超高效液相色譜-質(zhì)譜法測(cè)定母乳中12 種低聚糖

陳新新，蘆 晶，劉 鷺，逄曉陽(yáng)，張書(shū)文，李 誠(chéng)*，呂加平,*

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，北京 100193；2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，四川 雅安 625014）

乳寡糖是母乳中主要營(yíng)養(yǎng)成分之一，成熟乳中低聚糖的質(zhì)量濃度為7～12 g/L，初乳中的質(zhì)量濃度更高，約為24 g/L[1]。低聚糖又稱寡糖，由2～10 個(gè)單糖通過(guò)糖苷鍵連接而成，構(gòu)成母乳的單糖主要有葡萄糖（glucose，Glc）、半乳糖（galactose，Gal）、巖藻糖（fucose，F(xiàn)uc）、N-乙酰葡萄糖胺（N-acetylglucosamine，GlcNAc）和N-乙酰神經(jīng)氨酸（N-acetylneuraminic，NeuAc）5 種，且母乳低聚糖均存在1 個(gè)由半乳糖和N-乙酰葡萄糖胺組成的核心結(jié)構(gòu)，其他糖單元通過(guò)不同的形式連接在周?chē)鷺?gòu)成了母乳低聚糖結(jié)構(gòu)的多樣性[2-3]。目前，已知的母乳低聚糖有200多種[4]。研究發(fā)現(xiàn)乳寡糖除了為新生兒提供營(yíng)養(yǎng)之外還具有重要的生物學(xué)作用[5-7]，其可以選擇性地促進(jìn)有益細(xì)菌如雙歧桿菌在腸道中的生長(zhǎng)，防止病原性細(xì)菌（例如痢疾桿菌、大腸桿菌等）的黏附，調(diào)節(jié)嬰幼兒的免疫系統(tǒng)，從而降低新生兒患疾病的風(fēng)險(xiǎn)[8-9]；近期也有研究發(fā)現(xiàn)酸性低聚糖對(duì)幼兒的大腦發(fā)育起著重要作用[10]。低聚糖的生理功能與結(jié)構(gòu)特征密切相關(guān)，因此了解低聚糖的結(jié)構(gòu)極其重要，而研究乳寡糖的結(jié)構(gòu)功能的前提是對(duì)乳寡糖進(jìn)行定性定量分析[8-11]。由于母乳低聚糖結(jié)構(gòu)復(fù)雜且存在多種同分異構(gòu)體，這使得乳寡糖的分離具有一定的難度[12]。目前對(duì)母乳低聚糖的定量研究較少，多側(cè)重于乳寡糖的定性和相對(duì)定量，建立一種母乳低聚糖的快速測(cè)定及定量方法具有重要意義。

目前常用的低聚糖分析方法主要有核磁法、高效液相色譜法和液相色譜-質(zhì)譜法等[13]。雖然核磁法在低聚糖的結(jié)果表征中起到重要作用，但由于所需樣品量大、分析較為復(fù)雜使其應(yīng)用受到局限[14-15]。近年來(lái)，高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法已成功用于低聚糖的分離、鑒定和單糖組成分析[16]。

本實(shí)驗(yàn)旨在建立一種母乳中12 種低聚糖的快速測(cè)定方法。通過(guò)對(duì)母乳進(jìn)行脫脂除蛋白前處理后，利用優(yōu)化好的超高效液相色譜條件使母乳中的12 種低聚糖得到了很好分離，并采用三重四極桿質(zhì)譜對(duì)其12 種母乳低聚糖成分實(shí)現(xiàn)了準(zhǔn)確定量。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

母乳 北京某醫(yī)院志愿者；母乳低聚糖標(biāo)準(zhǔn)品：2-巖藻糖乳糖（2-fucosyllactose，2FL）、3-巖藻糖乳糖（3-fucosyllactose，3F）、3-唾液酸乳糖（3-sialyllactose，3SL）、6-唾液酸乳糖（6-sialyllactose，6SL）、乳酰-N-巖藻五糖Ⅰ（lacto N-fucopentaoseⅠ，LNFPⅠ）、乳酰-N-巖藻五糖Ⅲ（lacto N-fucopentaose Ⅲ，LNFPⅢ）、乳酰-N-二巖藻六糖Ⅱ（lacto-N-difuco-hexaoseⅡ，LNDFHⅡ）、乳酰-N-己糖（lacto N-neohexaose，LNnH）、二唾液乳-N-四糖（disialyllacto-N-tetraose，DSLNT）、乳糖基四糖a（lactosialyl tetrasaccharide a，LSTa）、乳糖基四糖b（lactosialyl tetrasaccharide b，LSTb）、乳糖基四糖c（lactosialyl tetrasaccharide c，LSTc） 法國(guó)ElcitylOligoTech公司；乙腈（色譜純） 美國(guó)Fisher公司；甲酸銨（色譜級(jí)） 美國(guó)Sigma公司；無(wú)水乙醇（分析純） 北京化工廠。12 種母乳低聚糖具體結(jié)構(gòu)信息[17]見(jiàn)表1。

表1 12 種母乳低聚糖結(jié)構(gòu)Table1 Structures of 12 human milk oligosaccharides

1.2 儀器與設(shè)備

ACQUITY UPLC氨基色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm） 美國(guó)Waters公司；MVS-1渦旋混合器 北京金北德工貿(mào)有限公司；3K15離心機(jī) 美國(guó)Sigma公司；ZLS-4真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 湖南赫西儀器裝備有限公司；ULUP-IV-10T超純水裝置 西安優(yōu)普儀器設(shè)備有限公司；ME55精密電子天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；JD-3電子天平 沈陽(yáng)龍騰電子有限公司；MF50雪花制冰機(jī) 北京長(zhǎng)流科學(xué)儀器公司；1290系列超高效液相色譜-串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜儀美國(guó)Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

取所購(gòu)12 種母乳低聚糖標(biāo)準(zhǔn)品各1 mg，溶解于1 mL的超純水中，渦旋混勻后，得到質(zhì)量濃度1mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液，存放-80 ℃?zhèn)溆?。由?2 種母乳低聚糖在母乳樣品中含量差別較大，通過(guò)閱讀文獻(xiàn)，將12 種母乳低聚糖標(biāo)準(zhǔn)品分為兩部分做標(biāo)準(zhǔn)曲線[18-19]。

取2FL、3FL各10 μL，加入80 μL超純水，此時(shí)2 種標(biāo)準(zhǔn)品的混標(biāo)質(zhì)量濃度為100 mg/L，取此混合標(biāo)樣逐級(jí)稀釋?zhuān)蝗?SL、6SL、LNFPⅠ、LNFPⅢ、LNDFHⅡ、DSLNT、LNnH、LSTa、LSTb、和LSTc各5 μL，加入50 μL的超純水混勻，此時(shí)該10 種標(biāo)準(zhǔn)品的混標(biāo)質(zhì)量濃度為50 mg/L，取此混合樣逐級(jí)稀釋成不同的質(zhì)量濃度，如表2所示。

表2 12 種標(biāo)準(zhǔn)品溶液的質(zhì)量濃度Table2 Concentrations of 12 standard oligosaccharide solutions

1.3.2 母乳低聚糖的提取

獲得母乳低聚糖的關(guān)鍵在于除蛋白，目前最常用的脫除蛋白方法有乙醇沉淀法和乙腈沉淀法[20-21]。2 種實(shí)驗(yàn)方法具體如下：

取母乳樣品5 mL，6 000 r/min、4 ℃離心10 min后，去除上層脂肪，然后將乳液裝入特定規(guī)格的超高速離心管，（1×105）×g、4 ℃超高速離心90 min，離心后，乳樣分為兩部分，乳寡糖位于上清液中，底部沉淀為酪蛋白，獲取上清液，加入2 倍體積的無(wú)水乙醇，4 ℃放置4 h，10 000 r/min、4 ℃離心10 min后取上清液，此操作重復(fù)2 次后真空濃縮至干，然后加入超純水稀釋過(guò)膜后用于檢測(cè)[22]。

取母乳樣品500 μL，加入等體積的超純水，6 000 r/min、4 ℃離心10 min后，去除上層脂肪，取下層清液加入1.5 mL的乙腈，渦旋混勻后超聲5 min，在10 000 r/min、4 ℃離心10 min后取上清液，此操作重復(fù)2 次，稀釋后即可用來(lái)上樣。

1.3.3 高效相色譜條件

ACQUITY UPLC氨基色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；柱溫50 ℃；流速0.3 mL/min；流動(dòng)相A為10 mmol/L的甲酸銨溶液，流動(dòng)相B為乙腈；獲得最優(yōu)流動(dòng)相條件：0～10 min，95%～75% B；10～15 min，75% B；15～20 min，75%～65% B；20～21 min，65%～10% B；21～24min，10% B；24～25 min，10%～95% B；25～35min，95% B。

1.3.4 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源；正離子掃描；干燥氣體溫度150 ℃，干燥氣體流速16 L/min；霧化器壓力35 psi；毛細(xì)管電壓3 kV；保溫氣體溫度300 ℃；保溫氣體流速12 L/min。

2 結(jié)果與分析

2.1 前處理方法的選擇

圖1 不同前處理方法母乳低聚糖總離子流圖Fig. 1 Total ion current chromatograms of human milk oligosaccharides with different pretreatment methods

用2 種不同的前處理方式處理后的母乳樣品，按照優(yōu)化好的超高效液相色譜-質(zhì)譜條件進(jìn)樣測(cè)定，檢測(cè)結(jié)果如圖1所示。由于乙醇沉淀法采用旋干后加超純水復(fù)溶，去除了乙醇的溶劑效應(yīng)，故對(duì)比2 種前處理方法后母乳低聚糖總離子流圖的響應(yīng)值即可確定最優(yōu)前處理方法。圖1a用乙腈前處理的母乳低聚糖的響應(yīng)值為4.4×106，明顯高于圖1b用乙醇處理后的母乳樣品低聚糖的響應(yīng)值，約為2.2×106，通過(guò)后臺(tái)對(duì)比峰面積可知用乙醇沉淀蛋白時(shí)低聚糖的損失量較大（低聚糖通過(guò)峰面積來(lái)定量），因此，本實(shí)驗(yàn)采用乙腈沉淀法作為母乳蛋白質(zhì)的脫除方法。

2.2 質(zhì)譜條件的確定

2.2.1 全離子掃描結(jié)果

Scan type 選擇MS2scan，分別對(duì)12 種母乳標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行母離子全掃描，如表3所示，在正離子模式下12 種低聚糖均出現(xiàn)加鈉母離子峰[23-24]。

2.2.2 子離子掃描結(jié)果

在Scan Type選擇Product Ion，對(duì)12 種母乳低聚糖標(biāo)準(zhǔn)品的加鈉母離子做子離子掃描，以獲得12種低聚糖的離子對(duì)，掃描結(jié)果見(jiàn)表4。由于糖本身并不容易裂解，12 種低聚糖均找到一個(gè)響應(yīng)較好的子離子。

表4 12 種母乳低聚糖標(biāo)準(zhǔn)品子離子掃描結(jié)果Table4 Results of product ion scanning of 12 breast milk oligosaccharides

2.2.3 MRM優(yōu)化結(jié)果

表5 12 種母乳低聚糖標(biāo)準(zhǔn)品多反應(yīng)監(jiān)測(cè)優(yōu)化結(jié)果Table5 Results of MRM optimization for 12 oligosaccharides in breast milk

對(duì)已經(jīng)找到的12 種母乳低聚糖標(biāo)準(zhǔn)品的離子對(duì)進(jìn)行碰撞能量的優(yōu)化，優(yōu)化結(jié)果見(jiàn)表5。2FL、3FL、3SL、6SL、LNFPⅠ、LNFPⅢ、LNDFHⅡ、DSLNT、LNnH、LSTa、LSTb、LSTc 12種母乳低聚糖標(biāo)準(zhǔn)品多反應(yīng)監(jiān)測(cè)最優(yōu)碰撞能量分別為40、38、35、34、58、67、46、34、67、43、40、34 V。

2.3 超高效液相色譜條件的確定

將12 種母乳低聚糖標(biāo)準(zhǔn)品配成5 mg/L混標(biāo)用于液相條件優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。根據(jù)Amide氨基柱的特點(diǎn)（有機(jī)相不低于50%），初步設(shè)定流動(dòng)相條件為：A為10 mmol/L甲酸銨，B為乙腈，流速為0.3 mL/min。采用梯度洗脫，0～40 min，95%～65% B，12 種母乳低聚糖混標(biāo)的總離子流圖見(jiàn)圖2a。根據(jù)之前優(yōu)化牛乳低聚糖獲得的分離經(jīng)驗(yàn)[13]，在圖2a的基礎(chǔ)上進(jìn)行液相條件的不斷優(yōu)化，實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明改變進(jìn)樣時(shí)間對(duì)低聚糖的分離影響不大，故從流動(dòng)相的配比上進(jìn)行優(yōu)化，通過(guò)改變梯度和走等度，獲得最優(yōu)梯度條件：0～10 min，95%～75% B；10～15 min，75% B；15～20 min，75%～65% B；20～21 min，65%～10% B；21～24 min，10% B；24～25 min，10～95% B；25～40 min，95% B，最優(yōu)梯度條件下12 種母乳低聚糖混標(biāo)的總離子流圖見(jiàn)圖2b。

圖2 母乳低聚糖在不同流動(dòng)相條件下的總離子流圖Fig. 2 Total ion current chromatograms of human milk oligosaccharides under different mobile phase conditions

由圖2可以看出，圖2a中12 種母乳低聚糖并沒(méi)有得到分離，而圖2b中12 種低聚糖則得到了很好分離，且從后臺(tái)提取12 種低聚糖的質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測(cè)圖譜，同分異構(gòu)體均得到分離，該梯度條件下，可用于12 種母乳低聚糖的測(cè)定分析。

2.4 回歸方程及精密度結(jié)果

將稀釋好的不同質(zhì)量濃度的母乳低聚糖標(biāo)準(zhǔn)品按優(yōu)化好的條件進(jìn)樣分析，樣品的質(zhì)量濃度設(shè)為自變量X（mg/mL），色譜峰的峰面積Y設(shè)定為因變量，獲得12 種低聚糖標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程、線性相關(guān)系數(shù)以及其線性范圍。按所述超高效液相色譜檢測(cè)條件連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣檢測(cè)（n＝3），根據(jù)物質(zhì)的色譜峰峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）來(lái)評(píng)價(jià)儀器的精密度，如表6所示。12 種母乳低聚糖標(biāo)準(zhǔn)品在設(shè)定的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系（R2＞0.98）。超高效液相色譜分析檢測(cè)方法精密度良好，12 種糖類(lèi)成分重復(fù)進(jìn)樣分析的RSD均控制在10%以內(nèi)。

表6 12 種母乳低聚糖標(biāo)準(zhǔn)品回歸方程Table6 Regression equations for 12 breast oligosaccharide

2.5 加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表7 12 種母乳低聚糖標(biāo)準(zhǔn)品回收率檢測(cè)結(jié)果Table7 Recovery of 12 breast milk oligosaccharides from spiked samples

做加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)評(píng)估方法的準(zhǔn)確度。取母乳200 μL進(jìn)行前處理后，并按照優(yōu)化好的檢測(cè)條件對(duì)其中的12 種低聚糖成分進(jìn)行定量分析，獲得不加標(biāo)樣品分析結(jié)果。然后取同一母乳樣200 μL（每份樣品重復(fù)3 次），根據(jù)測(cè)得的各低聚糖成分實(shí)際含量水平加標(biāo)[25-26]，并進(jìn)行樣品檢測(cè)，12 種母乳低聚糖的加標(biāo)回收結(jié)果見(jiàn)表7。不同添加量條件下，12 種母乳低聚糖的添加回收率均在80%～120%之間，樣品前處理方法的準(zhǔn)確性用RSD表示，且實(shí)驗(yàn)所得12 種低聚糖的RSD值均小于10%。因此，本實(shí)驗(yàn)所建立的方法可以用母乳中12 種低聚糖的檢測(cè)分析[27]。

2.6 母乳低聚糖的測(cè)定結(jié)果

圖3 母乳低聚糖總離子流圖Fig. 3 Total ion current chromatogram of oligosaccharides in real breast milk sample

表8 成熟母乳中低聚糖測(cè)定結(jié)果Table8 Results of determination of oligosaccharides in mature human milk

對(duì)志愿者提供的成熟母乳進(jìn)行前處理后按照建立的測(cè)定方法進(jìn)行12 種低聚糖成分的測(cè)定，為減少實(shí)驗(yàn)誤差，同1 份母乳樣品測(cè)定3 次求平均值。母乳低聚糖的總離子流圖見(jiàn)圖3，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表8。通過(guò)閱讀大量文獻(xiàn)對(duì)12 種母乳低聚糖的質(zhì)量濃度范圍進(jìn)行了總結(jié)，從母乳低聚糖的實(shí)驗(yàn)測(cè)定結(jié)果來(lái)看，12 種低聚糖的RSD均小于10%，且測(cè)定結(jié)果均在參考文獻(xiàn)范圍之內(nèi)。12 種母乳低聚糖中2FL的質(zhì)量濃度最高，與魏京華等[21]的結(jié)果一致。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)所建立的12 種母乳低聚糖的測(cè)定方法，前處理過(guò)程簡(jiǎn)單且所需樣品量少，12 種低聚糖標(biāo)準(zhǔn)品在設(shè)定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)均線性良好（R2＞0.98），添加回收率均在80%～120%之間，實(shí)驗(yàn)重復(fù)性和儀器精密度較好。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)方法簡(jiǎn)單可行，可在短時(shí)間內(nèi)對(duì)母乳中的12 種低聚糖進(jìn)行準(zhǔn)確的定性定量分析。

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