(U)HPLC及LC/MS技術在棗果功能性成分分離分析中的應用

田 晶 ，李存滿 ，李巧玲

（1.河北科技大學，河北省分析測試研究中心，河北石家莊 050018；2.河北科技大學生物科學與工程學院，河北石家莊 050018）

棗（Ziziphus jujubaMill.）為鼠李科棗屬的藥食同源植物，在我國具有悠久的種植歷史，主產于河北、河南、山東、陜西等諸多地區(qū)[1]?！侗静菥V目》記載：棗味甘、性溫，能補中益氣、養(yǎng)血生津。棗中含有豐富的營養(yǎng)成分，不僅含有糖類，還含有三萜酸類、環(huán)核苷酸類、黃酮類、脂肪酸類、蛋白質、氨基酸類、維生素類等多種化學成分[2]，具有抗癌、降血壓、降低膽固醇、保肝護肝、預防骨質疏松、預防心血管疾病、預防膽結石等多種功能[3]。

（超）高效液相色譜 [Ultra high performance liquid chromatography，(U)HPLC]及液質聯用（Liquid chromatography/mass spectrumLC/MS）技術在復雜體系如食品、中藥材等的分離分析中應用越來越廣泛，尤其是LC/MS技術，將色譜技術的高分離能力與質譜技術的高靈敏和結構解析能力有機結合起來，其強大的定性定量能力在復雜體系中的應用越來越受到關注。

目前，對于棗的物質基礎的研究還很欠缺，從棗的復雜體系中提取并分離分析其功效成分引起更多科研人員的關注。(U)HPLC及LC/MS技術在棗復雜體系的分離分析過程中起著重要的作用，本文主要對該技術在分離分析棗的功效成分研究方面的應用進行簡要的綜述。

1 應用(U)HPLC及LC/MS技術來提取棗果中的三萜酸類

棗果中含有豐富的三萜酸類化合物，其中研究最多的是齊墩果酸、熊果酸和白樺脂酸。研究表明，齊墩果酸不僅對肝臟具有保護作用，而且具有抑制艾滋病病毒的作用[4,5]。熊果酸對惡性腫瘤細胞具有抑制作用，能抵抗誘癌、致癌物，并且具有較高的安全性[6]。白樺脂酸對腦瘤、神經外胚層瘤、白血病等惡性腫瘤細胞有抑制作用[7]。

目前，提取三萜酸類化合物的主要方法有熱回流、冷浸、超聲[8-10]等。也有些研究采用甲醇或乙醇等有機試劑通過超聲的方法來提取三萜酸[10-13]，提取過程中可以通過70～80℃加熱的方式，也可以加入纖維素酶來提高提取率[14]，然后用大孔樹脂方法進行分離[15]，該法是一種比較簡便、有效富集三萜酸的方法。

分析棗中三萜酸的方法多采取HPLC法。對新疆若羌灰棗不同等級樣品中齊墩果酸、熊果酸和白樺脂酸的含量進行分析，發(fā)現其含量與品質之間不存在明顯相關性。由于三萜酸呈弱酸性，通過HPLC法測定齊墩果酸、熊果酸和白樺脂酸時，可用磷酸鹽體系、磷酸、冰醋酸調整流動相的酸堿性，選擇甲醇-水體系，梯度洗脫方式[10]，但該方法受流動相影響較大，檢測靈敏度相對較低。三萜酸類物質紫外吸收極弱，可以利用蒸發(fā)光散射檢測器（ELSD）對其進行定量測定，得出的峰形對稱，雜峰較少，且靈敏度高；但ELSD也有其缺點，容易因氣體體積流量過低導致尖峰信號或噪音信號[11]。不同的色譜柱，對物質分離能力有一定的差別，苗利軍等[12]用4種色譜柱分離棗中三萜酸，比較得出C18型色譜柱優(yōu)于CN型，反相色譜優(yōu)于正相色譜，250mm長的BDS C18色譜柱優(yōu)于200mm長BDSC18色譜柱，即采用較長色譜柱有利于提高三萜類物質分離效果。

HPLC法進行含量測定存在基線不理想、僅僅通過保留時間來確定待測成分可能造成誤判的風險等問題；而利用LC/MS分析技術，不受基線的影響，可以很好地排除其他物質干擾，大大提高對棗等復雜體系中待測成分的定性定量分析能力[13]。Guo等人[16]通過UHPLC-MS/MS法更加精確地定性分析出棗中含有多種三萜酸以及在不同時期三萜酸的含量不同，發(fā)現三萜酸作為棗的質量指標，在9月份收獲最為合適。關于近幾年 (U)HPLC及LC/MS技術分離棗中三萜類物質應用見表1（見下頁）。

2 應用(U)HPLC及LC/MS技術提取棗果中的環(huán)核苷酸類

環(huán)核苷酸及其衍生物有10多種，其中有重要生物活性的主要為環(huán)磷酸腺苷（cAMP）和環(huán)磷酸鳥苷（cGMP）。劉世軍報道，棗果中的cAMP和cGMP含量是所有已測動植物材料中最高的，鮮重分別為100～500nmol/g和30～40nmol/g[1]。cAMP和cGMP已被公認為兩種具有反向調節(jié)作用的第二信使物質，共同參與多種生理生化過程的調節(jié)，并可用于基因轉錄，影響蛋白質合成，棗中cAMP是棗果中最重要的生物活性物質，不僅能調節(jié)細胞內的物質代謝，還能降血糖、抑制癌細胞生長等顯著作用[17,18]。簡便快速地對棗中天然cAMP和cGMP的提取及檢測對進一步開發(fā)棗產品、推動醫(yī)療保健發(fā)展具有重要意義[19]。

目前多采用冷浸超聲、熱回流、索氏提取、有機溶劑提取等方法來提取環(huán)核苷酸類物質[20]，其中大多以水為提取溶劑[21,22]，這樣較有機溶劑提取更具安全和環(huán)保性能。分離方法采用最多的是大孔吸咐樹脂法，不同型號的大孔樹脂其作用的機理不同，可以除去多種雜質，達到分離純化的目的[18,23]。

傳統(tǒng)檢測環(huán)核苷酸方法有紙層析色譜、薄層色譜法、競爭蛋白法以及酶聯免疫法等，這些方法存在檢測時間長、靈敏度不高、重復性差、人為實驗操作誤差大等問題，而HPLC法較之更具有靈敏度高、準確度高及精確度好的特點。用HPLC法測定壺瓶棗中的cAMP含量高于大龍棗中cAMP的含量[24]，蔣勵博[25]采用UPLC法測得了棗中cAMP實際提取量，與理論值相差不大。除了用常見的反相色譜法測定不同棗品種中cAMP的含量外[21]，還可以采用親水作用液相色譜（HILIC）法測定棗中環(huán)核苷酸含量，HILIC具有良好的精密度、重現性和穩(wěn)定性[26]。

表1 （U）HPLC及LC/MS技術分離分析棗中三萜類物質應用Table 1 The application of(U)HPLC and LC/MS technology in separation of three terpenoids in jujube

表2 （U）HPLC及LC/MS技術分離分析棗中核苷類物質應用Table 2 The application of(U)HPLC and LC/MS technology in separation of nucleosides in jujube

關于近幾年 (U)HPLC及LC/MS技術分離棗中環(huán)核苷酸應用見表2。LC/MS技術用來分析棗果中的復雜成分是十分有利的，趙恒強等[22]建立了親水作用液相色譜-電噴霧離子源-四極桿飛行時間質譜（HILIC-ESI-QTOF/MS）定性、定量分析棗中cAMP的方法，該方法具有很好的分離度、靈敏度，可以實現不同棗中cAMP的準確、快速定性和定量測定。Q-TOF-MS高分辨質譜可以推斷出cAMP的分子式，對于化合物的結構解析是非常有利的。

3 應用(U)HPLC及LC/MS技術提取棗果中的黃酮類

黃酮類化合物是棗的主要化學成分之一，棗中總黃酮對油脂具有抗氧化作用，并且能清除羥自由基[27]；同時，黃酮類化合物對血管有舒張作用，拮抗血小板活化因子[1]。隨著人們對黃酮類化合物的深入研究，學者們還發(fā)現其具有抗炎、抗病毒、鎮(zhèn)靜鎮(zhèn)痛以及調節(jié)免疫、抗腫瘤等重要作用[28]。

目前，大棗中黃酮提取方法有超聲提取法、回流提取法等[29，30]，還可以通過加入乙酸乙酯進行冰浴均質后再提取[31]，考慮到綠色環(huán)保、安全技術方面，可以用環(huán)糊精作為提取劑提取黃酮類化合物[32]，分離黃酮類多用雙向紙層析、薄層層析及柱層析，還可運用QuEChERS法達到快速分離純化的目的[33]。

國內外對黃酮化合物的提取分離研究很多，但對棗中黃酮的提取分離研究較少[34]。Zhao等[35]通過HPLC法同時測定了7種棗中根皮苷、兒茶素、沒食子酸、綠原酸和咖啡酸，并測得這些酚類物質的含量與抗氧化能力呈正相關。李喜悅[36]利用HPLC法同時檢測出14種不同棗葉中槲皮素-3-O-洋槐糖苷、蘆丁、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷、山奈酚-3-O-蕓香糖苷、槲皮素-3-O-α-L-阿拉伯糖-(1→2)-α-L-鼠李糖苷5種黃酮的含量。

袁亞娜[37]將不同時間出峰的液相餾分收集起來再分別進行質譜分析，推測出棗中存在雙黃酮類化合物。師仁麗等[29]采用二極管陣列檢測器(DAD)-HPLC和LC/MS技術對金絲小棗中黃酮類物質進行分析和鑒別，并測得金絲小棗中含有楊梅素、蘆丁、槲皮素、異鼠李素4種黃酮類物質。LC/MS技術在黃酮類分析中的應用較棗中其它物質應用更為廣泛。關于近幾年(U)HPLC及LC/MS技術分離棗中黃酮類物質應用見表3。

4 應用(U)HPLC及LC/MS技術提取棗果中的糖類

棗多糖是棗中重要的生物活性物質，鮮棗的總糖含量大約為30%～40%，水溶性糖以D-葡萄糖為主。阿拉伯糖、核糖、甘露糖、半乳糖、鼠李糖和葡萄糖等共同組成大棗中的低聚糖[1]。多糖類被證明具有免疫調節(jié)、抗氧化、抗衰老、補血養(yǎng)血、抗腫瘤作用等功能，且其對進入細胞內病毒的繁殖也有一定的抑制作用[38，39]。

表3 (U)HPLC及LC/MS技術分離分析棗中黃酮類物質應用Table 3 The application of(U)HPLC and LC/MS technology in separation of flavonoids from jujube

多糖種類繁多，其提取方法也很多，如水提法、超聲法以及微波法[40-42]等。超聲波輔助提取法能夠縮短提取時間及提取溫度[39]，水提法可以得粗多糖，多糖中無機鹽主要采用層析法去除，活性炭、樹脂進行脫色，凝膠色譜柱進一步分離純化[43]。方法提取率不高，粗提物純度較低，成分復雜。目前國內外測定多糖中單糖組分的色譜分離方法主要有氣相色譜法（GC）、HPLC法和薄層色譜法（TLC）等[40]，由于GC法[44]對食品中糖的測定需要衍生化反應且操作復雜，誤差較大。而HPLC法[45]采用示差折光檢測器不需要衍生化，操作簡便，所以近年來得到了快速發(fā)展。據報道，可以同時采用GC/MS和HPLC來實現大棗功能性糖分的單糖組成及平均分子質量測定[40]。也可以用HPLC配備紫外檢測器（UV）法測定糖類，但需要衍生化。王向紅等人[46]利用柱前衍生HPLC-UV法檢測出不同品種棗的水溶性多糖是由葡萄糖、鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、半乳糖醛酸、甘露糖6種單糖組成的，且單糖組成比例存在很大差異[46]。不同產地鮮棗中糖的組分和含量不同，研究發(fā)現鮮棗中單糖的組成主要為蔗糖，并且糖分含量表現為蔗糖＞果糖＞葡糖糖＞麥芽糖，由此可知產地對糖分含量有一定影響[45]，此研究與之前的研究[47]相比，前處理階段未用到固相萃取柱。目前，尚未見LC/MS技術在棗糖類分析檢測中的報道。關于近幾年HPLC技術分析棗中糖類物質應用見表4。

表4 HPLC技術分離分析棗中糖類物質應用Table 4 The application of HPLC technology in the separation of saccharides in jujube

5 其它物質的提取

棗中的有機酸不僅起到調解風味作用，還增加了其營養(yǎng)的功效[48]。提取有機酸的方法可以用水提取或者甲醇提取。HPLC法[49]測得棗果中6種有機酸含量由高到低依次為：蘋果酸＞檸檬酸＞酒石酸＞奎寧酸＞草酸＞富馬酸，本方法較固相萃取、毛細管電泳等傳統(tǒng)的有機酸測定方法靈敏度高，較GC/MS法方便快捷[50]。Bekir San等[51]利用HPLC法測得棗中含有兒茶素、咖啡酸、表兒茶酸、阿魏酸、蘆丁、對羥基苯甲酸和綠原酸，其中酚類物質主要是兒茶素（含量為2.46～3.74mg/100g）和蘆?。ê渴?.88～3.60mg/100g），同時利用GC/MS法檢測出油酸、亞油酸、棕櫚酸、棕櫚油酸，得出棕櫚酸是主要的飽和脂肪酸，不飽和脂肪酸含量為棗果總脂肪的68.54%～72.44%。棗在不同浸泡溫度條件下糖精鈉的含量不同[52]，該檢測對食品安全具有重要實際意義。

6 結論

(U)HPLC、LC/MS技術在棗等復雜體系的分離分析中的應用很普遍，并且隨著新型的分離材料及功能材料的不斷推出、(U)HPLC及LC/MS技術的不斷提升，其應用會越來越廣泛。棗中含有豐富的多糖、酚類、環(huán)核苷酸等營養(yǎng)物質被越來越多的發(fā)現，為進一步開發(fā)利用棗新產品奠定了基礎。

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