植物源食品中α-胡蘿卜素和β-胡蘿卜素的測(cè)定及比較分析

崔亞娟，孔凡華，劉國(guó)杰*，魯 緋，李 東

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，北京 100094；2.北京市營(yíng)養(yǎng)源研究所，北京市系統(tǒng)營(yíng)養(yǎng)工程技術(shù)研究中心，北京 100069）

類胡蘿卜素是一類重要的天然色素的總稱，普遍存在于動(dòng)物、高等植物、真菌、藻類中的黃色、橙紅色或紅色的色素之中，性質(zhì)極其不穩(wěn)定，受熱、遇氧、見光容易受到破壞。迄今，被發(fā)現(xiàn)的天然類胡蘿卜素已達(dá)600多種[1-2]，其中幾種常見的類胡蘿卜素有α-胡蘿卜素、β-胡蘿卜素、葉黃素、玉米黃質(zhì)、番茄紅素及蝦青素等。常見類胡蘿卜素如表1所示。研究表明，類胡蘿卜素物質(zhì)主要存在于天然果蔬中[3-4]，具有較強(qiáng)抗氧化性[5]、可以預(yù)防和治療糖尿病[6]、減少心血管疾病發(fā)病率[7]、保護(hù)視力和抗癌[8]等多種生理功能。在自然條件下類胡蘿卜素是動(dòng)物體內(nèi)VA的主要來源，約有10%的類胡蘿卜素（主要為α-胡蘿卜素、β-胡蘿卜素）是VA的前體，其中β-胡蘿卜素的VA原活性最高[9-10]，這主要是因?yàn)棣?胡蘿卜素具有的對(duì)稱結(jié)構(gòu)，1 分子β-胡蘿卜素可以產(chǎn)生2 分子的VA[9]。隨著人們健康意識(shí)的增強(qiáng)，對(duì)天然類胡蘿素的需求大大增加，開發(fā)利用類胡蘿卜素已經(jīng)成為一個(gè)引人注目的發(fā)展趨勢(shì)[11-12]。

表1 常見幾種類胡蘿卜素的分子式和結(jié)構(gòu)式Table1 Molecular formulas and structures of several carotenes

植物源食品中類胡蘿卜素的測(cè)定方法以及背景資料是開展類胡蘿卜素營(yíng)養(yǎng)研究工作的重要基礎(chǔ)[13]。目前，食物中類胡蘿卜素的測(cè)定方法有分光光度法[14]、柱層析法[5,15]、薄層色譜法[16]、高效液相色譜法[17-18]、質(zhì)譜[19]、電化學(xué)檢測(cè)器[20]、核磁共振[21]。分光光度法適用于測(cè)定單一類胡蘿卜素的量，不能對(duì)多種類胡蘿卜素分別定量；薄層色譜法和柱層析法成本低廉，能對(duì)多種胡蘿卜素進(jìn)行分離，但分析時(shí)間長(zhǎng)、重復(fù)性差且不能精確定量；質(zhì)譜、核磁共振和電化學(xué)檢測(cè)器等串聯(lián)儀器設(shè)備昂貴，測(cè)定成本高。高效液相色譜法具有分離效能高、分析速度快等優(yōu)點(diǎn)，目前基本采用反相高效液相色譜法，并配合紫外-可見光檢測(cè)器或二極管陣列檢測(cè)器，對(duì)樣品中的類胡蘿卜素進(jìn)行定性定量分析。研究人員用液相色譜法測(cè)定油料作物種子[22]、小麥類[23]、番茄和胡蘿卜[24]、白菜[25]、茶[26]、水果[27]等多種植物源食品中類胡蘿卜素的含量，但不同植物源食品中類胡蘿卜素含量及其活性比較研究較少，目前我國(guó)尚缺少植物源食品中各種類胡蘿卜素組分含量方面的背景資料和相關(guān)數(shù)據(jù)[28]，因此，建立、完善測(cè)定植物源食品中各種類胡蘿卜素組分的方法亟待解決，建立一個(gè)同時(shí)測(cè)定胡蘿卜素的定量方法，對(duì)于正確評(píng)價(jià)各種水果蔬菜及植物源食品的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，開展?fàn)I養(yǎng)學(xué)的研究至關(guān)重要。本實(shí)驗(yàn)在借鑒前人研究的基礎(chǔ)上，利用高效液相色譜法建立植物源食品中α-胡蘿卜素及β-胡蘿卜素的同時(shí)在線分析檢測(cè)，以胡蘿卜凍干粉為樣品進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證，并用該方法測(cè)定多種植物源食品中胡蘿卜素的含量并進(jìn)行比較分析，旨在為科研和實(shí)際應(yīng)用提供理論依據(jù)和數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

胡蘿卜凍干粉 實(shí)驗(yàn)室自制；果蔬、谷物、植物油、茶等樣品各6 種 市購(gòu)；β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)品（純度＞95.0%）、α-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)品（純度＞95.0%） 美國(guó)Sigma公司；甲醇、乙腈、三乙胺、甲基叔丁基醚、二氯甲烷、正己烷（均為色譜純） 美國(guó)Fisher公司；無水硫酸鈉、乙醇、氫氧化鉀、丙酮、三氯甲烷、石油醚、抗壞血酸（均為分析純） 北京化工廠。

1.2 儀器與設(shè)備

BS224S分析天平 德國(guó)賽多利斯公司；EYELA N-1100旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 東京理化株式會(huì)社；98-Ⅱ-B磁力攪拌電熱套 天津市泰斯特儀器有限公司；L-2000高效液相色譜儀 日本日立科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備

稱取胡蘿卜凍干粉約0.03 g和果蔬、谷物、植物油、茶等樣品2～5 g（精確至0.000 1 g），置于250 mL平底燒瓶中，加入10 mL抗壞血酸水溶液（10%），再加入30 mL乙醇溶解，搖勻，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)50%氫氧化鉀溶液10 mL，混勻，于磁力攪拌電熱套上皂化回流30 min，取出立即放入冷水中冷卻。

將皂化后的液體轉(zhuǎn)移至500 mL分液漏斗中，用約50 mL水分2 次洗皂化瓶，洗液并入分液漏斗中。用50 mL石油醚分2 次洗皂化瓶，石油醚液同樣轉(zhuǎn)移至分液漏斗，將分液漏斗置于振蕩器上振搖，280 r/min振搖2 次，每次振搖3 min，其間放氣；振搖后取下分液漏斗，靜置分層，將下層溶液轉(zhuǎn)移至另一分液漏斗中，重復(fù)上述步驟2 次；棄去下層液體，合并2 次提取液后用水洗至中性；將液體經(jīng)過約5 g無水硫酸鈉后濾入150 mL蒸發(fā)瓶中，用約10 mL石油醚沖洗分液漏斗及無水硫酸鈉3 次，并入蒸發(fā)瓶中。將蒸發(fā)瓶接至旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸發(fā)，蒸至近干后用氮?dú)獯蹈烧舭l(fā)瓶，取下蒸發(fā)瓶，剩余物用甲醇-乙腈-二氯甲烷-正己烷（3∶4∶4∶4，V/V）溶液定容至5 mL，樣品過0.45 μm濾膜，備用。

1.3.2 色譜條件

色譜柱：YMC C30（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相A為乙腈-甲醇-三乙胺溶液（70∶30∶0.05，V/V），流動(dòng)相B為甲基叔丁基醚-三乙胺溶液（100∶0.05，V/V）；檢測(cè)波長(zhǎng)450 nm；柱溫30 ℃；進(jìn)樣體積20 μL；洗脫程序：0～27 min，100%～45% A，0%～55% B；27.0～27.1 min，45%～100% A，55%～0% B，保留8 min。

1.3.3 胡蘿卜素含量的測(cè)定

胡蘿卜素含量按下式計(jì)算：

式中：X為樣品中胡蘿卜素含量/（μg/100 g）；c為由標(biāo)準(zhǔn)曲線而得的試樣溶液中胡蘿卜素質(zhì)量濃度/（μg/mL）；V為試樣溶液最終定容體積/mL；m為試樣質(zhì)量/g。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

2.1.1 α-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

α-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：稱取α-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)品1 mg（精確到0.1 mg），用丙酮定容至10 mL棕色容量瓶中，臨用前在波長(zhǎng)450 nm處用丙酮作空白于分光光度計(jì)上標(biāo)定溶液濃度。

α-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)工作液：從α-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液中分別準(zhǔn)確移取1、1、1、2、1 mL溶液轉(zhuǎn)移至100、50、25、25、5 mL棕色容量瓶中，用丙酮定容至刻度，得到質(zhì)量濃度為0.8～20 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)系列工作液，分別進(jìn)樣20 μL。按1.3.2節(jié)色譜條件測(cè)定，記錄所得峰面積，以峰面積為橫坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程為y=1.886 3×10-6x，R2=0.999 7。

2.1.2 β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：準(zhǔn)確稱取β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)品10 mg（精確到0.1 mg），用三氯甲烷定容至10 mL棕色容量瓶中，臨用前在波長(zhǎng)450 nm處用正己烷作空白于分光光度計(jì)上標(biāo)定溶液濃度。

β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)中間液（20 μg/mL）：從β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)母液中準(zhǔn)確移取1.0 mL溶液轉(zhuǎn)入50 mL棕色容量瓶中，用甲醇-乙腈-二氯甲烷-正己烷（3∶4∶4∶4，V/V）溶液定容至刻度，得到質(zhì)量濃度為20 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)中間液。

β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)工作液：從β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)中間液中分別準(zhǔn)確移取1.0、2.0、2.0、1.0、2.0 mL溶液轉(zhuǎn)入50、50、25、5、5 mL棕色容量瓶中，用甲醇-乙腈-二氯甲烷-正己烷（3∶4∶4∶4，V/V）溶液定容至刻度，得到質(zhì)量濃度為0.4～8.2 μg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)工作液，分別進(jìn)樣20 μL。按1.3.2節(jié)色譜條件測(cè)定，記錄所得峰面積，以峰面積為橫坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程為y=9.183 7×10-7x，R2=0.999 2。

2.2 方法精密度的測(cè)定結(jié)果

準(zhǔn)確稱取0.03 g（精確至0.000 1 g）胡蘿卜凍干粉樣品，做6 個(gè)平行，進(jìn)行α-胡蘿卜素和β-胡蘿卜素含量測(cè)定。如表2所示，胡蘿卜凍干粉中α-胡蘿卜素和β-胡蘿卜素的平均值分別為25.8 mg/100 g和16.1 mg/100 g，標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.15 mg/100 g和0.76 mg/100 g，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為4.45%和4.71%。實(shí)驗(yàn)具有較好重復(fù)性，能夠滿足對(duì)樣品測(cè)定平行的要求。

表2 胡蘿卜凍干粉中胡蘿卜素的含量Table2 Carotene content of freeze-dried carrot powder

2.3 加標(biāo)回收率的測(cè)定結(jié)果

表3 胡蘿卜素加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table3 Recoveries from spiked samples

取胡蘿卜凍干粉為樣品基質(zhì)，分別以樣品本底的0.5、1、2 倍添加低、中、高3 個(gè)添加量的標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個(gè)質(zhì)量濃度水平重復(fù)3 次測(cè)定，分別計(jì)算加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。如表3所示，α-胡蘿卜素及β-胡蘿卜素加標(biāo)回收率分別為96%～112%、83.5%～103%，加標(biāo)回收率的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為2.67%～5.83%、4.90%～7.42%，能夠滿足檢測(cè)實(shí)際樣品需要。胡蘿卜凍干粉中α-胡蘿卜素及β-胡蘿卜素的譜圖如圖1所示。

圖1 胡蘿卜凍干粉中α-胡蘿卜素及β-胡蘿卜素譜圖Fig. 1 HPLC-UV chromatograms of α-carotene and β-carotene in freezedried carrot powder

2.4 植物源食品中胡蘿卜素含量的測(cè)定結(jié)果

2.4.1 水果中胡蘿卜素含量的測(cè)定結(jié)果

選取杏、西瓜、柿子、獼猴桃、蘋果和櫻桃6 種常見水果，用優(yōu)化方法同時(shí)測(cè)定α-胡蘿卜素及β-胡蘿卜素的含量，如表4所示，杏中的胡蘿卜素含量最高，總量達(dá)到3 000 μg/100 g以上，西瓜次之，櫻桃中的胡蘿卜素含量最低，低于30 μg/100 g。

表4 6 種水果中胡蘿卜素的含量Table4 Carotene contents of six fruits

2.4.2 蔬菜中胡蘿卜素含量的測(cè)定結(jié)果

表5 6 種蔬菜中胡蘿卜素的含量Table5 Carotene contents of six vegetables

選取辣椒、南瓜、番茄、西葫蘆、紅薯和油菜6 種常見蔬菜，用優(yōu)化方法同時(shí)測(cè)定α-胡蘿卜素及β-胡蘿卜素的含量，如表5所示，辣椒中胡蘿卜素含量最高，總量達(dá)到3 000 μg/100 g以上，南瓜次之，油菜中的胡蘿卜素含量最低，低于20 μg/100 g。

2.4.3 谷物中胡蘿卜素含量的測(cè)定結(jié)果

表6 6 種谷物中胡蘿卜素的含量Table6 Carotene contents of six cereals

選取大米、小米、藜麥、玉米面、黃豆和黑豆6 種常見谷物，用優(yōu)化方法同時(shí)測(cè)定α-胡蘿卜素及β-胡蘿卜素的含量，如表6所示，谷物中胡蘿卜素含量整體較低，總量均低于60 μg/100 g，可見，果蔬是胡蘿卜素的主要食物來源，谷物可以輔助提供胡蘿卜素的供給[29-30]。

2.4.4 植物油中胡蘿卜素含量的測(cè)定結(jié)果

表7 6 種植物油中胡蘿卜素的含量Table7 Carotene contents of six vegetable oils

選取紅棕櫚油、沙棘籽油、植物油、菜籽油、橄欖油和亞麻籽油6 種植物油，用優(yōu)化方法同時(shí)測(cè)定α-胡蘿卜素及β-胡蘿卜素的含量，如表7所示，紅棕櫚油中胡蘿卜素含量最高，總量近5 000 μg/100 g，亞麻籽油中胡蘿卜素含量最低，含量為160 μg/100 g，可見植物油中胡蘿卜素含量比較高。

2.4.5 茶中胡蘿卜素含量的測(cè)定結(jié)果

表8 6 種茶中胡蘿卜素的含量Table8 Carotene contents of six types of tea

選取辣木茶、黑茶、巖茶、古樹茶、桑葉茶和茶菊6 種茶類，用上述方法同時(shí)測(cè)定α-胡蘿卜素及β-胡蘿卜素的含量，如表8所示，茶中胡蘿卜素含量非常高，辣木茶和黑茶胡蘿卜素總量均在10 000 μg/100 g以上，其他茶中胡蘿卜素含量也在2 800 μg/100 g以上，只有茶菊中胡蘿卜素含量較低，為888 μg/100 g。

3 結(jié)論與討論

本實(shí)驗(yàn)利用高效液相色譜法建立了植物源食品中α-胡蘿卜素及β-胡蘿卜素的同時(shí)在線分析檢測(cè)，并以胡蘿卜凍干粉為樣品進(jìn)行了方法學(xué)驗(yàn)證，該方法線性良好，穩(wěn)定性好，回收率滿足分析要求。與目前常用方法相比，優(yōu)化了樣品前處理過程，縮短了分析時(shí)間。

姚建花等[31]報(bào)道，選用胡蘿卜、玉米、蜜橘、菠菜制備混樣，用直接溶劑提取法和皂化提取法進(jìn)行比較，結(jié)果顯示，α-胡蘿卜素和β-胡蘿卜素均為皂化提取效果更好，樣品經(jīng)皂化后，葉綠素已破壞，皂化可排除葉綠素干擾，皂化提取法適用于所有果蔬類樣品。張彩凌等[32]同時(shí)采用直接提取法和皂化提取法對(duì)β-胡蘿卜素進(jìn)行測(cè)定，并對(duì)2 種方法的結(jié)果進(jìn)行了比較，結(jié)果表明皂化不會(huì)影響β-胡蘿卜素含量測(cè)定，因此，本研究選用皂化提取法。

本實(shí)驗(yàn)用該方法測(cè)定了不同的水果、蔬菜、谷物、植物油、茶葉等植物源食品中α-胡蘿卜素及β-胡蘿卜素的含量，不同的植物源食品中二者含量差異較大，茶葉和植物油中胡蘿卜素含量普遍較高、果蔬中胡蘿卜素含量次之、谷物中胡蘿卜素含量較低，盡管谷物不是胡蘿卜素的主要提供者，但即使是低含量的谷物食物用該實(shí)驗(yàn)所建的方法也能檢測(cè)到，可見該方法靈敏度高，能夠?yàn)槠髽I(yè)研發(fā)、質(zhì)量控制和相關(guān)科學(xué)研究提供較為合適的方法保障，同時(shí)會(huì)給相關(guān)機(jī)構(gòu)和部門提供準(zhǔn)確的檢測(cè)方法和完備的技術(shù)支持。

本實(shí)驗(yàn)篩選了30 種常見植物源食品進(jìn)行研究，為后期營(yíng)養(yǎng)膳食數(shù)據(jù)庫(kù)的建立提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。絕大多數(shù)植物源食物中α-胡蘿卜素的含量小于β-胡蘿卜素，與文獻(xiàn)報(bào)道一致，只有南瓜中α-胡蘿卜素的含量高于β-胡蘿卜素。

本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可以為科研和實(shí)際應(yīng)用提供一定的理論數(shù)據(jù)和技術(shù)支持，但還不能完全反映出我國(guó)大量植物源食品中胡蘿卜素的含量及差異，日后還會(huì)繼續(xù)增大樣品量的研究，同時(shí)該數(shù)據(jù)可以為食物成分?jǐn)?shù)據(jù)庫(kù)的完善提供數(shù)據(jù)支持。

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