不同CpG ONDs對(duì)豬源細(xì)胞免疫分子轉(zhuǎn)錄水平的影響

鄧 慧, 張麗琳,黎瑞巧, 張 蕾, 黃金海

(天津大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，天津 300072)

CpG ODNs寡聚脫氧核苷酸(CpG oligodeoxy-nucleotieds,CpG ODNs)是含胞嘧啶和鳥嘌呤的二核苷酸的寡聚脫氧核苷酸。大量研究證實(shí)，含有未甲基化CpG基序的細(xì)菌DNA或人工合成的寡聚脫氧核苷酸是一種強(qiáng)大的免疫激動(dòng)劑。CpG ODNs能夠直接激活pDC和B細(xì)胞，從而引發(fā)先天性和適應(yīng)性免疫應(yīng)答[1]。由CpG ODNs引發(fā)的級(jí)聯(lián)反應(yīng)能夠間接誘導(dǎo)NK細(xì)胞、單核細(xì)胞、T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的成熟分化和增殖[2-6]。TLR9的激活可誘導(dǎo)B細(xì)胞產(chǎn)生IL-6、IL-12和趨化因子CXC并誘導(dǎo)B細(xì)胞表達(dá)IgM[7-9]。被CpG ODNs激活的B細(xì)胞可上調(diào)表達(dá)Fc的表達(dá)受體(FcR)和共刺激分子MHC Ⅱ類分子(CD40、CD80、CD86)[10-11]。CpG ODNs刺激的B細(xì)胞增殖并分化為漿細(xì)胞和記憶B細(xì)胞[12]。CpG ODNs作為免疫增強(qiáng)劑和疫苗佐劑一開始主要以小鼠和人為研究模型，2001年，Kamstrup S等[13]首次研究了CpG ODNs對(duì)豬PBMCs刺激的作用以及篩選出最適合豬的特異性基序ATCGAT。有研究表明，使用CpG ODNs作為免疫佐劑，可以增強(qiáng)仔豬對(duì)豬鏈球菌敗血癥疫苗(SSSK疫苗)的免疫應(yīng)答，包括增強(qiáng)SSSK疫苗的特異性抗體滴度、淋巴細(xì)胞增殖，增強(qiáng)PBMCs上IFN-γ、IL-6、MHCⅡ和CD14的表達(dá)[14]。

為了篩選出能有效激活豬免疫系統(tǒng)的CpG ODNs的序列，設(shè)計(jì)并合成了7種引物[13]，包含CpG的寡聚核苷酸，并用其刺激豬小腸上皮細(xì)胞(IPEC-J2)、豬肺泡巨噬細(xì)胞(3D4/21)和豬外周血單核細(xì)胞(PBMCs)，檢測(cè)3種細(xì)胞中多種細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄水平變化，同時(shí)還檢測(cè)了經(jīng)CpG ODNs處理后的IPEC-J2中病毒增殖的變化。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 CpG ODNs的設(shè)計(jì)與合成 總結(jié)人與小鼠的CpG ODNs的特征，結(jié)合最適合豬的CpG基序ATCGAT共設(shè)計(jì)合成了7條包含CpG單元的序列(部分硫代修飾)，引物由蘇州金唯智生物科技有限公司合成(表1)。

1.1.2 細(xì)胞及病毒 豬腸道上皮細(xì)胞系(IPEC-J2)，購(gòu)自廣州吉妮歐生物科技有限公司；外周血單核細(xì)胞(PBMCs)，天津大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院微生物與免疫實(shí)驗(yàn)室分離自天津市寧河原種豬場(chǎng)的豬；豬肺泡巨噬細(xì)胞(3D4/21)，中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院病毒室惠贈(zèng)；豬流行性腹瀉病毒(PEDV)及水皰性口炎病毒(VSV)-GFP，天津大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院微生物與免疫實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.3 主要試劑 淋巴細(xì)胞分離液，天津?yàn)笊镏苿┯邢薰井a(chǎn)品；RMPI-1640與H-DMEM完全培養(yǎng)液，Gibico公司產(chǎn)品；胎牛血清(FCS)，蘭州百靈生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；Poly(I:C)，北京達(dá)科為生物有限公司產(chǎn)品；熒光定量PCR試劑：AceQ qPCR SYBR Green Master Mix試劑盒，南京諾唯贊生物公司產(chǎn)品；Tran Script First-Strand cDNA Synthesis Super Mix第一鏈合成試劑盒，北京全式金生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；Trizol LS reagent、DEPC，Invitrogen公司產(chǎn)品。

表1 CpG ODNs序列及能量

*代表硫代磷酸二酯鍵；下劃線代表CpG單元。

*Phosphorothioate backbone;CpG motif marked with underline.

1.1.4 主要儀器 CO2培養(yǎng)箱和生物安全柜，美國(guó)Thermo fisher公司產(chǎn)品；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(ABI 7500)、倒置熒光顯微鏡(型號(hào) IX73)，日本奧林巴斯公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 外周血單核細(xì)胞的分離及培養(yǎng) 無(wú)菌采集豬全血與EDTA抗凝劑按4∶1加入到50 mL離心管，淋巴細(xì)胞分離按說(shuō)明書分離。IPEC-J2細(xì)胞與3D4/21細(xì)胞的培養(yǎng)與計(jì)數(shù)同PBMCs，IPEC-J2細(xì)胞使用100 mL/L FCS-H-DMEM培養(yǎng)，PBMCs與3D4/21細(xì)胞使用100 mL/L FCS-RMPI 1640培養(yǎng)?；罴?xì)胞計(jì)數(shù)按照細(xì)胞濃度1×106個(gè)/mL每孔2 mL鋪于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，置于37℃體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)備用。

1.2.2 CpG ODNs體外刺激試驗(yàn) 按照7個(gè)試驗(yàn)組(CpG1、CpG6-CpG11)、陽(yáng)性對(duì)照組(Poly(I:C))、陰性對(duì)照(non-CG序列)、空白對(duì)照設(shè)置培養(yǎng)孔，每個(gè)試驗(yàn)組均設(shè)3組重復(fù)。待細(xì)胞生長(zhǎng)穩(wěn)定后進(jìn)行體外刺激試驗(yàn)。試驗(yàn)組、陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照刺激終濃度均為10 μg/mL，等體積PBS刺激作為空白對(duì)照。同時(shí)置于37℃體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h后提取總RNA，并合成cDNA。RNA的提取操作按照Invitrogen公司Trizol提取試劑盒說(shuō)明進(jìn)行，cDNA以提取的總RNA為模板，合成按照Trans Script First-strand cDNA Synthesis Super Mix說(shuō)明操作。

1.2.3 熒光定量PCR檢測(cè)細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄水平的變化

1.2.3.1 檢測(cè)引物設(shè)計(jì) 參照NCBI/GenBank登錄的基因用DNA Man軟件分析其序列保守區(qū)，Oligo 7.0軟件分別在其保守區(qū)內(nèi)設(shè)計(jì)熒光定量PCR檢測(cè)引物，由北京金維智公司合成(表2～表6)。

表2 豬TLR分子相對(duì)熒光定量PCR引物

表3 豬TLR信號(hào)通路分子相對(duì)熒光定量PCR引物

表4 豬白細(xì)胞介素相對(duì)熒光定量PCR引物

表5 豬腫瘤壞死因子和干擾素相對(duì)熒光定量PCR引物

1.2.3.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 按照AceQ qPCR SYBR Green Master Mix試劑盒說(shuō)明書，建立20 μL實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系，退火溫度按照引物的最適退火溫度減少2℃操作。real-time qPCR反應(yīng)體系：2×Trans Start Top Green qPCR Super Mix 10 μL，上、下游引物各0.4 μL，cDNA模板 2 μL，Passive reference Dye(50×) 0.4 μL，去離子水6.8 μL。real-time qPCR反應(yīng)程序：95℃ 5 min；95℃ 15 s，Tm降低2℃ 30 s，70℃ 20 s，共45個(gè)循環(huán)；60℃～95℃，熔解曲線分析。

1.2.3.3 數(shù)據(jù)處理 采用相對(duì)熒光定量2-ΔΔCT法進(jìn)行相對(duì)定量分析(ΔΔCT =(Cttarget x-Ctβ-actin)sample-(Cttarget x-Ctβ-actin)control)，值采用Graph Pad Prism統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行Student's t test分析，取轉(zhuǎn)錄水平的平均值作雷達(dá)圖模型取值。CpG ODNs的能量分析使用Chem 3D 15.0軟件分析。

1.2.4 PEDV在IPEC-J2上標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 將500 μL毒液中加入1 mL Trizol Reagent震蕩搖勻，按1.2.2提取RNA并合成cDNA，擴(kuò)增PEDV M基因，引物序列見表7。50 μL反應(yīng)體系如下：10×PCR buffer 5 μL，dNTPs(10 mmol/L)2 μL，上、下游引物(25 pmol/μL)各1 μL，TaqDNA 聚合酶 0.5 μL，cDNA 4 μL，ddH2O 36.5 μL。PCR反應(yīng)程序：94℃ 5 min；53℃ 30 s，72℃ 30 s，30個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min。

表6 豬抗原遞呈相關(guān)分子相對(duì)熒光定量PCR引物

表7 豬PEDV M基因克隆及相對(duì)熒光定量PCR引物

取35 μL PCR產(chǎn)物用15 g/L瓊脂糖凝膠電泳，利用TIANGEN普通瓊脂糖凝膠回收試劑盒對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化回收，操作按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。PCR產(chǎn)物與pUM19-T載體的連接，10 μL反應(yīng)體系：Pum19-T Easy(50 μg/μL) 0.5 μL，膠回收目的片段 3 μL，10×T4連接酶buffer 1 μL，T4 DNA 連接酶 1 μL，ddH2O 4.5 μL。16℃過(guò)夜連接后轉(zhuǎn)化到DH-5α感受態(tài)細(xì)胞，藍(lán)白斑篩選菌株并擴(kuò)大培養(yǎng)。小提質(zhì)粒使用OMEGA公司Plasmid Mini Kit I試劑盒，操作按說(shuō)明書進(jìn)行。用Nanodrop測(cè)定重組質(zhì)粒濃度，根據(jù)質(zhì)粒拷貝數(shù)計(jì)算公式換算成拷貝數(shù)。

108～10310倍梯度稀釋，real-time PCR反應(yīng)體系和程序同1.2.3.2，以每個(gè)濃度對(duì)應(yīng)的CT值做標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線的R2。

1.2.5 不同CpG ODNs對(duì)PEDV在IPEC-J2上增殖的影響 將IPEC-J2調(diào)整細(xì)胞濃度至1×106個(gè)/mL，鋪于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。按照7個(gè)試驗(yàn)組(CpG1、CpG6-CpG11)、陽(yáng)性對(duì)照組(Poly(I:C))、陰性對(duì)照孔、空白對(duì)照設(shè)置培養(yǎng)孔，并設(shè)立3組重復(fù)試驗(yàn)。試驗(yàn)組加CpG ODNs、陽(yáng)性對(duì)照加入Poly(I:C)、刺激終濃度均為10 μg/mL，陰性對(duì)照和空白對(duì)照孔加入等體積的PBS。同時(shí)置于37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)6 h，棄培養(yǎng)基，在試驗(yàn)組、陽(yáng)性對(duì)照組與陰性對(duì)照組接種10 MOI PEDV，空白對(duì)照組不接種PEDV，只加入與試驗(yàn)組等量的培養(yǎng)基，37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)72 h后，按照1.2.2提取總RNA并合成cDNA。以此為模板，進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，將得到的CT值帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，計(jì)算不同組的病毒載量。

1.2.6 不同CpG ODNs對(duì)VSV-GFP在IPEC-J2上增殖的影響 試驗(yàn)組和對(duì)照組的設(shè)置與CpG ODNs處理細(xì)胞的方法均按照1.2.5，處理細(xì)胞6 h后每孔接0.1 MOI VSV-GFP，24 h后清洗3次，DAPI染色10 min，倒置熒光顯微鏡觀察綠色熒光，以綠色熒光強(qiáng)度判斷VSV-GFP的增殖情況。

2 結(jié)果

2.1 CpG ODNs對(duì)TLR9、TLR3、TLR8和TLR9的影響

CpG ODNs在IPEC-J2細(xì)胞上主要促進(jìn)TLR9和TLR3兩種TLRs轉(zhuǎn)錄水平升高，其中除CpG7外，其余CpG ODNs均能促進(jìn)TLR9的轉(zhuǎn)錄水平升高，其中以CpG1和CpG11的促進(jìn)作用最明顯，CpG7可以促進(jìn)TLR3轉(zhuǎn)錄水平的升高。除CpG1和CpG10，其余CpG ODNs可以促進(jìn)TLR3轉(zhuǎn)錄水平升高。CpG ODNs不能促進(jìn)TLR7的轉(zhuǎn)錄水平升高，并且抑制TLR8的轉(zhuǎn)錄。CpG1和CpG11能夠使3D4/21細(xì)胞上TLR3和TLR9的轉(zhuǎn)錄水平顯著升高(圖1)。

2.2 CpG ODNs對(duì)MyD88、NF-κB、p38和IRF3的影響

在IPEC-J2上，CpG ODNs促進(jìn)IPEC-J2細(xì)胞MyD88和NF-κB轉(zhuǎn)錄水平升高，CpG8和CpG10能夠促進(jìn)p38的轉(zhuǎn)錄水平升高，雖然有多種CpG ODNs能夠促進(jìn)TLR3的轉(zhuǎn)錄，但是普遍不能使IRF3的轉(zhuǎn)錄水平升高，只有CpG10和CpG11能夠在PBMCs上促進(jìn)IRF3的轉(zhuǎn)錄水平升高(圖2)。

A.IPEC-J2 cells;B.3D4/21;C.PBMCs

圖1 TLR3、TLR7、TLR8和TLR9在3種細(xì)胞轉(zhuǎn)錄水平的變化

Fig.1 The relative expressions of TLR3，TLR7，TLR8 and TLR9 in different CpG ODNs treatment cells

A.IPEC-J2 cells;B.3D4/21;C.PBMCs

圖2 MyD88、NF-κB、p38和IRF3在3種細(xì)胞轉(zhuǎn)錄水平的變化

Fig.2 The relative expressions of MyD88，NF-κB，p38 and IRF3 in different CpG treatment cells

2.3 CpG ODNs對(duì)白細(xì)胞介素的影響

CpG ODNs能夠促進(jìn)IPEC-J2上IL-2轉(zhuǎn)錄水平的升高，在PBMCs上,能夠促進(jìn)IL-4轉(zhuǎn)錄水平升高，在3D4/21細(xì)胞上,CpG ODNs能促進(jìn)多種白介素轉(zhuǎn)錄水平升高，CpG1和CpG11能夠促進(jìn)IL-4、IL-6、IL-10、IL-12和IL-17的轉(zhuǎn)錄水平升高，CpG7和CpG10也能夠促進(jìn)上述白介素轉(zhuǎn)錄水平升高，但是促進(jìn)作用不如CpG1和CpG11顯著(圖3)。

2.4 CpG ODNs對(duì)IFN-α和IFN-β的影響

CpG ODNs能夠促進(jìn)IPEC-J2上TNF-α的高效轉(zhuǎn)錄，但是對(duì)干擾素的促進(jìn)作用較弱，CpG1、CpG11、CpG7和CpG10能夠促進(jìn)3D4/21細(xì)胞上TNF-α、IFN-α和IFN-β的轉(zhuǎn)錄水平升高。在PBMCs上CpG ODNs能夠促進(jìn)IFN-γ的轉(zhuǎn)錄水平升高(圖4)。

2.5 CpG ODNs對(duì)抗原遞呈相關(guān)分子的影響

在IPEC-J2上CpG ODNs對(duì)抗原遞呈相關(guān)分子轉(zhuǎn)錄的促進(jìn)作用較差，只有CpG10能夠促進(jìn)MHCⅡ的轉(zhuǎn)錄，在3D4/21細(xì)胞和PBMCs上，CpG ODNs能夠強(qiáng)烈促進(jìn)CD86轉(zhuǎn)錄，并且CpG10和CpG11能夠在3D4/21細(xì)胞上促進(jìn)MHCⅡ的轉(zhuǎn)錄(圖5)。

A.IPEC-J2 cells;B.3D4/21;C.PBMCs

圖3白細(xì)胞介素在3種細(xì)胞轉(zhuǎn)錄水平的變化

Fig.3 The relative expressions of the interleukin in different CpG ODNs treatment cells

A.IPEC-J2 cells;B.3D4/21;C.PBMCs

圖4干擾素和腫瘤壞死因子在3種細(xì)胞上轉(zhuǎn)錄水平的變化

Fig.4 The relative expressions of the interferon and anti-tumor necrosis factor in different CpG ODNs treatment cells

A.IPEC-J2 cells;B.3D4/21;C.PBMCs

圖5 MHCⅠ、MHCⅡ和CD86在3種細(xì)胞轉(zhuǎn)錄水平的變化

Fig.5 The relative expressions of major histocompatibility complexes and adhesion molecules in different CpG ODNs treatment cells

2.6 CpG ODNs對(duì)VSV-GFP在IPEC-J2細(xì)胞上增殖的影響

根據(jù)1.2.4得到PEDV標(biāo)準(zhǔn)曲線，R2=0.985 8的線性回歸方程y=-3.167x+36.86,將1.2.5得到的Ct值帶入y中，即得到PEDV的M基因的拷貝數(shù)(即x的值)(圖6)經(jīng)CpG ODNs處理后的IPEC-J2感染PEDV后可顯著降低PEDV在細(xì)胞上的增殖，其中CpG1抵抗PEDV能力最強(qiáng)，經(jīng)CpG ODNs處理后的IPEC-J2也可以明顯觀察到細(xì)胞中綠色熒光數(shù)量少于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組，說(shuō)明CpG ODNs也能夠降低VSV-GFP在細(xì)胞上增殖(圖7和圖8)。

圖6 PEDV在IPEC-J2增殖標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖7 不同CpG ODNs對(duì)PEDV在IPEC-J2增殖的影響

圖8 VSV-GFP在經(jīng)CpG ODN處理IPEC-J2細(xì)胞的增殖

3 討論

通過(guò)查閱總結(jié)文獻(xiàn)設(shè)計(jì)并合成了7條具有不同特征的CpG ODNs,對(duì)7條CpG ODNs在體外對(duì)3種豬源細(xì)胞(IPEC-J2細(xì)胞，3D4/21細(xì)胞，PBMCs)上免疫分子的轉(zhuǎn)錄水平的影響進(jìn)行了評(píng)價(jià)，包括胞內(nèi)TLRs、TLRs相關(guān)信號(hào)通路分子、白細(xì)胞介素、干擾素和腫瘤壞死因子、抗原遞呈相關(guān)分子等。最后還探究了CpG ODNs處理過(guò)IPEC-J2的抗病毒能力的變化。本研究選取了2種單鏈RNA病毒PEDV和VSV，比較了經(jīng)過(guò)CpG ODNs處理過(guò)的細(xì)胞的抗病毒的能力。

檢測(cè)了CpG ODNs處理的3種豬源細(xì)胞免疫應(yīng)答相關(guān)分子的轉(zhuǎn)錄水平變化。表明CpG ODNs可以促進(jìn)IPEC-J2上TLR3和TLR9轉(zhuǎn)錄水平的升高。雖然CpG ODNs促進(jìn)3D4/21細(xì)胞和PBMCs的TLRs及信號(hào)通路分子的轉(zhuǎn)錄升高，作用不及IPEC-J2，但是這并不妨礙3D4/21和PBMCs下游的細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄水平升高，這可能說(shuō)明CpG ODNs在3種細(xì)胞上的作用時(shí)間不同，CpG ODNs可以在IPEC-J2上作用更長(zhǎng)的時(shí)間。CpG ODNs可調(diào)節(jié)細(xì)胞的免疫應(yīng)答類型，平衡Th1/Th2反應(yīng)：CpG1、CpG7、CpG9、CpG10和CpG11可以促進(jìn)多種Th類型細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄(如Th2型細(xì)胞因子IL-4、Th1型細(xì)胞因子IL-12和IFN-γ、局部炎性因子IL-17等)；CpG6和CpG8能夠平衡Th1/Th2反應(yīng)，同時(shí)促進(jìn)Th1型細(xì)胞因子IFN-γ和/或IL-12的轉(zhuǎn)錄水平升高。CpG ODNs也能夠促進(jìn)抗原遞呈能力的增強(qiáng)，CpG ODNs在3D4/21和PBMCs上促進(jìn)了黏附分子CD86轉(zhuǎn)錄水平的升高，提高了APC對(duì)誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞增殖及產(chǎn)生IL-2的能力。并且CpG ODNs對(duì)3種細(xì)胞的MHC分子的轉(zhuǎn)錄也有促進(jìn)作用。CpG ODNs能夠促進(jìn)PBMCs細(xì)胞上干擾素的轉(zhuǎn)錄，PBMCs上IFN-γ和IFN-β相比于IPEC-J2細(xì)胞和3D4/21細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄水平更高。CpG ODNs對(duì)不同細(xì)胞免疫分子轉(zhuǎn)錄的促進(jìn)作用的能力也有較大的差別，例如CpG7促進(jìn)IPEC-J2細(xì)胞的免疫分子轉(zhuǎn)錄較差，但是對(duì)促進(jìn)3D4/21細(xì)胞的免疫分子轉(zhuǎn)錄較強(qiáng)，因此CpG7更加適用于需要提高APC的抗原遞能力的疫苗，而CpG11對(duì)3種細(xì)胞免疫分子轉(zhuǎn)錄的促進(jìn)作用都比較強(qiáng)；CpG1能夠促進(jìn)3D4/21細(xì)胞表達(dá)多種白介素，可以使APC促進(jìn)多種T細(xì)胞的活化。

3種豬源細(xì)胞對(duì)CpG ODNs免疫應(yīng)答反應(yīng)不同。IPEC-J2細(xì)胞作為腸上皮細(xì)胞是機(jī)體的屏障并且是先天免疫反應(yīng)發(fā)生地，3D4/21細(xì)胞是先天免疫細(xì)胞并且可在免疫系統(tǒng)中發(fā)揮APC的作用，在豬小腸上皮細(xì)胞上促進(jìn)TLR9和/或TLR3的轉(zhuǎn)錄水平的效果更為明顯，說(shuō)明CpG ODNs可較好地激活天然免疫反應(yīng)，增強(qiáng)黏膜免疫應(yīng)答。CpG ODNs作為佐劑可促進(jìn)3D4/21細(xì)胞的抗原遞呈能力及協(xié)助T細(xì)胞的激活。CpG ODNs可直接促進(jìn)PBMCs產(chǎn)生干擾素，增強(qiáng)抗感染能力。

不同CpG ODNs對(duì)病毒增殖的抑制作用因病毒而異。CpG ODNs處理細(xì)胞顯著抑制了PEDV的增殖(P<0.01)，其能力排序?yàn)镃pG1> CpG7> CpG6>CpG10> CpG11> CpG9> CpG8。CpG1最接近天然的CpG ODNs結(jié)構(gòu)且能量最高，擁有最好的抗病能力。CpG ODNs處理細(xì)胞對(duì)VSV增殖的抑制作用為CpG11> CpG6> CpG10> CpG8> CpG7> CpG9> CpG1。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)了CpG ODNs能夠促進(jìn)TLR9或TLR3、及其信號(hào)通路分子的轉(zhuǎn)錄，引發(fā)B細(xì)胞活化，通過(guò)改變細(xì)胞因子譜的表達(dá)調(diào)節(jié)Th細(xì)胞的反應(yīng)類型，可以促進(jìn)APC的抗原遞呈能力。因此可通過(guò)選擇不同型CpG ODNs作為佐劑，根據(jù)疫苗免疫應(yīng)答特點(diǎn)，以強(qiáng)化體液免疫或局部黏膜免疫；特定型CpG ODNs也可作為潛在干擾素誘生劑，用于PEDV或VSV感染的防控。

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