應(yīng)用DGGE技術(shù)研究玉米儲(chǔ)藏過(guò)程中的霉菌群落時(shí)空分布特征

岳曉禹，張 華，陳威風(fēng)，鄒 建，李 欣，楊 娜

（河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院食品工程學(xué)院，河南 鄭州 450046）

玉米是我國(guó)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的主要糧食作物和儲(chǔ)糧品種之一。玉米在儲(chǔ)藏過(guò)程中容易發(fā)生霉菌污染，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。霉菌污染不僅會(huì)導(dǎo)致儲(chǔ)糧的顏色、味道、營(yíng)養(yǎng)成分發(fā)生改變，食用價(jià)值降低，更會(huì)產(chǎn)生黃曲霉毒素、赭曲霉毒素、伏馬毒素等多種真菌毒素，對(duì)食用者造成急性或者慢性的毒性危害，導(dǎo)致肝炎、肝癌等嚴(yán)重危害人體健康的疾病[1-2]。研究?jī)?chǔ)糧中霉菌污染的發(fā)生規(guī)律，從而減少儲(chǔ)糧霉菌污染，是提高我國(guó)糧食安全和食品安全的重要研究領(lǐng)域。

由于真菌毒素危害的嚴(yán)重性，多數(shù)研究者將關(guān)注點(diǎn)放在真菌毒素上，如對(duì)糧食中真菌毒素的污染現(xiàn)狀及分布規(guī)律進(jìn)行調(diào)查分析[3]、真菌毒素檢測(cè)方法的建立[4-5]、真菌毒素脫毒方法的開(kāi)發(fā)[6-7]等，而忽視了對(duì)霉菌群落本身的研究。霉菌與真菌毒素并非一一對(duì)應(yīng)，一種霉菌可以產(chǎn)生多種毒素，而一種毒素也可能由多種霉菌產(chǎn)生，因此，并不能從儲(chǔ)糧中毒素的分布來(lái)推測(cè)儲(chǔ)糧中霉菌的種類(lèi)。真菌毒素是霉菌的次級(jí)代謝產(chǎn)物，霉菌是真菌毒素的源頭，研究糧食儲(chǔ)存條件與霉菌群落之間的關(guān)系，根據(jù)實(shí)測(cè)數(shù)據(jù)建立儲(chǔ)糧霉菌污染預(yù)測(cè)模型[8]，從而采取相應(yīng)措施減少霉菌污染，可以從根源上降低糧食中真菌毒素的含量。

目前我國(guó)關(guān)于糧食儲(chǔ)存條件與霉菌群落組成之間的研究多數(shù)采用培養(yǎng)法進(jìn)行，如鐘雪美等[9]利用平板培養(yǎng)法研究了不同儲(chǔ)糧方式的霉菌動(dòng)態(tài)變化和空間格局變化；李聽(tīng)聽(tīng)等[10]通過(guò)培養(yǎng)分離鑒定法研究了玉米初始水分及相對(duì)濕度對(duì)儲(chǔ)糧中霉菌群落的影響；吳紅萍等[11]采用稀釋涂布平板法和Biolog鑒定系統(tǒng)結(jié)合分析了海南省各市縣儲(chǔ)糧谷物霉菌菌相分布。在研究霉菌群落特征時(shí)，雖然培養(yǎng)法有利于霉菌菌種的鑒定，但也存在靈敏度低、誤差大等缺點(diǎn)[12]。

在微生物群落研究中，分子生物學(xué)技術(shù)如變性梯度凝膠電泳（denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）等具有的巨大優(yōu)勢(shì)。DGGE技術(shù)的原理為序列不同的DNA分子在變性劑梯度變化的凝膠中因解鏈程度不同而獲得不同的電泳遷移速率，因此可以通過(guò)DGGE將長(zhǎng)度相同但序列不同的DNA進(jìn)行分離[13]。利用通用引物擴(kuò)增微生物特定DNA片段，再通過(guò)DGGE技術(shù)將其分離，即可獲得樣品中微生物群落的指紋圖譜。DGGE技術(shù)已廣泛應(yīng)用于食品儲(chǔ)藏中細(xì)菌群落的變化，如鯽魚(yú)儲(chǔ)藏過(guò)程中[14]、真空包裝冷卻鹿肉儲(chǔ)藏過(guò)程中[15]、及生鮮南美白對(duì)蝦儲(chǔ)藏過(guò)程中細(xì)菌群落的變化[16]等，但在糧食霉菌群落研究中，分子生物學(xué)技術(shù)應(yīng)用較少，僅有李聽(tīng)聽(tīng)等[17]利用DGGE技術(shù)研究了水分和環(huán)境濕度條件與糧食霉菌群落的相關(guān)性。為了研究玉米儲(chǔ)藏過(guò)程中霉菌群落的發(fā)生規(guī)律，建立儲(chǔ)糧霉菌污染預(yù)測(cè)模型積累理論和數(shù)據(jù)，本研究采用DGGE技術(shù)，對(duì)玉米在糧庫(kù)儲(chǔ)藏過(guò)程中霉菌群落進(jìn)行研究，探討儲(chǔ)糧霉菌群落的時(shí)間和空間變化規(guī)律。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

從河南的儲(chǔ)藏糧庫(kù)中采集儲(chǔ)藏玉米，玉米品種主要為鄭單958、浚單20、先玉335、偉科702。

為研究?jī)?chǔ)糧中霉菌群落的時(shí)間規(guī)律，分別采集了儲(chǔ)藏1a 2 個(gè)月、儲(chǔ)藏2a 2 個(gè)月、儲(chǔ)藏3a 2 個(gè)月的不同儲(chǔ)藏年限的玉米。為研究?jī)?chǔ)糧中霉菌群落在糧庫(kù)中的空間規(guī)律，采集了糧倉(cāng)內(nèi)儲(chǔ)藏玉米樣品。同一個(gè)糧倉(cāng)設(shè)中心、4 個(gè)角5 個(gè)點(diǎn)，每個(gè)點(diǎn)的樣品包含玉米糧堆的上中下層玉米，上層在糧面的10～20 cm處，中層在糧堆中間，下層在距底部20 cm處，仟樣是先上后下逐層仟樣，各點(diǎn)仟樣數(shù)量一致。把采集到的玉米樣品標(biāo)記清楚后，放置－80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺 美國(guó)Amresco公司。

1.2 儀器與設(shè)備

KQ-250B超聲波振蕩器 中國(guó)上海早盈公司；H1850R低溫高速離心機(jī) 湘儀離心機(jī)儀器有限公司；2720聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增儀 美國(guó)Biometra公司；DCodeTMUniversal Mutation Detection System DGGE儀、Gel Doc XR＋凝膠成像分析系統(tǒng) 美國(guó)Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 玉米表面霉菌基因組DNA提取

采用改良的十六烷基三甲基溴化銨（cetyltrimethyl ammonium bromide，CTAB）法提取玉米表面真菌[18-20]，稱(chēng)取25 g玉米置于高壓滅菌過(guò)的錐形瓶中，加入40 mL滅菌磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS），然后將裝有樣品的錐形瓶放入超聲波振蕩器中振蕩1 h，將液體取出。其中20 mL放入離心管，4 ℃、2 000 r/min離心5 min。取上清液于新的離心管中，4 ℃、10 000 r/min離心10 min以沉淀菌體。加入65 ℃預(yù)熱30 min的2% CTAB溶液2 mL，充分混勻，置65 ℃水浴1 h，期間適當(dāng)搖勻，期間每隔5～10 min混勻一次，取出后，放至室溫。之后按照酚-氯仿-異戊醇方法操作進(jìn)行[17]。

1.3.2 真菌18S rRNA部分片段的擴(kuò)增

利用DNAman軟件分析并選用Ns7F和Ns8R引物對(duì)擴(kuò)增真菌18S rRNA部分序列，帶有GC夾的Ns7F：CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGGCCCGCCGCC CCCGCCCCATAACAGGTCTGTGATGC和Ns8R：GCAGGTTCACCTACGGA[21]，PCR產(chǎn)物的大小為353 bp。50 μL反應(yīng)體系為：2×Pfu Master Mix 25 μL；上游引物GCNs7F 1 μL；下游引物Ns8R 1 μL；模板DNA 1 μL；Mg2＋0.2 μL；ddH2O 21.8 μL。真菌18S rRNA-PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5min； 94 ℃變性1 min，52 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。

1.3.3 擴(kuò)增產(chǎn)物的DGGE和測(cè)序

DGGE使用8%的聚丙烯酰胺凝膠，18S rRNA的變性劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)適合的范圍為30%～60% （100%的變性劑中每100 mL中含有42 g尿素）。電泳運(yùn)行條件：1×TAE電泳緩沖液，85 V電壓，60 ℃恒溫、恒壓電泳12 h。電泳結(jié)束后用溴化乙錠染色法對(duì)凝膠進(jìn)行染色0.5 h。將染色后的凝膠用凝膠成像分析系統(tǒng)拍照，獲得DGGE圖譜。將DGGE圖譜上的主要條帶分別進(jìn)行切膠回收，每份回收產(chǎn)物使用不帶GC夾子的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行Sanger測(cè)序。將測(cè)序所得的序列，與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST相似性比對(duì)，以相似度最高的比對(duì)結(jié)果作為該電泳條帶的物種注釋。

1.3.4 霉菌群落多樣性分析及統(tǒng)計(jì)分析

為分析儲(chǔ)藏玉米中霉菌群落的分布規(guī)律，本研究對(duì)不同年份的樣品和糧庫(kù)中不同空間分布的樣品中霉菌群落的多樣性進(jìn)行比較分析。凝膠成像系統(tǒng)獲得的DGGE圖譜利用Quantity One v4.6.9軟件進(jìn)行圖譜整體背景去除、泳道背景去除、條帶亮度分析，計(jì)算每個(gè)樣品中各個(gè)條帶亮度的相對(duì)值。將該數(shù)據(jù)導(dǎo)入PAST軟件（v3.15）[22]，利用PAST軟件的multivariate/non-metric-MDS對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行非度量多維尺度（nonmetric multidimensional scaling，NMDS）作圖分析，距離參數(shù)選擇Bray-Curtis dissimilarity；利用PAST軟件的multivariate/one-way-ANOSIM對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行ANOSIM分析，計(jì)算各組之間霉菌群落整體差異的顯著性，距離參數(shù)選擇Bray-Curtis dissimilarity；利用PAST軟件的multivariate/Clustering/Neighbourjoining對(duì)各樣品的霉菌群落進(jìn)行聚類(lèi)分析；將每個(gè)條帶的物種注釋和亮度相對(duì)值數(shù)據(jù)導(dǎo)入LEfSe在線(xiàn)分析工具（http://huttenhower.sph.harvard.edu/galaxy）[23]，分析不同類(lèi)型樣品中具有顯著差異的霉菌類(lèi)群。

2 結(jié)果與分析

2.1 DGGE圖譜分析

為了研究?jī)?chǔ)藏玉米中霉菌群落的多樣性及時(shí)空分布規(guī)律，本研究用GC-Ns7F和Ns8R對(duì)18S rRNA的部分序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行DGGE分析，結(jié)果如圖1所示。DGGE圖譜中條帶的亮度強(qiáng)弱表明相應(yīng)霉菌物種豐度的高低。從DGGE圖譜整體上看，不同儲(chǔ)藏年限的樣品中霉菌群落DGGE條帶圖譜具有比較明顯的差異，儲(chǔ)藏1 a的樣品（15A～15E）霉菌群落中高亮度條帶較多。而儲(chǔ)藏2 a的樣品（14A～14E）和儲(chǔ)藏3 a的樣品（13A～13E）霉菌群落中高亮度條帶逐漸較少。表明玉米儲(chǔ)藏過(guò)程中，優(yōu)勢(shì)菌群的多樣性逐漸減少，這可能是由于玉米儲(chǔ)藏過(guò)程中營(yíng)養(yǎng)成分的變化及霉菌間相互競(jìng)爭(zhēng)所導(dǎo)致的。而與儲(chǔ)藏年份相比，糧庫(kù)中不同空間位置樣品的條帶圖譜比較相似，這可能是由于取樣糧庫(kù)中不同空間的環(huán)境條件較為一致。

圖1 不同年份及糧庫(kù)不同空間位置的儲(chǔ)藏玉米中霉菌群落的DGGE圖譜Fig. 1 DGGE pattern of mold communities in stored corn for different years at different spatial locations in the depot

表1 DGGE圖譜中的主要條帶測(cè)序分析Table1 Sequencing of main DGGE bands

對(duì)DGGE圖譜中的主要條帶進(jìn)行切膠回收、PCR擴(kuò)增和Sanger測(cè)序，并通過(guò)BLAST與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，結(jié)果如表1所示?？梢钥闯鰞?chǔ)藏3 a和儲(chǔ)藏2 a的樣品中，亮度最高的條帶（DGGE圖譜中標(biāo)注為3和9）物種注釋為Zea mays，即來(lái)源于玉米的的基因組的擴(kuò)增產(chǎn)物。這可能是由于儲(chǔ)藏年限長(zhǎng)導(dǎo)致玉米細(xì)胞壁破損，致使霉菌基因組DNA提取結(jié)果中混有較多的玉米基因組DNA，由于不同DNA模板在PCR擴(kuò)增中的競(jìng)爭(zhēng)性，可能導(dǎo)致儲(chǔ)藏2 a的樣品和儲(chǔ)藏3 a的樣品的DGGE圖譜中其他霉菌條帶亮度較低。因此在后續(xù)多樣性分析中，將所有樣品注釋為Z. mays的條帶去除，重新計(jì)算其他條帶的相對(duì)豐度。從霉菌種類(lèi)上來(lái)看，此糧庫(kù)中霉菌污染以青霉為主，如產(chǎn)紫青霉菌Penicillium purpurogenum、微紫青霉菌P. janthinellum、草酸青霉菌P. oxalicum及一株未鑒定到種的青霉物種Penicillium sp.，此外還發(fā)現(xiàn)了總狀毛霉Mucor racemosus和假灰綠曲霉Aspergillus pseudoglaucus。此外還檢測(cè)到部分非霉菌的真菌物種，如Sakaguchia dacryoidea、Candida quercitrusa、Meyerozyma guilliermondii。

2.2 儲(chǔ)藏玉米中霉菌群落的時(shí)空分布規(guī)律分析

圖2 不同儲(chǔ)藏玉米樣品中霉菌群落DGGE圖譜的NMDS作圖分析Fig. 2 NMDS plot for DGGE patterns of molds communities from different stored corn samples

為了進(jìn)一步分析儲(chǔ)藏玉米中霉菌群落的時(shí)間和空間分布規(guī)律，本研究將DGGE圖譜中各真菌條帶的相對(duì)豐度值輸入PAST軟件進(jìn)行群落結(jié)構(gòu)分析。如圖2所示，NMDS可以在二維坐標(biāo)中顯示各個(gè)樣品霉菌群落結(jié)構(gòu)的相似性，圖上兩個(gè)樣品點(diǎn)之間的距離越近，表明兩個(gè)樣品的霉菌群落結(jié)構(gòu)越相似。從圖2可以看出，儲(chǔ)藏時(shí)間相同的樣品中霉菌群落的點(diǎn)距離相對(duì)較近，出現(xiàn)聚類(lèi)現(xiàn)象，而糧庫(kù)中相同方位的樣品的霉菌群落未出現(xiàn)聚類(lèi)。該NMDS圖譜的Stress值為0.137 2，表明該NMDS圖譜具有較好的擬合度。利用one-way ANOSIM算法可以對(duì)上述聚類(lèi)現(xiàn)象進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析以判定顯著性，結(jié)果表明，當(dāng)以?xún)?chǔ)藏時(shí)間點(diǎn)為各樣品分組依據(jù)時(shí)，儲(chǔ)藏1 a的樣品與儲(chǔ)藏2 a的樣品之間、儲(chǔ)藏1 a的樣品與儲(chǔ)藏3 a的樣品之間均具有顯著性的分離聚類(lèi)（P＜0.05），而儲(chǔ)藏2 a的樣品與儲(chǔ)藏3 a的樣品之間的分離聚類(lèi)不顯著（P=0.35）。當(dāng)以糧庫(kù)空間位置為各樣品的分類(lèi)依據(jù)時(shí)，所有組之間分離聚類(lèi)的結(jié)果均為不顯著（P＞0.05）。

圖3 不同儲(chǔ)藏玉米樣品中霉菌群落樹(shù)狀聚類(lèi)圖Fig. 3 Cluster dendrogram for mold communities from different stored corn samples

如圖3所示，相同年份的樣品在樹(shù)狀聚類(lèi)圖上的位置很近，表明他們的霉菌群落結(jié)構(gòu)相似度較高。儲(chǔ)藏2 a的樣品中，有2 個(gè)樣品在儲(chǔ)藏1 a樣品的分枝上，另外3 個(gè)樣品在儲(chǔ)藏3 a樣品的分枝上，即儲(chǔ)藏2 a的樣品在樹(shù)狀聚類(lèi)圖上處在儲(chǔ)藏1 a和儲(chǔ)藏3 a的樣品之間，呈現(xiàn)出過(guò)渡期的狀態(tài)。由此可見(jiàn)，儲(chǔ)藏玉米中霉菌群落的變化與其儲(chǔ)藏時(shí)間具有較強(qiáng)的相關(guān)性，而與其在糧庫(kù)中的空間位置相關(guān)性較小。

2.3 儲(chǔ)藏玉米中霉菌群落與儲(chǔ)藏時(shí)間的相關(guān)性特征

圖4 不同儲(chǔ)藏玉米樣品中霉菌群落Alpha多樣性Fig. 4 Alpha diversity of mold communities from different stored corn samples

采用微生物群落多樣性研究中最為常用的Simpson指數(shù)作為樣品內(nèi)霉菌物種多樣性（Alpha多樣性）的評(píng)估指標(biāo)，如圖4所示。儲(chǔ)藏2 a的樣品中霉菌群落的物種多樣性略高于其他兩個(gè)儲(chǔ)藏時(shí)間點(diǎn)的樣品，但各組數(shù)據(jù)之間的差異均不顯著。儲(chǔ)藏2 a的樣品多樣性略高可能與其處于過(guò)渡期狀態(tài)有關(guān)，過(guò)渡期狀態(tài)的樣品可能兼具儲(chǔ)藏1 a和儲(chǔ)藏3 a的霉菌群落的特征。

圖5 不同儲(chǔ)藏時(shí)間樣品中霉菌群落的LEfSe分析Fig. 5 LEfSe analysis of mold communities from stored corn for different years

利用LEfSe在線(xiàn)分析工具可以分析各儲(chǔ)藏時(shí)間點(diǎn)的樣品的霉菌群落中的特征霉菌。如圖5所示，Penicillium sp.及一個(gè)未測(cè)序的條帶所代表的霉菌為儲(chǔ)藏1 a樣品的特征霉菌菌種，Candida sp.為儲(chǔ)藏3 a樣品的特征霉菌菌種，而儲(chǔ)藏2 a的樣品中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)特征霉菌菌種，這可能是由于儲(chǔ)藏2 a的樣品霉菌群落特征處于儲(chǔ)藏1 a和儲(chǔ)藏3 a樣品霉菌群落特征的過(guò)渡期，因此該時(shí)間點(diǎn)的樣品沒(méi)有獨(dú)有的霉菌種類(lèi)。

3 討 論

本研究團(tuán)隊(duì)在之前的報(bào)道中曾提出，依據(jù)預(yù)測(cè)微生物學(xué)，構(gòu)建儲(chǔ)糧中微生物生長(zhǎng)預(yù)測(cè)模型，可以快速對(duì)儲(chǔ)糧中微生物的生長(zhǎng)情況進(jìn)行判斷，對(duì)儲(chǔ)糧中病原微生物和腐敗微生物的控制有重要作用[8]。霉菌是對(duì)儲(chǔ)糧危害最為嚴(yán)重的微生物，對(duì)人類(lèi)健康具有多方面的影響。為了建立儲(chǔ)糧中霉菌群落生長(zhǎng)預(yù)測(cè)模型，一方面要選擇適當(dāng)模型算法對(duì)霉菌群落生長(zhǎng)進(jìn)行模擬，另一方面需要實(shí)測(cè)的數(shù)據(jù)，對(duì)儲(chǔ)糧霉菌群落的規(guī)律進(jìn)行研究，并對(duì)各生長(zhǎng)預(yù)測(cè)模型進(jìn)行評(píng)估和優(yōu)化。從本研究的結(jié)果可以看出，在生態(tài)環(huán)境條件均勻的同一糧倉(cāng)中，不同空間位置的樣品霉菌群落相似度較高，而不同儲(chǔ)藏時(shí)間的樣品霉菌群落具有較大的差異。因此在后續(xù)建立霉菌生長(zhǎng)預(yù)測(cè)模型時(shí)，應(yīng)將儲(chǔ)藏時(shí)間設(shè)為主要因素之一，而將在糧庫(kù)中的空間位置定為次要因素。

在傳統(tǒng)的DGGE數(shù)據(jù)分析中，主要采取樹(shù)狀圖聚類(lèi)分析研究泳道帶型的相似性[24-26]。本研究參照了16S rRNA擴(kuò)增子測(cè)序中的數(shù)據(jù)分析方法[27-30]，將NMDS、ANOSIM、Simpson多樣性指數(shù)、LEfSe等分析引入了DGGE結(jié)果分析中，對(duì)DGGE數(shù)據(jù)進(jìn)行了更加深入全面的研究。這些方法揭示了儲(chǔ)藏1 a和儲(chǔ)藏3 a的儲(chǔ)藏玉米樣品中霉菌群落具有較大的差異，而儲(chǔ)藏2 a樣品的霉菌群落處于過(guò)渡期狀態(tài)，這表明糧庫(kù)中玉米儲(chǔ)藏的第2年可能是霉菌群落控制的關(guān)鍵時(shí)期。本研究發(fā)現(xiàn)儲(chǔ)藏玉米中主要的污染霉菌為青霉，此外還包括毛霉和曲霉，這與孫武長(zhǎng)等[3]報(bào)道的儲(chǔ)糧中危害最普遍的霉菌為曲霉和青霉相一致。

為了建立準(zhǔn)確可靠霉菌群落模型，還需對(duì)儲(chǔ)糧霉菌群落進(jìn)行更多的基礎(chǔ)理論研究和數(shù)據(jù)收集。例如，不同糧食種類(lèi)的霉菌群落可能不同，儲(chǔ)糧表層和儲(chǔ)糧內(nèi)部的霉菌群落可能不同，不同溫度、濕度的糧庫(kù)中霉菌群落類(lèi)型可能不同。應(yīng)用本實(shí)驗(yàn)所采用的分子生物學(xué)方法，對(duì)上述問(wèn)題進(jìn)行深入研究，可以得到對(duì)儲(chǔ)糧中霉菌群落特征的全面認(rèn)識(shí)。

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