大孔樹脂固定化磷脂酶A1及其用于菜籽油脫膠工藝的優(yōu)化

水龍龍，操麗麗，龐 敏，潘麗軍，鮑 賽，李進(jìn)紅，姜紹通*

（合肥工業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，安徽省農(nóng)產(chǎn)品精深加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥 230009）

菜籽經(jīng)過壓榨得到菜籽毛油，毛油中雜質(zhì)較多，易氧化變質(zhì)，甚至含有農(nóng)藥殘留、重金屬等有害物質(zhì)，故需要對毛油進(jìn)行精煉。精煉工藝主要為脫膠、脫酸、脫色和脫臭。脫膠是油脂精煉過程中的關(guān)鍵步驟之一，脫膠效果的優(yōu)劣，對后續(xù)的精煉工藝以及成品油的品質(zhì)有重大影響[1]。脫膠是脫除膠質(zhì)物質(zhì)的過程，磷脂是膠質(zhì)物質(zhì)的主要成分，有水化磷脂和非水化磷脂之分。酸法脫膠和水化脫膠是油脂工廠常用的脫膠方法。水化脫膠工藝只能去除油脂中的水化磷脂，無法脫除非水化磷脂。酸法脫膠只可以脫除水化磷脂和少量的非水化磷脂，仍會殘留大部分的非水化磷脂，并且會消耗較多的堿，產(chǎn)生較多的廢水[2]。

酶法脫膠利用磷脂酶將非水化磷脂水解為溶血磷脂，可以將非水化磷脂從油脂中除去[3]。與酸法脫膠和水化脫膠相比，酶法脫膠具有反應(yīng)條件溫和、化學(xué)試劑用量少、環(huán)境污染小等優(yōu)勢[4]。然而，游離酶用于油脂脫膠存在著易失活、無法重復(fù)使用、價格高等劣勢[5]。通過將磷脂酶固定在載體上，制得固定化酶可以在很大程度上彌補(bǔ)這種劣勢。固定化酶依然保留著游離酶對底物的特異性和高效性，還可以提高酶的穩(wěn)定性，實(shí)現(xiàn)酶的重復(fù)使用，有效降低了酶的使用成本[6]。

常見酶的固定化方法有物理吸附法、交聯(lián)法、共價偶聯(lián)法和包埋法[7]。將磷脂酶固定在大孔樹脂上的操作過程簡單，對酶分子結(jié)構(gòu)影響小，作為載體的樹脂還可以回收重復(fù)使用，但同時也存在著酶較易脫落的缺點(diǎn)[8]。大孔樹脂固定化脂肪酶和磷脂酶已有較多研究[7-13]，但將大孔樹脂固定化磷脂酶用于菜籽油脫膠的研究鮮見報道。本實(shí)驗(yàn)以廉價易得的大孔樹脂為磷脂酶固定化材料，優(yōu)化大孔樹脂固定化磷脂酶的最佳條件，并將固定化酶用于菜籽油脫膠實(shí)驗(yàn)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

磷脂酶A1（Lecitase? Ultra，酶活力5 000 U/mL） 丹麥諾維信公司；大孔樹脂（型號D001、D113、D1400、D201、D301、D314、DA201和SA-2） 安徽三星樹脂科技有限公司；大豆卵磷脂 上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司；菜籽毛油（實(shí)測初始磷含量為72.6 mg/kg） 安徽合肥市售；乙醇、氫氧化鈉、氫氧化鉀、磷酸氫二鈉、檸檬酸、硫酸聯(lián)胺、鉬酸鈉、氧化鋅、濃鹽酸、濃硫酸均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

NSKY-110WX型水浴搖床 上海蘇坤實(shí)業(yè)有限公司；FA25型高剪切分散乳化機(jī) 上海弗魯克流體機(jī)械制造有限公司；T6新世紀(jì)型雙光束紫外-可見光分光光度計 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；ZDJ-4B型自動電位滴定儀 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；DZF-6053型真空干燥箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司：SX2-4-10型箱式電阻爐 黃石市恒豐醫(yī)療器械有限公司。

1.3 方法

1.3.1 固定化酶的制備

取100 g樹脂于500 mL燒杯中，加入300 mL無水乙醇浸泡24 h后抽濾，用去離子水將乙醇洗凈，依次將樹脂用5% HCl和5% NaOH溶液浸泡3 h后抽濾，然后用去離子水沖洗直至中性。取一定量大孔樹脂、緩沖液（0.02 mol/L磷酸氫二鈉溶液與0.01 mol/L檸檬酸溶液按不同比例混調(diào)）和磷脂酶A1于錐形瓶中，水浴搖床室溫振蕩吸附一定時間，過濾分離載體和上清液，并用緩沖液清洗載體，將固定化酶于30 ℃真空干燥后保存于4 ℃冰箱中[7-9]。

1.3.2 載體樹脂的蛋白吸附量測定

蛋白含量測定采用Bradford法[14]，載體的蛋白吸附率按公式（1）計算：

式中：X1為固定化前酶液的蛋白質(zhì)量/mg；X2為固定化后上清液的蛋白質(zhì)量/mg。

1.3.3 固定化磷脂酶A1活力的測定

參照占劍鋒等[15]方法，稍作更改：將4%的無油大豆卵磷脂和0.5%的聚乙烯醇溶于一定pH值的緩沖液中，用高剪切分散乳化機(jī)將混合液10 000 r/min均質(zhì)10 min，獲得底物溶液。取30 mL底物溶液于100 mL錐形瓶中，50 ℃水浴搖床預(yù)熱10 min后加入預(yù)定量的固定化酶，同時作空白對照。180 r/min反應(yīng)10 min后，立即加入15 mL 95%乙醇溶液終止酶解反應(yīng)，使用自動電位滴定儀，以0.1 mol/L NaOH溶液為滴定劑滴定底物溶液，計算NaOH溶液的平均消耗量。

定義在特定的條件下1 min水解磷脂產(chǎn)生1 μmol游離脂肪酸所需的酶量為1 個磷脂酶活力單位（U）。固定化磷脂酶A1活力為每克固定化酶含有的磷脂酶活力單位（U/g）。固定化磷脂酶A1活力按公式（2）計算：

式中：X為樣品酶活力/（U/g）；V為滴定實(shí)驗(yàn)組時消耗NaOH溶液的體積/mL；V0為滴定空白組時消耗NaOH溶液的體積/mL；c為NaOH溶液的濃度/（mol/L）；m為加入固定化酶的質(zhì)量/g；t為酶解反應(yīng)時間/min。

1.3.4 pH值和反應(yīng)溫度對固定化酶與游離酶活力的影響

將固定化酶和游離酶分別在不同pH值（4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5）、不同反應(yīng)溫度（30、35、40、45、50、55、60、65 ℃）條件下，按1.3.3節(jié)方法測定酶活力，定義不同pH值和反應(yīng)溫度條件下所測得的酶活力中最高者為100%。

1.3.5 酶法脫膠實(shí)驗(yàn)

參照文獻(xiàn)[16]，稍作改動：取200 g菜籽毛油于錐形瓶中，水浴加熱至80 ℃，加入45%的檸檬酸0.24 mL，10 000 r/min均質(zhì)1 min，置于80 ℃水浴鍋中500 r/min攪拌20 min。再加入一定量的4% NaOH溶液調(diào)節(jié)到預(yù)定pH值。再加入4 mL蒸餾水和一定量的固定化酶，在50 ℃、180 r/min條件下，水浴搖床酶解反應(yīng)一段時間。將所得的脫膠油5 000 r/min離心20 min，取上層油樣測定磷含量。磷含量的檢測方法參照GB/T 5537—2008《糧油檢驗(yàn) 磷脂含量的測定》。

1.3.6 酶法脫膠工藝條件優(yōu)化

1.3.6.1 單因素試驗(yàn)

按1.3.5節(jié)方法，進(jìn)行脫膠試驗(yàn)，分別考察固定化酶添加量（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 g/kg）、反應(yīng)pH值（4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0）、反應(yīng)溫度（35、40、45、50、55、60 ℃）、反應(yīng)時間（1、2、3、4、5 h）對脫膠效果的影響，每組試驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.3.6.2 響應(yīng)面試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計，確定最佳的脫膠條件，每組試驗(yàn)重復(fù)3 次。響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平如表1所示。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Table1 Variables and their levels used for response surface design

1.3.7 固定化酶重復(fù)使用性實(shí)驗(yàn)

將固定化酶在響應(yīng)面法獲得的最佳條件下進(jìn)行菜籽毛油脫膠實(shí)驗(yàn)。固定化酶重復(fù)使用5 次，每次脫膠實(shí)驗(yàn)后，回收固定化酶，并用pH 5.0的緩沖液沖洗干凈，并測定酶活力及脫膠油中的磷含量，規(guī)定固定化酶原來的酶活力為100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 固定化載體的選擇

選取8 種不同的大孔樹脂作為磷脂酶A1的固定化載體。固定化條件為緩沖液pH 5.0，酶添加量2 mL/g（磷脂酶A1的蛋白質(zhì)量濃度為16.65 mg/mL），室溫振蕩吸附6 h，收集上清液并將所得的固定化酶真空干燥，測定各種樹脂的蛋白吸附率和固定化酶活力，結(jié)果如表2所示。

表2 不同樹脂的物化性質(zhì)及固定化效果Table2 Physical properties and enzyme immobilization capacity of resins

大孔樹脂主要借助氫鍵、范德華力或者是某些功能基團(tuán)將酶固定在其周圍，樹脂的理化性質(zhì)對固定化效率和固定化酶活力有至關(guān)重要的影響[9,11]。離子交換樹脂表面的帶電基團(tuán)與酶分子表面特殊官能團(tuán)可以形成離子鍵，通過范德華力和離子鍵的作用，離子交換樹脂可以將酶吸附在其表面，大孔吸附樹脂則通過范德華力和氫鍵將酶吸附在其周圍。從表2可以看出，蛋白吸附率越大，固定化酶活力越高，在選擇的8 種大孔樹脂中，陽離子交換樹脂D001的固定化效果最好，酶活力最高。因此選擇D001樹脂作為固定化磷脂酶A1的最適載體。

2.2 固定化反應(yīng)條件優(yōu)化

2.2.1 最適固定化pH值的確定

取2 g D001型大孔樹脂，加入3 mL磷脂酶，20 mL pH值分別為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0的緩沖液，置于水浴搖床中，室溫振蕩4 h后過濾，收集上清液和固定化酶，將固定化酶于30 ℃真空干燥箱中干燥，測定各條件下固定化酶活力，結(jié)果如圖1所示。

圖1 pH值對固定化酶活力和蛋白吸附率的影響Fig. 1 Effect of pH on the activity of immobilized phospholipase and immobilization efficiency

由圖1可知，固定化酶活力和蛋白吸附率均隨pH值的增加而先增大后減小，在pH 5.0時，酶活力和蛋白吸附率同時達(dá)到最大值。pH值的改變會影響酶活性中心上必需基團(tuán)的解離程度以及底物的解離狀態(tài)。只有在最合適的

pH值條件下，酶和底物才會達(dá)到最佳的結(jié)合狀態(tài)，從而表現(xiàn)最大的酶活力[19]。固定化酶活力與游離酶活力相比要低很多，可能是因?yàn)楣潭ɑ副淮罅课皆谳d體的表面，在反應(yīng)時無法與底物進(jìn)行充分的接觸，從而表現(xiàn)出較低的酶活力。

2.2.2 最適酶添加量的確定

圖2 酶添加量對固定化酶活力和蛋白吸附率的影響Fig. 2 Effect of phospholipase amount on the activity of immobilized phospholipase and immobilization efficiency

取2 g D001型大孔樹脂，分別加入1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL的磷脂酶，pH 5.0的緩沖液20 mL，置于水浴搖床中，室溫振蕩4 h后過濾，收集上清液和固定化酶，將固定化酶于30 ℃真空干燥箱中干燥，測定各條件下固定化酶活力，結(jié)果如圖2所示。

由圖2可知，當(dāng)酶添加量少于1.5 mL/g時，固定化酶活力隨酶添加量的增加而逐漸增加，當(dāng)酶添加量超過1.5 mL/g后，酶活力不再增加，而是趨于穩(wěn)定。蛋白吸附率則隨著酶添加量的增大而逐漸減小?？赡艿脑蚴钱?dāng)酶添加量較少時，樹脂可以盡可能多地吸附溶液中的酶蛋白，故固定化效率較高，但是酶活力較低；隨著酶添加量繼續(xù)增加，樹脂逐漸達(dá)到飽和狀態(tài)，無法吸附更多的酶蛋白，酶活力也不再增加，固定化效率也逐漸減小[7]。

2.2.3 最適固定化時間的確定

取2 g D001型大孔樹脂，加入3.0 mL磷脂酶，pH 5.0緩沖液20 mL，置于水浴搖床中，室溫振蕩吸附1、2、4、6、8 h后過濾，收集上清液和固定化酶，將固定化酶于30 ℃真空干燥箱中干燥，測定各條件下固定化酶活力，結(jié)果如圖3所示。

圖3 固定化時間對固定化酶活力和蛋白吸附率的影響Fig. 3 Effects of reaction time on the activity of immobilized phospholipase and immobilization efficiency

由圖3可知，固定化酶活力和蛋白吸附率隨固定化時間的變化趨勢為逐漸增加，在4 h以后幾乎保持不變。因?yàn)闃渲奈搅渴枪潭ǖ?，故隨著時間的延長，樹脂逐漸達(dá)到飽和吸附狀態(tài)，無法繼續(xù)吸附更多的酶蛋白，酶活力和蛋白吸附率也不再發(fā)生變化。

綜上所述，大孔樹脂D001固定化磷脂酶A1的最佳條件為pH 5.0、酶添加量1.5 mL/g、固定化時間4 h。在此條件下固定化磷脂酶A1活力為665.8 U/g，蛋白吸附率為62.3%。

2.3 溫度和pH值對固定化酶和游離酶活力的影響

由圖4A可知，固定化酶和游離酶的最適溫度基本保持一致，均在50 ℃左右。當(dāng)溫度在40～65 ℃之間時，固定化酶的相對酶活力均比游離酶高，這說明固定化酶比較穩(wěn)定，酶活力變化較小。由圖4B可知，固定化酶和游離酶最適pH值均在5.0附近。當(dāng)pH值超過6.0之后，相對酶活力均呈直線下降趨勢，但固定化酶能在更廣的pH值范圍內(nèi)保持較高的相對酶活力。許多研究表明[20-23]，將酶固定在適合的載體上，可以降低酶對溫度和pH值的敏感性。由于載體將酶固定在其周圍，減小了pH值和溫度對酶活性中心的影響，因此固定化酶在較廣的溫度和pH值范圍內(nèi)均能保持較高酶活力[24-25]。

圖4 固定化酶的最適溫度（A）和最適pH值（B）分析Fig. 4 Optimum temperature (A) and pH (B) for immobilized and free phospholipase

2.4 固定化酶脫膠工藝優(yōu)化結(jié)果

2.4.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

圖5 固定化酶添加量（A）、反應(yīng)時間（B）、反應(yīng)溫度（C）和反應(yīng)pH值（D）對脫膠效果的影響Fig. 5 Effects of phospholipase dosage (A), reaction time (B), temperature (C)and pH value (D) on degumming efficiency

由圖5A可知，當(dāng)固定化酶添加量逐漸增大時，脫膠油中磷含量逐漸降低，當(dāng)酶添加量超過1.5 g/kg后，磷含量基本不再發(fā)生變化，考慮到酶的成本，選擇酶添加量為1.5 g/kg。由圖5B可知，隨著反應(yīng)時間的延長，磷含量逐漸下降，當(dāng)時間達(dá)到3 h以后，磷脂酶與油中的磷脂反應(yīng)完全，磷含量不再發(fā)生明顯的變化。因此較好脫膠反應(yīng)時間為3 h左右。由圖5C可知，在45～55 ℃的范圍內(nèi)，脫膠油中磷含量均在10 mg/kg以下，說明脫膠的最佳溫度在45～55 ℃之間。過高或過低的溫度均會導(dǎo)致酶活力降低，從而導(dǎo)致脫膠效果不理想。由圖5D可知，在pH 4.5～5.5范圍內(nèi)，固定化酶活力較高，可以將油脂中磷含量降低到10 mg/kg以下。

2.4.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

2.4.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與分析

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計與結(jié)果Table3 Experimental design and results for response surface analysis

如表3所示，以磷含量為響應(yīng)值Y，使用Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行分析?；貧w模型的方差分析見表4。

表4 回歸模型的方差分析Table4 Analysis of variance of the regression equation

由表4可知，二次回歸模型的F值為47.11，P值小于0.000 1，說明此回歸模型極顯著；失擬項(xiàng)P值為0.066 5，大于0.05，表明差異不顯著，此模型擬合效果良好，可以接受。一次項(xiàng)、二次項(xiàng)和交互項(xiàng)BD、CD對響應(yīng)值的影響均為極顯著（P＜0.01），交互項(xiàng)的影響主次順序?yàn)锽D＞CD。方程決定系數(shù)R2值為0.979 2，說明使用此回歸方程進(jìn)行分析時，各因素與響應(yīng)值之間有良好的線性關(guān)系[26-27]。

從圖6可以看出，反應(yīng)時間和反應(yīng)pH值、反應(yīng)溫度和反應(yīng)pH值兩兩交互作用的曲線較陡，呈現(xiàn)較規(guī)則的曲面，說明交互作用影響顯著，且反應(yīng)時間和反應(yīng)pH值交互作用曲面圖較反應(yīng)溫度和反應(yīng)pH更為陡峭，說明反應(yīng)時間和反應(yīng)pH值交互作用更為顯著。

圖6 兩因素交互作用對磷含量影響的響應(yīng)面和等高線圖Fig. 6 Response surface and contour plots showing the intereactive effect of variables on phosphorus content of degummed oil

通過Design-Expert 8.0.6獲得的回歸方程為Y=433.21-19.24A-24.05B-6.63C-72.66D＋0.75AB-0.047AC＋0.65AD＋0.07BC＋2.15BD＋0.30CD＋4.33A2＋1.05B2＋0.05C2＋4.5D2。根據(jù)此回歸方程，確定固定化磷脂酶用于菜籽毛油脫膠的最佳條件為固定化酶添加量1.79 g/kg、反應(yīng)時間3.56 h、反應(yīng)溫度51.22 ℃、反應(yīng)pH 5.46。

2.4.2.2 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)響應(yīng)面試驗(yàn)所得的最佳脫膠條件，進(jìn)行3 次重復(fù)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。根據(jù)實(shí)際操作的需要，將脫膠反應(yīng)最佳條件修正為固定化酶添加量1.8 g/kg、反應(yīng)時間3.6 h、反應(yīng)溫度51 ℃、反應(yīng)pH 5.5。在此條件下進(jìn)行固定化酶脫膠實(shí)驗(yàn)，得到的脫膠油中的平均磷含量為5.82 mg/kg，在響應(yīng)值Y的95%預(yù)測區(qū)間[4.80，6.45]內(nèi)，說明此回歸模型具有良好的擬合性。

2.5 固定化酶的重復(fù)使用穩(wěn)定性結(jié)果

圖7 固定化酶的重復(fù)使用性Fig. 7 Reusability of immobilized phospholipase

由圖7可知，脫膠油中的磷含量隨著固定化酶使用次數(shù)增加不斷上升，當(dāng)固定化酶使用5 次后，磷含量上升為9.78 mg/kg。工業(yè)生產(chǎn)中要求，脫膠油的磷含量在10 mg/kg以下[28]，可見固定化酶重復(fù)使用5 次后，其脫膠效果仍可滿足工業(yè)生產(chǎn)的要求。固定化酶活力隨著使用次數(shù)的增加不斷下降，當(dāng)使用5 次后，固定化酶只含有初始酶活力的47.9%。固定化酶活力急劇下降的原因可能是酶與載體結(jié)合不牢固，在脫膠的過程中由于不斷攪拌的緣故，酶從載體上脫落，造成酶活力損失較大[29-30]。

3 結(jié) 論

以離子交換樹脂D001為載體固定化磷脂酶A1，最佳固定化反應(yīng)條件為pH 5.0、酶添加量1.5 mL/g、固定化時間4 h。獲得的固定化磷脂酶A1的活力為665.8 U/g。與游離酶相比，固定化酶的最適溫度和pH值均未發(fā)生改變，但固定化反應(yīng)可以在一定程度上增加酶的穩(wěn)定性，使固定化酶在更廣的溫度和pH值范圍內(nèi)保持較高的相對酶活力。將固定化酶用于菜籽油脫膠實(shí)驗(yàn)，并通過響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化了脫膠條件。將固定化酶進(jìn)行5 次脫膠實(shí)驗(yàn)后，脫膠油中磷含量為9.78 mg/kg，滿足工業(yè)生產(chǎn)中脫膠油中磷含量小于10 mg/kg的要求，但是固定化酶只有其初始酶活力的47.9%，酶活力損失較大。說明該固定化酶用于油脂脫膠，還是存在著固定化酶重復(fù)利用次數(shù)較少，酶活力損失較大的問題，還需研究更加有效的固定化方法，使固定化磷脂酶A1實(shí)現(xiàn)較多次數(shù)的重復(fù)使用。實(shí)驗(yàn)表明，使用大孔樹脂固定化磷脂酶A1脫除菜籽毛油中的磷脂，得到的脫膠油完全符合工業(yè)生產(chǎn)對脫膠效果的要求，并且可以方便地實(shí)現(xiàn)酶的分離和重復(fù)利用。

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