果

在被檢920份羊血清樣品中，抗體陽(yáng)性650份，即陽(yáng)性率為70.65%，除綠春縣和屏邊縣外，全州其余縣市的免疫血清抗體陽(yáng)性率均較高(圖1)。從采集血清樣品的時(shí)期看，以2015年3月的樣品陽(yáng)性檢出率最低。

1.個(gè)舊;2.開(kāi)遠(yuǎn);3.蒙自;4.屏邊;5.建水;6.石屏;7.彌勒;8.瀘西;9.元陽(yáng);10.紅河;11.綠春;12.金平;13.河口

1.Gejiu;2.Kaiyuan;3.Mengzi;4.Pingbian;5.Jianshui;6.Shiping;7.Mile;8.Luxi;9.Yuanyang;10.Honghe;11.Lüchun;12.Jinping;13.Hekou

圖1紅河州不同縣市PPR免疫抗體陽(yáng)性率分布情況

Fig.1 Distribution of positive rates of serum antibodies against PPR vaccine in counties of Honghe prefecture

2.2 RT-PCR檢測(cè)結(jié)果

在被檢215份組織樣品中，屏邊縣樣品病毒核酸陽(yáng)性率最高，為59.46%，其次是綠春縣33.33%、蒙自市20%、建水縣14.29%、個(gè)舊市13.16%和元陽(yáng)縣8.33%，其余縣市為陰性。RT-PCR擴(kuò)增呈陽(yáng)性的條帶與疫苗株陽(yáng)性對(duì)照條帶相符(圖2)。

2.3 PPRV N基因同源性比較和遺傳進(jìn)化分析

2.3.1 PPRV N基因核苷酸的同源性比較結(jié)果 就N基因核苷酸同源性而言，紅河州PPRV毒株與新疆伊犁XJYL2013株、西藏3個(gè)毒株、河南省3個(gè)毒株、北京市毒株及廣東毒株的同源性分別為99.7%～100%、97.8%～98.1%、99.6%～99.9%、98.9%～99.2%和27.9%～30.4%，均高于與Nigeria /75 /1疫苗株的同源性(93.3%～93.6%)。與國(guó)外毒株相比，紅河州毒株與其他國(guó)家毒株的核苷酸同源性范圍為88.6%～98.1%(圖3)，以India 2003株最高，以Uganda 2012株最低。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000;1、2.不同縣市來(lái)源的陽(yáng)性樣品;3.疫苗株陽(yáng)性對(duì)照;4.陰性對(duì)照

M.DNA Marker DL 2 000;1，2.Positive samples from different counties;3.Nigeria75/1 vaccine strain;4.Negative control

圖2 PPRV陽(yáng)性樣品RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳分析

Fig.2 Electrophoresis analysis of RT-PCR products from partial PPRV positive samples

圖3 PPRV N基因核苷酸的同源性比較

2.3.2 與標(biāo)準(zhǔn)株的N基因片段序列比對(duì)結(jié)果 所獲7條紅河州PPRV核苷酸序列與國(guó)內(nèi)其他毒株比對(duì)，未見(jiàn)顛換、缺失或插入現(xiàn)象，均為轉(zhuǎn)換位點(diǎn)。當(dāng)?shù)亓餍卸局昱c新疆伊犁和河南毒株最為相似，偶見(jiàn)636位點(diǎn)存在C→T轉(zhuǎn)換，與北京和西藏毒株相比則存在多位點(diǎn)突變，與國(guó)外毒株堿基差異較大(表2)。

2.3.3 N基因遺傳進(jìn)化樹(shù)分析結(jié)果 N基因系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)顯示，2015年中國(guó)云南省紅河州毒株與中國(guó)西藏毒株、新疆毒株和中國(guó)2014年內(nèi)地毒株均屬于基因Ⅳ系PPRV，但2013年—2015年毒株與中國(guó)西藏毒株劃分為2個(gè)不同的小分支，中國(guó)株與印度株和土耳其株進(jìn)化關(guān)系最近(圖4)。

表2 N基因序列比較

圖4 基于PPRV N基因建立的遺傳進(jìn)化樹(shù)

3 討論

本試驗(yàn)采用競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)血清，發(fā)現(xiàn)抗體陽(yáng)性率為70.65%，表明疫苗免疫效果較好。疫苗接種是防控PPR的主要手段[16]。目前用Vero細(xì)胞傳代研制的小反芻獸疫減毒疫苗有Nigeria 75/1、Sungri/96、Arasur/87和Coimbatore/97等4株[15,17]。本次調(diào)查羊群接種的疫苗為Nigeria 75/1株(基因Ⅱ系毒株)，發(fā)現(xiàn)有的縣市抗體合格率不是很高，提示可能存在保護(hù)不全、傳入疫病的風(fēng)險(xiǎn)。由于云南山區(qū)較多，養(yǎng)殖戶(hù)分散且偏遠(yuǎn)，疫苗在運(yùn)輸過(guò)程中若保存不當(dāng)，很容易失效。就PPR而言，羊群的發(fā)病率和病死率主要由動(dòng)物免疫狀態(tài)和毒株毒力共同決定。當(dāng)?shù)剞r(nóng)戶(hù)采取以放牧為主的養(yǎng)殖模式，以及牲畜交易，使PPRV有機(jī)會(huì)感染未有效免疫的羊群。雖然疫苗接種對(duì)控制該病非常重要，但由于PPRV還可自然感染羚羊、鹿等野生動(dòng)物[8]，根除該病是很困難的。

應(yīng)用RT-PCR檢測(cè)組織樣品攜帶PPRV保守性N基因核酸片段的情況，發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性率為20.46%，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)?shù)豍PRV流行毒株基因型與印度株和土耳其株很近。有學(xué)者根據(jù)PPRV基因序列的差異，將其劃分為4個(gè)系：Ⅰ系分布在西非，Ⅱ系在非洲北部的尼日利亞和喀麥隆，Ⅲ系主要分布在東非，而Ⅳ系主要分布在中東和西亞。本次檢出的流行毒株與國(guó)內(nèi)其他地區(qū)的流行毒株均為基因Ⅳ系，與周邊國(guó)家一致,故其傳播來(lái)源應(yīng)為與中國(guó)接壤的西部或西南部國(guó)家[14]。云南省有較長(zhǎng)的邊境線(xiàn)，與PPRV流行的多個(gè)國(guó)家相鄰，存在跨境傳入疫病的風(fēng)險(xiǎn)，但從本次調(diào)查結(jié)果來(lái)看，當(dāng)?shù)亓餍卸局昱c國(guó)內(nèi)其他流行毒株的N基因同源性最高，與印度株和土耳其株次之，推測(cè)最初從國(guó)外傳入，再伴隨引種傳入云南。由于我們未開(kāi)展流行毒株的分離培養(yǎng)和全基因組測(cè)序分析，所檢流行毒株的具體來(lái)源有待確定?？傊?，嚴(yán)格檢疫是除疫苗接種外的PPR防控必要手段。

[1] Bao J Y.Sequence analysis of the nucleocapsid gene and genome promoter region of peste des petits ruminants virus of Chinese origin[J].Bing Du Xue Bao,2008,24(6):464-471.

[2] Torsson E,Kgotlele T,Berg M,et al.History and current status of peste des petits ruminants virus in Tanzania[J].Infect Ecol Epidemiol,2016,6:10.

[3] Banyard A C,Parida S,Batten C.Global distribution of peste des petits ruminants virus and prospects for improved diagnosis and control[J].Gen Virol,2010,91(12):2885-2897.

[4] Yang Y,Qin X D,Song Y M,et al.Development of real-time and lateral flow strip reverse transcription recombinase polymerase amplification assays for rapid detection of peste des petits ruminants virus[J].Virol J,2017,14(1):24.

[5] 肖 敏,包世俊,邢小勇,等.小反芻獸疫病毒甘肅株F基因的克隆、原核表達(dá)及多克隆抗體的制備[J].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào),2017,25(3):477-484.

[6] ShailaM S.Geographic distribution and epidemiology of peste des petits ruminants virus[J].Virus Res,1996,43(2):149-153.

[7] Rahman A,Abubakar M,RassoolM H,et al.Evaluation of risk factors for peste des petits ruminants virus in sheep and goats at the wildlife-livestock interface in Punjab province,Pakistan[J].Bio Med Res Int,2016(12):7826245.

[8] Hamdy F M.Immunologic relationship between rinderpest and peste des petits ruminants viruses[J].Proc Annu Meet U S Anim Health Assoc,1975，(79):168-179.

[9] Chandran N D,Kumanan K,Venkatesan R A.Differentiation of peste des petits ruminants and rinderpest viruses by neutralisation indices using hyperimmune rinderpest antiserum[J].Trop Anim Health Prod,1995,27(2):89-92.

[10] 王 竹.小反芻獸疫疫苗的研究進(jìn)展[J].畜牧獸醫(yī)科技信息,2011,8(2):3-4.

[11] 羅 靜,何宏軒.小反芻獸疫病毒的分子生物學(xué)特性及其在全球的流行[J].河北師范大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,2009,33(4):543-550.

[12] 王志亮.家畜傳染病學(xué)分會(huì)第十三次學(xué)術(shù)研討會(huì)學(xué)術(shù)報(bào)告之二——我國(guó)小反芻獸疫的發(fā)現(xiàn)及其在匿藏地區(qū)自然演化規(guī)律的研究[J].獸醫(yī)導(dǎo)刊,2009(10):10-11.

[13] 南文金.小反芻獸疫病毒分子生物學(xué)與疫苗研究進(jìn)展[J].中國(guó)動(dòng)物檢疫,2009,26(1):62-65.

[14] 劉永宏,趙 麗,曹勝波,等.小反芻獸疫在中國(guó)的流行趨勢(shì)及應(yīng)對(duì)措施[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2015,36(1):110-113.

[15] 李金明，吳曉東，王志亮，等.我國(guó)小反芻獸疫的歷史與現(xiàn)狀[C]//中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)動(dòng)物傳染病學(xué)分會(huì)第十六次學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集,山東濟(jì)南：2015:38-40.

[16] Hammami P,Lancelot R,Lesnoff M.Modelling the dynamics of post-vaccination immunity rate in a population of Sahelian sheep after a vaccination campaign against peste des petits ruminants virus[J].PLoS One,2016,11(9):e0161769.

[17] 蘇 一. 小反芻獸疫疫苗研究進(jìn)展[J].畜禽業(yè),2015(4):9.