基于GSS高通量測(cè)序技術(shù)的懷山藥根、莖中內(nèi)生真菌群落多樣性分析

劉 元，李守婷，申進(jìn)文，文春南，文 晴，阮 元，麻兵繼*

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué) a中藥材系，b生物系，河南 鄭州 450002)

懷山藥(DioscoreaoppositaThunb)為“四大懷藥”之一，是河南著名的道地藥材，具有健脾益胃、生津益肺、補(bǔ)腎澀精等功效[1]。目前，對(duì)懷山藥的研究多集中在栽培技術(shù)、化學(xué)成分和藥理研究等方面[2-3]，而關(guān)于懷山藥與其內(nèi)生真菌的關(guān)系方面的研究則較少。本課題組前期對(duì)懷山藥道地產(chǎn)區(qū)——河南焦作溫縣一帶的懷山藥根中內(nèi)生真菌進(jìn)行了初步分離純化研究，并對(duì)其中一株內(nèi)生真菌厚孢鐮刀菌進(jìn)行了化學(xué)成分的研究，結(jié)果表明懷山藥內(nèi)生真菌能產(chǎn)生豐富的次生代謝產(chǎn)物[4]。雖然中藥材內(nèi)生菌和藥材質(zhì)量之間存在密切聯(lián)系，相關(guān)研究文獻(xiàn)也較多[5-6]，但有關(guān)懷山藥內(nèi)生真菌與藥材品質(zhì)之間的關(guān)聯(lián)性目前尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。因此，在整體水平上對(duì)懷山藥植株內(nèi)生真菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，有利于進(jìn)一步闡明內(nèi)生真菌與懷山藥道地性的關(guān)聯(lián)，從而為更好地開(kāi)發(fā)利用懷山藥優(yōu)良品質(zhì)奠定基礎(chǔ)。另外，傳統(tǒng)的真菌分類(lèi)鑒定主要依照真菌的形態(tài)、生長(zhǎng)以及生理生化等特征進(jìn)行研究。然而真菌的種類(lèi)繁多，個(gè)體差異性不明顯，且其生長(zhǎng)、生理生化特征也會(huì)隨著環(huán)境的變化而發(fā)生改變。因此，采用傳統(tǒng)方法對(duì)中藥材內(nèi)生真菌進(jìn)行正確的分離純化、分類(lèi)鑒定均存在較大的困難。近年來(lái)隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，核酸序列分析已被廣泛的應(yīng)用于真菌分類(lèi)鑒定中，目前常用的分子標(biāo)記為內(nèi)轉(zhuǎn)錄間區(qū)(internal transcribed spacer，ITS)，可根據(jù)ITS序列將真菌歸類(lèi)到種或亞種水平[7]。

高通量測(cè)序技術(shù)(high throughput sequencing，HTS)具有高通量、高靈敏度、高準(zhǔn)確性和低運(yùn)行成本的特點(diǎn)，該測(cè)序技術(shù)已被應(yīng)用于多種生態(tài)系統(tǒng)的微生物多樣性研究[8]。高通量測(cè)序可以深入、細(xì)致地研究微生物群落結(jié)構(gòu)，從而克服由于傳統(tǒng)菌株分離培養(yǎng)的限制而導(dǎo)致很難獲得宿主植物完整內(nèi)生真菌譜的技術(shù)障礙，近年來(lái)已應(yīng)用于多個(gè)中藥材道地性的研究[9-10]。GSS高通量測(cè)序(green shield sequencing，GSS)是基于目前最常用的Illumina高通量測(cè)序技術(shù)上最新改進(jìn)的一種測(cè)序技術(shù)，采用了液滴PCR技術(shù)。與普通的Illumina高通量測(cè)序技術(shù)相比，GSS高通量測(cè)序可以從源頭上消除宿主植物樣本中葉綠體和線粒體序列帶來(lái)的干擾，還原樣本中微生物群體的真實(shí)比例。本次測(cè)序合作單位北京艾普希隆生物科技有限公司的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，運(yùn)用該方法所測(cè)定的真菌測(cè)序量占樣本總測(cè)序量的比例最高可升至 99.7%(水稻葉片)，這為建立完整、可靠、穩(wěn)定和準(zhǔn)確的懷山藥道地藥材內(nèi)生真菌標(biāo)準(zhǔn)的譜圖庫(kù)提供了技術(shù)保障。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

2016年10月于河南焦作溫縣懷山藥道地產(chǎn)區(qū)采集10株無(wú)明顯病害的懷山藥，分別隨機(jī)取根部和莖部，均勻混合后放入無(wú)菌樣品袋中，低溫保鮮，于24 h內(nèi)進(jìn)行表面消毒處理。

1.2 表面滅菌

將懷山藥根、莖用無(wú)菌水沖洗干凈，再用75%乙醇浸泡1～2 min，3%次氯酸鈉浸泡2～3 min，75%乙醇清洗30 s，最后用無(wú)菌水沖洗5次，用無(wú)菌濾紙吸干表面水分。表面消毒效果檢驗(yàn)參照文獻(xiàn)[11]中的方法。

1.3 樣本DNA提取與純化

使用環(huán)境樣本DNA提取試劑盒進(jìn)行基因組DNA提取后，使用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的純度和濃度。

1.4 ITS區(qū)的PCR擴(kuò)增

以稀釋后的基因組DNA為模板，使用帶有Barcode的特異引物ITS3(5′-GATGAAGAACGYAGYRAA-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)對(duì)樣本的ITS區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增，每個(gè)樣本進(jìn)行3次重復(fù)，每個(gè)PCR反應(yīng)終止于線性擴(kuò)增期，PCR結(jié)束后將同一樣本的PCR產(chǎn)物混合后用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，使用OMEGA膠回收試劑盒切膠回收PCR產(chǎn)物，TE緩沖液洗脫回收目標(biāo)DNA片段。送北京艾普希隆生物科技有限公司對(duì)真菌的ITS區(qū)進(jìn)行Paired-end測(cè)序，測(cè)序使用Illumina(MiSeq)平臺(tái)。

1.5 生物信息學(xué)分析

雙端測(cè)序得到的PE reads使用FLASH進(jìn)行拼接，同時(shí)對(duì)序列質(zhì)量進(jìn)行質(zhì)控，在去除低質(zhì)量堿基及接頭污染序列等操作過(guò)程結(jié)束后完成數(shù)據(jù)過(guò)濾，得到可供后續(xù)分析的高質(zhì)量目標(biāo)序列。在97%的相似性水平上使用UPARS算法進(jìn)行OTU的聚類(lèi)，統(tǒng)計(jì)樣品每個(gè)OTU中的豐度信息，OTU的豐度初步說(shuō)明了樣品的物種豐富程度。

1.6 多樣性分析

在群落生態(tài)學(xué)的研究中，物種多樣性包括Alpha多樣性(群落內(nèi))和Beta多樣性(群落間)。其中Alpha多樣性是指群落內(nèi)或棲息地內(nèi)的物種多樣性，通過(guò)樣本的Alpha多樣性分析可以反映微生物群落的豐度、均勻性及多樣性等信息。Alpha多樣性分析包括一系列生態(tài)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析指數(shù)，如計(jì)算香農(nóng)指數(shù)(Shannon index)、Chao1指數(shù)、Simpson指數(shù)、系統(tǒng)發(fā)育多樣性指數(shù)(phylogenetic diversity，PD)等進(jìn)行生物多樣性分析[11]。豐富度指數(shù)(Chao1)和Shannon、Simpson、PD的計(jì)算用Mothur1.30.1軟件完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 懷山藥根莖和莖中內(nèi)生真菌物種組成

物種組成分析反映樣品在不同分類(lèi)學(xué)水平上的內(nèi)生真菌群落結(jié)構(gòu)。圖1中A和B分別展示了懷山藥內(nèi)生真菌在門(mén)(phylum)水平和綱(class)水平的群落結(jié)構(gòu)和分類(lèi)比較結(jié)果。從門(mén)水平來(lái)看，懷山藥根和莖中內(nèi)生真菌主要分布在子囊菌門(mén)(Ascomycota)，僅有少量分布于擔(dān)子菌門(mén)(Basidiomycota)。從綱分類(lèi)水平來(lái)看，其內(nèi)生真菌主要分布在座囊菌綱(Dothideomycetes)、錘舌菌綱(Leotiomycetes)、糞殼菌綱(Sordariomycetes)中，少量分布在傘菌綱(Agaricomycetes)、散囊菌綱(Eurotiomycetes)中。懷山藥根和莖中真菌菌群分布有差異，其中莖中子囊菌門(mén)占真菌菌群的92.0%，而根中子囊菌門(mén)約占真菌菌群的97.4%。另外，盤(pán)菌綱(Pezizomycetes)真菌在莖中存在而根中沒(méi)有，而酵母菌(Saccharomycetes)為根中特有菌。

選取豐度最高的50個(gè)操作單元(OTUs)與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中基因序列進(jìn)行Blast比對(duì)，相似物種(相似度在97%以上)及GenBank登錄號(hào)如圖2所示。進(jìn)化樹(shù)將豐度最高的50個(gè)OTUs進(jìn)行展示，其中Hannaellasp.(KY305135)為懷山藥根中特有，豐度值為102；Hannaellasp.(KT962991)、Acremoniumsp.(KY988552)、Aspergillussp.(KY407901)為懷山藥莖中特有，其豐度值分別為65、89和56；Rhodosporidiumsp.(KF690377)、Ceratobasidiumsp.(KX953590)、Ochroconisconstricta(KX610329)、Fusariumsp.(KY950388)、Botryotiniafuckeliana(KX096661)、Passalorasp.(JX507956)為根和莖共有，但根中豐度值明顯高于莖；Hannaellasp.(KX758406)、Hannaellasp.(KX758405)、Derxomycessp.(KY588901)、Bulleraunica(KY101799)、Rhodotorulasp.(KY033113)和Glomerellacingulata(AB696727)為根和莖共有，但莖中豐度值明顯高于根。

圖1 懷山藥根、莖樣品中內(nèi)生真菌群落分布

圖2 種水平內(nèi)生真菌的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

2.2 懷山藥根和莖中內(nèi)生真菌生物多樣性

2.2.1 單個(gè)樣品復(fù)雜性

根和莖的Alpha多樣性分析的Shannon指數(shù)、Chao 1指數(shù)、PD和物種數(shù)4個(gè)指數(shù)見(jiàn)圖3所示。豐富度以Chao 1表示，多樣性以Shannon 指數(shù)表示，檢測(cè)到的物種的數(shù)量以O(shè)bserved表示，系統(tǒng)發(fā)育譜系多樣性以PD表示，結(jié)果均為莖大于根。綜合各項(xiàng)指標(biāo)顯示，懷山藥根中的物種豐富度和多樣性等均略低于莖。

圖3 樣品的Alpha 多樣性

2.2.2 稀釋曲線

稀釋曲線表明每個(gè)樣品物種的豐富度，用來(lái)反映測(cè)序情況。分別使用觀測(cè)到的物種數(shù)(Observed)、Chao 1及Shannon指數(shù)進(jìn)行稀釋曲線的制作。如圖4所示,對(duì)不同的樣本分別進(jìn)行分析，顏色代表不同樣本，橫坐標(biāo)代表重抽樣抽出的序列數(shù)，縱坐標(biāo)代表不同的多樣性值。從稀釋曲線來(lái)看，隨著測(cè)序數(shù)量的增加，稀釋曲線斜率逐漸降低，趨向平緩但未進(jìn)入平臺(tái)期，說(shuō)明測(cè)序數(shù)據(jù)合理，基本覆蓋樣品中所有種群，即使再增加測(cè)序數(shù)量也只會(huì)產(chǎn)生少量新的OTUs。

圖4 懷山藥根、莖樣品的稀釋曲線

2.2.3 Rank abundance 曲線

Rank abundance曲線可以解釋多樣性的兩個(gè)方面，即物種豐度和物種均勻度。在水平方向，物種的豐度由曲線的寬度來(lái)反映，物種的豐度越高，曲線在橫軸上的范圍越大；曲線的形狀(平滑程度)反映了樣本中的物種的均度，曲線越平緩，物種分布越均勻。由圖5可知，樣品曲線斜率較大，表明懷山藥根和莖中均有優(yōu)勢(shì)菌，這也與圖1中的分析結(jié)果一致。從水平方向，兩個(gè)樣品在橫軸上跨度即分類(lèi)豐富度基本相當(dāng)。

圖5 懷山藥根、莖樣品的Rank abundance曲線

熱度圖(Heatmap)用于表示一個(gè)或多個(gè)組的樣品在某一分類(lèi)水平上的群落組成和豐度。豐度用顏色深淺來(lái)表征，方塊顏色越偏紅，說(shuō)明該種的豐度越高，越偏藍(lán)色說(shuō)明豐度越低?？筛鶕?jù)豐度和組成進(jìn)行聚類(lèi)，也可按照特定的順序進(jìn)行橫縱坐標(biāo)的排列。由圖6可知，在種水平上，懷山藥根中豐度最高的為擔(dān)子菌門(mén)葡萄孢盤(pán)菌屬灰色霉菌(Botryotiniafuckeliana)，莖中豐度最高的為鏈格孢屬一個(gè)未知種的(Alternariasp.)。

圖6 種水平高豐度類(lèi)群熱度

2.2.4 Venn圖

在OTU分析中，Venn用于表示多個(gè)組樣品的OTU共有和獨(dú)有物種情況。由圖7可知，根中特有的OTU為35個(gè)，莖中特有的OTU為75個(gè)，根和莖共有的OTU為233個(gè)。Venn圖在一定程度上反映出兩個(gè)樣品中內(nèi)生真菌群落組成的相似程度，表明根和莖中相同的種類(lèi)占多數(shù)，且懷山藥莖中內(nèi)生真菌物種多樣性程度略高于根。

圖7 懷山藥根、莖樣品OTUs分布

3 討論

本研究首次將基于當(dāng)前Illumina MiSeq測(cè)序平臺(tái)的最新改進(jìn)技術(shù)GSS高通量測(cè)序技術(shù)應(yīng)用于懷山藥內(nèi)生真菌種群結(jié)構(gòu)多樣性研究，從基因組的水平上來(lái)解析微生物群落結(jié)構(gòu)，突破了很多厭氧內(nèi)生真菌不能被分離培養(yǎng)的技術(shù)瓶頸[12]，既克服了傳統(tǒng)分子生物學(xué)方法存在的通量低的缺陷，又從源頭上消除植物樣本中葉綠體和線粒體序列帶來(lái)的干擾，還原了懷山藥根和莖中內(nèi)生真菌群體的真實(shí)比例。

本研究結(jié)果表明，懷山藥根和莖樣品中內(nèi)生真菌物種組成豐富，但二者在種群結(jié)構(gòu)上有一定的差異。懷山藥根和莖中內(nèi)生真菌在門(mén)水平上均主要為子囊菌門(mén)Ascomycota(根97.3%，莖92%)，少量分布在擔(dān)子菌門(mén)Basidiomycota(根2.6%，莖7.7%)；這與王曉龍[13]采用傳統(tǒng)分離培養(yǎng)方法研究的結(jié)果一致。在綱的水平上，主要分布有座囊菌綱Dothideomycetes(根34.1%，莖65.5%)，錘舌菌綱Leotiomycetes(根35.9%，莖8.1%)，糞殼菌綱Sordariomycetes(根22.2%，莖13.3%)；在目的水平上，主要分布于格孢腔菌目Pleosporales(根24.2%，莖60.2%)，蠟釘菌目Helotiales(根34.9%，莖7.6%)，糞殼菌目Sordariales(根20.1%，莖3.4%)；在屬的水平上，主要分布于鏈格孢屬Alternaria(根17.1%，莖33.2%)，葡萄孢盤(pán)菌屬Botryotinia(根34.1%，莖6.3%)，毛球殼屬Lasiosphaeriaceae(根20.0%，莖0.3%)；另外，GSS高通量測(cè)序結(jié)果還獲得了一部分的弱勢(shì)菌群，但由于弱勢(shì)菌群在整個(gè)物種組成中所占比例甚小，本論文未對(duì)其進(jìn)行一一列舉。

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