響應(yīng)面法優(yōu)化木聚糖酶和α-葡萄糖醛酸酶聯(lián)合水解樺木木聚糖工藝

董媛媛，李亞賢，沈藝紅，薛業(yè)敏*

（南京師范大學(xué)金陵女子學(xué)院，江蘇 南京 210097）

自然界中半纖維素是最豐富的多聚物，植物的莖干、種子、果殼等部分含有大量的半纖維素，如在針葉樹(shù)中其含量占細(xì)胞壁干質(zhì)量的10%～15%，闊葉樹(shù)中為18%～23%，禾草類中為20%～25%[1]。木聚糖是植物半纖維素的主要成分[2-3]，是自然界中除纖維素之外含量最豐富的多糖[4]。木聚糖是一種多聚五碳糖，大多以β-1,4糖苷鍵[5]連接形成主鏈，主鏈上連有4-O-甲基葡萄糖醛酸或L-阿拉伯呋喃糖側(cè)枝結(jié)構(gòu)[6-7]。自然界中大多數(shù)木聚糖均未被利用，造成很大的資源浪費(fèi)。如果合理開(kāi)發(fā)利用，不僅可以減少污染，而且能夠變廢為寶，實(shí)現(xiàn)資源的可持續(xù)循環(huán)利用[8]。

低聚木糖主要包括木二糖、木三糖和木四糖[9]，作為一種新興的保健產(chǎn)品，具有用量低、難消化、穩(wěn)定性高和對(duì)雙歧桿菌的高選擇性增殖效果等優(yōu)點(diǎn)，近年來(lái)在食品、藥品等行業(yè)被廣泛應(yīng)用[10-11]。由于傳統(tǒng)化學(xué)法存在著能耗高、產(chǎn)率低和污染嚴(yán)重等問(wèn)題，使得具有反應(yīng)條件溫和、效率高、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)的酶法水解木聚糖制備低聚木糖具有重要的工業(yè)應(yīng)用意義[12-13]。木聚糖結(jié)構(gòu)復(fù)雜，完全降解木聚糖需要多種木聚糖降解酶的協(xié)同作用，包括β-1,4內(nèi)切木聚糖酶、β-木糖苷酶和側(cè)枝酶α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶、α-葡萄糖醛酸酶等[14-16]。其中，β-1,4內(nèi)切木聚糖酶和β-木糖苷酶（統(tǒng)稱為木聚糖酶）作為降解木聚糖主要的酶系已被廣泛研究，但是當(dāng)利用單一木聚糖酶水解這類木聚糖制備低聚木糖時(shí)，α-葡萄糖醛酸側(cè)枝則對(duì)木聚糖酶的作用產(chǎn)生空間屏障，使得木聚糖酶不能結(jié)合和分解鄰近這些側(cè)枝的木聚糖，不僅影響酶法水解的效率，而且影響低聚木糖的質(zhì)量。國(guó)內(nèi)外對(duì)木聚糖酶水解木聚糖產(chǎn)生低聚木糖的研究較多，趙力超等[17]研究發(fā)現(xiàn)重組多功能木聚糖酶加酶量900 U/mL、底物質(zhì)量濃度110 mg/mL、反應(yīng)時(shí)間80 min的條件下，酶解木聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為54.7%的蔗渣半纖維素，得到的還原糖質(zhì)量濃度為4.23 mg/mL。黃家驥等[18]研究發(fā)現(xiàn)在pH 7.6、反應(yīng)溫度40 ℃、加酶量800 U/g、水解時(shí)間12 h的條件下，以木聚糖酶水解自制玉米芯木聚糖產(chǎn)生的還原糖質(zhì)量濃度為8.58 mg/mL。Boonchuay等[19]研究發(fā)現(xiàn)先用KOH預(yù)處理玉米芯，然后在酶含量129.43 U/g、53.80 ℃和pH 6.17的條件下進(jìn)行酶解反應(yīng)，還原糖產(chǎn)量為162.97 mg/g。但是木聚糖酶和葡萄糖醛酸酶聯(lián)合作用于木聚糖生產(chǎn)低聚木糖的研究相對(duì)較少。為了提高低聚木糖的產(chǎn)量，本課題組前期構(gòu)建了共生產(chǎn)木聚糖酶和葡萄糖醛酸酶工程菌[20]，并對(duì)重組菌產(chǎn)酶水平進(jìn)行了優(yōu)化，使其產(chǎn)酶水平達(dá)到最高，并發(fā)現(xiàn)在低聚木糖的制備中，雙酶在相同的條件下相比單酶能夠徹底快速地水解樺木木聚糖產(chǎn)生木寡糖，酶解產(chǎn)物中木二糖含量及純度更高。低聚木糖，尤其是木二糖，具有顯著的雙歧桿菌增殖能力、不被消化性、無(wú)齲齒性以及促進(jìn)人體對(duì)鈣吸收等特性。

近年來(lái)，響應(yīng)面法[21]已成為建立數(shù)學(xué)模型的一種有效工具，可以用來(lái)優(yōu)化多因素試驗(yàn)并評(píng)估幾種因素之間的影響。通過(guò)響應(yīng)面法不僅可以從少量的實(shí)驗(yàn)中獲得大量的信息，而且可以觀察到單個(gè)因素之間的相互影響。響應(yīng)面法已被廣泛應(yīng)用于優(yōu)化各種因素的試驗(yàn)中，如優(yōu)化草魚內(nèi)臟蛋白質(zhì)的水解條件[22]等。因此，本研究利用重組木聚糖酶和葡萄糖醛酸酶共同水解樺木木聚糖制備低聚木糖，應(yīng)用響應(yīng)面法優(yōu)化木聚糖的水解條件，以期提高低聚木糖的產(chǎn)量。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 質(zhì)粒

含有海棲熱袍菌（Thermotoga maritima MSB8）木聚糖酶B（xylanase，XynB）和葡萄糖醛酸酶（glucuronidase，AguA）基因的共表達(dá)質(zhì)粒pET-28a-T7-xynB-Hsh-aguA（以下簡(jiǎn)稱為pET-28a-XPA）由本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建保存。大腸桿菌Escherichia coli JM109（DE3）（Promega）作為目的基因的表達(dá)宿主。

1.1.2 培養(yǎng)基

TB培養(yǎng)基（1 L）：900 mL去離子水中加入胰蛋白胨12 g、酵母提取物24 g、甘油4 mL，搖勻，高溫滅菌20 min，冷卻至60 ℃以下，加入100 mL無(wú)菌0.17 mol/L KH2PO4、0.72 mol/L K2HPO4溶液。

1.1.3 試劑

樺木木聚糖、咪唑 美國(guó)Sigma公司；正丁醇、冰乙酸、乙醇（均為分析純） 南京寧氏試劑公司；鄰苯二甲酸氫鉀 成都市科龍化工試劑廠；濃硫酸 南京化學(xué)試劑一廠；GF-254硅膠板 山東江友硅膠開(kāi)發(fā)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

分光光度計(jì) 日本Unico公司；HH-S2數(shù)顯恒溫水浴鍋 金壇市醫(yī)療儀器廠；臺(tái)式離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；層析缸 南京丁貝生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 重組菌E. coli JM109（DE3）/pET-28a-XPA產(chǎn)酶

將重組質(zhì)粒pET-28a-XPA轉(zhuǎn)入E. coli JM109（DE3）中，挑取單菌落接入含有Kan抗性的TB培養(yǎng)液中，37 ℃、220 r/min培養(yǎng)過(guò)夜，以1.5%種子液接入含相同抗生素的新鮮TB培養(yǎng)液中，30 ℃振蕩培養(yǎng)至OD600nm約為2.0時(shí)，加入異丙基硫代半乳糖苷（isopropyl thiogalactoside，IPTG）至終濃度為0.8 mmol/L，并升溫至42 ℃繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)。加入誘導(dǎo)劑后，每隔一定時(shí)間取出一支菌液在600 nm波長(zhǎng)處測(cè)定OD值判定菌體的生長(zhǎng)速率，并取菌液1 mL離心收集的菌體，用400 μL 50 mmol/L鄰苯咪唑緩沖液（pH 6.2）重懸，超聲波破碎，離心取上清液檢測(cè)胞內(nèi)XynB和AguA表達(dá)量。

1.3.2 酶活性測(cè)定

XynB和AguA酶活性檢測(cè)方法分別參考文獻(xiàn)[23]和[24]。

1.3.3 單因素試驗(yàn)

以樺木木聚糖為底物恒溫水浴振蕩進(jìn)行酶解反應(yīng)，以還原糖釋放量為指標(biāo)，采用單因素試驗(yàn)，探討混合酶添加量、酶解時(shí)間、pH值、酶解溫度和底物質(zhì)量濃度對(duì)樺木木聚糖酶解的影響。其中混合酶XynB/AguA添加量分別為20/3、40/6、60/9、80/12、100/15、150/22.5、200/30 U/g（雙酶液添加量記為XynB/AguA）；酶解反應(yīng)時(shí)間為0.5、1、2、4、6、8、10 h；pH值為5.8、6.2、6.6、7.0、7.4、7.8、8.2；酶解溫度為60、70、80、90、95 ℃；底物質(zhì)量濃度為1、2、4、6、8 g/100 mL。酶解結(jié)束后將酶解液在100 ℃水浴中滅酶10 min，酶解液經(jīng)5 000×g離心10 min得上清液，用3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）法測(cè)定還原糖含量，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。同時(shí)取4 μL上清液用于薄層色譜（thin layer chromatography，TLC）分析。

1.3.4 DNS法檢測(cè)還原糖

1.3.4.1 DNS試劑的配制

稱?。?0±0.1）g DNS溶于600 mL水中，逐漸加入10 g NaOH，50 ℃水浴磁力攪拌溶解，然后依次加入200 g酒石酸鉀鈉，2 g重蒸苯酚和0.5 g無(wú)水亞硫酸鈉，待全部溶解并澄清后，冷卻至室溫，用水定容至1 000 mL，過(guò)濾，貯存于棕色試劑瓶中，暗處放置7 d后使用。

1.3.4.2 DNS比色法測(cè)定

取80 μL酶解液加入DNS試劑60 μL，煮沸5 min，冰水冷卻，加860 μL水，混勻，在520 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。用10 mg/mL的木糖溶液作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出酶解后還原糖的含量。

1.3.5 TLC檢測(cè)法

展層劑為正丁醇-乙酸-水體積比2∶1∶1，顯色劑為濃硫酸-甲醇體積比1∶4。采用硅膠板，點(diǎn)樣量4 μL，105 ℃加熱5 min顯色。

1.3.6 高效液相色譜法檢測(cè)酶解產(chǎn)物

采用YWG-NH2氨基合固定相不銹鋼色譜柱（4.6 mm×250 mm，10 μm）；檢測(cè)器為515示差折光檢測(cè)器；流動(dòng)相為乙腈-水體積比70∶30；流速2 mL/min；柱溫為室溫；酶解產(chǎn)物在進(jìn)樣之前經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾。

1.3.7 樺木木聚糖酶解的響應(yīng)面試驗(yàn)

在酶解單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取底物質(zhì)量濃度（X1）、pH值（X2）、酶解溫度（X3）為影響因素，以還原糖釋放量作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用三因素三水平Box-Behnken模型進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化，試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平如表1所示。采用Design-Expert 7.0軟件，對(duì)響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

表1 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平Table1 Level and code of independent variables used for Box-Behnken design

2 結(jié)果與分析

2.1 不同誘導(dǎo)時(shí)間下XynB和AguA的產(chǎn)量

由圖1可知，隨著誘導(dǎo)時(shí)間的不斷延長(zhǎng)XynB的酶活力變化不大，在誘導(dǎo)8 h時(shí)活性達(dá)到最大10.4 U/mL，比活力達(dá)到6.639 U/mg；隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)，AguA的酶活力不斷上升，當(dāng)誘導(dǎo)8 h時(shí)酶活力達(dá)到最高1.6 U/mL，比活力為1.093 U/mg，8 h后AguA的酶活力有所下降；加入誘導(dǎo)劑IPTG后菌體的生長(zhǎng)速率明顯減慢，這是因?yàn)镮PTG有一定的毒性，抑制了菌體的快速生長(zhǎng)[14]。因此選擇8 h為誘導(dǎo)時(shí)間，制備XynB和AguA的雙酶液用于樺木木聚糖的水解實(shí)驗(yàn)。

圖1 不同誘導(dǎo)時(shí)間下混合酶的活力和比活力Fig. 1 Effect of induction time on XynB/AguA and activities and specific activities produced by the engineered strain

2.2 XynB和AguA對(duì)樺木木聚糖水解作用的影響

2.2.1 加酶量對(duì)樺木木聚糖水解作用的影響

在底物質(zhì)量濃度1 g/100 mL、pH 6.6、酶解溫度80 ℃、酶解時(shí)間8 h條件下，XynB/AguA加酶量分別為20/3、40/6、60/9、80/12、100/15、150/22.5、200/30 U/g，研究加酶量對(duì)樺木木聚糖水解的影響。

圖2 加酶量對(duì)水解樺木木聚糖的還原糖釋放量的影響（A）和TLC圖（B）Fig. 2 Effect of enzyme dosage on reducing sugar concentration in xylan hydrolysates (A) and TLC profiles of hydrolysates (B)

由圖2A可知，酶解所釋放的還原糖量隨著酶量增加而增多，XynB加酶量超過(guò)60 U/g時(shí)，還原糖釋放量趨于平緩；由圖2B可知，隨著酶量的增加木糖及木二糖含量逐漸增加，XynB/AguA加酶量為60/9 U/g時(shí)，還原糖釋放量可達(dá)到0.61 mg/mL，加酶量超過(guò)60/9 U/g時(shí)，木寡糖含量基本無(wú)變化。這種現(xiàn)象與張根生等[25]在響應(yīng)面法優(yōu)化雙酶酶解酪蛋白工藝的結(jié)果一致?？紤]到低聚木糖產(chǎn)量及生產(chǎn)成本，選擇復(fù)合酶加酶量為XynB 60U/g、AguA 9 U/g。

2.2.2 酶解時(shí)間對(duì)樺木木聚糖水解作用的影響

圖3 酶解時(shí)間對(duì)水解樺木木聚糖的還原糖釋放量的影響（A）和TLC圖（B）Fig. 3 Effect of hydrolysis time on reducing sugar concentration in xylan hydrolysates (A) and TLC profiles of hydrolysates (B)

由圖3A可知，不同酶解時(shí)間下還原糖釋放量差距并不明顯，說(shuō)明初始酶解效率較高，能夠高效地將木聚糖充分酶解為木糖和木二糖，酶解4 h時(shí)，還原糖釋放量達(dá)到0.622 mg/mL；由圖3B可知，酶解4 h后，低聚木糖總量不再增加，木糖及木二糖產(chǎn)量變化趨緩。Boonchuay等[19]研究發(fā)現(xiàn)來(lái)源于嗜熱菌Streptomyces thermovulgaris TISTR1948的木聚糖酶，在使用KOH預(yù)處理，53.80 ℃和pH 6.17的條件下，水解玉米芯的最佳時(shí)間為12 h，而本實(shí)驗(yàn)所需的酶解時(shí)間為4 h。這可能是由于木聚糖酶來(lái)源不同，酶解底物不同，也可能因?yàn)楸緦?shí)驗(yàn)采用的是XynB和AguA的雙酶液進(jìn)行酶解使酶解時(shí)間縮短為4 h。

2.2.3 pH值對(duì)樺木木聚糖水解作用的影響

由圖4A可知，pH值對(duì)酶解效率有著極顯著的影響。在pH 7.8時(shí)還原糖釋放量達(dá)到最高1.44 mg/mL，圖4B也顯示木二糖含量最高，在pH值大于7條件下酶解液中幾乎只有木糖和木二糖的存在，pH值達(dá)到8.2時(shí)，木寡糖種類幾乎無(wú)變化，但是還原糖釋放量和木二糖的含量略有減少。反應(yīng)體系的pH值是影響木聚糖酶和葡萄糖醛酸酶活力的關(guān)鍵因素，當(dāng)反應(yīng)體系的pH值大于8.2或小于7.4時(shí)，酶解產(chǎn)物的平均聚合度較大，低聚木糖得率和純度降低。這可能是由于酶的空間構(gòu)象受pH值的影響，從而使酶的活性受到影響[25]。

圖4 pH值對(duì)水解樺木木聚糖的還原糖釋放量的影響（A）和TLC圖（B）Fig. 4 Effect of pH on reducing sugar concentration in xylan hydrolysates (A) and TLC profiles of hydrolysates (B)

2.2.4 酶解溫度對(duì)樺木木聚糖水解作用的影響

圖5 酶解溫度對(duì)水解樺木木聚糖的還原糖釋放量的影響（A）和TLC圖（B）Fig. 5 Effect of hydrolysis temperature on reducing sugar concentration in xylan hydrolysates (A) and TLC profiles of hydrolysates (B)

由圖5A可知，酶解溫度對(duì)酶解效率有著較顯著的影響。在80 ℃時(shí)還原糖釋放量達(dá)到最高為1.57 mg/mL，超過(guò)80 ℃時(shí)，還原糖釋放量趨于平緩；由圖5B可知，隨著溫度的升高，低聚木糖含量也顯著增高，到80 ℃時(shí)，木聚糖幾乎全被降解為木糖和木二糖。高溫下有利于木聚糖的徹底水解，當(dāng)溫度低于最適反應(yīng)溫度時(shí)，木聚糖酶和葡萄糖醛酸酶活力受到一定抑制，酶解速率較低，低聚木糖得率也較低，溫度過(guò)高不利于酶活力穩(wěn)定性的保持。一般來(lái)說(shuō)，反應(yīng)溫度對(duì)酶解效果的影響是多方面的，在一定范圍內(nèi)，升高溫度可以加快酶-底物中間體分解轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物的速度，然而溫度過(guò)高會(huì)降低酶的穩(wěn)定性，使其失去活性，最終影響酶的酶解效果[26-27]。

2.2.5 底物質(zhì)量濃度對(duì)樺木木聚糖水解作用的影響

圖6 底物質(zhì)量濃度對(duì)水解樺木木聚糖的還原糖釋放量的影響（A）和TLC圖（B）Fig. 6 Effect of substrate concentration on reducing sugar concentration in xylan hydrolysates (A) and TLC profiles of hydrolysates (B)

由圖6A可知，隨著底物質(zhì)量濃度的增加，還原糖釋放量幾乎隨底物質(zhì)量濃度呈直線上升。還原糖釋放量在底物質(zhì)量濃度4 g/100 mL時(shí)達(dá)到最大，為17.45 mg/mL，圖6B也可清晰地顯示，在底物質(zhì)量濃度為4 g/100 mL時(shí)，木二糖的含量最高。在低底物質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，低聚木糖組分主要為木二糖和少量木糖，當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量濃度上升至6 g/100 mL時(shí)，還原糖釋放量有所下降，低聚木糖的比例減少。這可能是因?yàn)殡S著底物質(zhì)量濃度的增加，低聚合度木寡糖發(fā)生轉(zhuǎn)糖苷反應(yīng)生成了高聚合度木寡糖。

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果與分析

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table2 Box-Behnken design with experimental values of reducing sugar concentration

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取底物質(zhì)量濃度、pH值、酶解溫度3 個(gè)因素，設(shè)計(jì)三因素三水平試驗(yàn)。以底物質(zhì)量濃度（X1）、pH值（X2）、酶解溫度（X3）為自變量，以還原糖釋放量為響應(yīng)值，試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見(jiàn)表2。

利用Design-Expert 7.0軟件對(duì)表2數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，其中第2、5、8、9、12組試驗(yàn)為5次重復(fù)的中心點(diǎn)，用于估算試驗(yàn)誤差，其他為析因試驗(yàn)。得到底物質(zhì)量濃度（X1）、pH值（X2）、酶解溫度（X3）的二次多項(xiàng)回歸模型：

Y=-561.1＋113.14X1＋10.56X2＋2.6X3＋0.04X1X2＋7.5×10-4X1X3＋3.4×10-3X2X3-1.1-7.17-0.016

表3 回歸模型顯著性檢驗(yàn)結(jié)果Table3 Analyses of variance (ANOVA) of regression model and significance test

從表3可知，酶解條件對(duì)還原糖釋放量的影響所建立的回歸模型差異極顯著（P＝0.000 1），說(shuō)明該回歸方程因變量與全體自變量的相關(guān)關(guān)系是顯著的，即這種試驗(yàn)方法是可靠的。失擬項(xiàng)P值大于0.05，差異不顯著，可以用該回歸方程對(duì)不同酶解條件下的還原糖釋放量進(jìn)行檢測(cè)。底物質(zhì)量濃度、pH值、酶解溫度二次方差異均極顯著（P＜0.000 1）；底物質(zhì)量濃度和pH值影響差異極顯著。由3 個(gè)因素的F值以及多項(xiàng)式系數(shù)絕對(duì)值大小可知，對(duì)還原糖釋放量影響顯著性順序依次為底物質(zhì)量濃度＞pH值＞酶解溫度。

根據(jù)回歸模型作出兩因素交互作用的響應(yīng)面，如圖7所示。

圖7 混合酶液水解樺木木聚糖響應(yīng)面圖Fig. 7 Response surface plots showing the interactive effects of variables on reducing sugar concentration of hydrolysates

由圖7a可知，沿底物質(zhì)量濃度軸向等高線更為密集，說(shuō)明還原糖釋放量對(duì)底物質(zhì)量濃度的變化比對(duì)pH值的變化更為敏感，兩因素的交互作用不顯著。

由圖7b可知，底物質(zhì)量濃度影響比酶解溫度顯著，曲面相對(duì)陡峭。沿底物質(zhì)量濃度軸向等高線更為密集，說(shuō)明底物質(zhì)量濃度對(duì)還原糖釋放量的影響變化敏感。

由圖7c可知，pH值影響極顯著，曲面較陡，酶解溫度對(duì)還原糖釋放量的影響不太顯著，曲面相對(duì)緩和。沿pH值軸向等高線密集，而溫度軸向等高線相對(duì)稀疏，說(shuō)明還原糖釋放量對(duì)pH值的變化比對(duì)酶解溫度的變化更為敏感，兩因素的交互作用不顯著。

對(duì)回歸方程取一階偏導(dǎo)數(shù)等于零，聯(lián)立解方程組，換算成試驗(yàn)條件，得到最優(yōu)條件為底物質(zhì)量濃度4.2 g/100 mL、pH 7.65、酶解溫度80.66 ℃，預(yù)計(jì)最大還原糖釋放量為18.04 mg/mL。為檢測(cè)模型預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性，在優(yōu)化條件下進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，實(shí)際釋放量17.82 mg/mL非常接近預(yù)測(cè)值，在允許的誤差范圍之內(nèi)。

2.4 XynB和AguA水解木聚糖的反應(yīng)歷程

在底物質(zhì)量濃度4.2 g/100 mL、pH 7.65、酶解溫度80.66 ℃、XynB/AguA加酶量60/9 U/g的條件下，選取10 min～12 h的酶解時(shí)間，觀察酶解過(guò)程中木寡糖產(chǎn)生速率的變化。

由圖8可知，酶解時(shí)間在10 min～4 h范圍內(nèi)，隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，還原糖釋放量也隨之增加，在4～12 h范圍內(nèi)，隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，酶解得率幾乎不變。這一結(jié)果表明，在較短的時(shí)間內(nèi)，延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間有助于提高酶解率，但進(jìn)一步增加酶解時(shí)間，酶解速度逐漸放緩，說(shuō)明反應(yīng)在后期存在產(chǎn)物抑制等不利因素的影響。木糖濃度越高，越不利于低聚木糖的積累，當(dāng)酶解4 h時(shí)，還原糖釋放量達(dá)到17.91mg/mL，木二糖質(zhì)量濃度為13.66 mg/mL。較劉明啟等[28]研究的黑曲霉木聚糖酶酶解樺木木聚糖所得低聚木糖產(chǎn)物木糖至木六糖成分更高，還原糖釋放量在酶解4 h時(shí)即可達(dá)到1.6 mg/mL左右，相比其酶解24 h后木二糖質(zhì)量濃度的1.599 mg/mL效率也更高。優(yōu)化前酶解8 h還原糖釋放量?jī)H為0.61 mg/mL，優(yōu)化后酶解4 h還原糖釋放量高達(dá)17.91 mg/mL，還原糖釋放量比優(yōu)化前提高了近30 倍。這說(shuō)明底物質(zhì)量濃度、pH值、酶解溫度等條件對(duì)酶解反應(yīng)影響較大，通過(guò)優(yōu)化反應(yīng)條件不僅可以縮短反應(yīng)歷程而且還可以大大提高還原糖釋放量，這對(duì)于工業(yè)生產(chǎn)有極大的意義，為進(jìn)一步研究工業(yè)化酶反應(yīng)提供參考。

圖8 XynB和AguA水解歷程的還原糖釋放量（A）和TLC圖譜（B）Fig. 8 Time course of reducing sugar release (A) during hydrolysis of xylan with XynB and AguA and TLC profiles of hydrolysates (B)

3 結(jié) 論

海棲熱袍菌所產(chǎn)XynB和AguA的熱穩(wěn)定性好，在生物處理過(guò)程中具有減少污染、加快反應(yīng)速率、提高酶作用底物溶解度和較高的抗化學(xué)變性等優(yōu)點(diǎn)[17]。利用耐熱性XynB和AguA酶解農(nóng)業(yè)廢棄物中的木聚糖類半纖維素生產(chǎn)高附加值的低聚木糖，不僅變廢為寶，而且可保護(hù)環(huán)境，經(jīng)濟(jì)、社會(huì)效益顯著。利用蛋白質(zhì)工程構(gòu)建共生產(chǎn)木聚糖酶和葡萄糖醛酸酶工程菌，不僅能減少反應(yīng)和操作步驟，而且降低酶催化劑生產(chǎn)成本，成為當(dāng)今生物技術(shù)和生物資源利用領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。為了研究共生產(chǎn)木聚糖酶和葡萄糖醛酸酶工程菌在制備低聚木糖中的應(yīng)用效果，本研究采用前期構(gòu)建的重組菌JM109（DE3）/pET-28a-XPA制備耐熱性XynB和AguA用于樺木木聚糖的水解，經(jīng)過(guò)單因素和響應(yīng)面分析法對(duì)酶解條件進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果表明，各因素對(duì)還原糖釋放量影響顯著性順序依次為底物質(zhì)量濃度＞pH值＞酶解溫度，當(dāng)樺木木聚糖底物質(zhì)量濃度4.2 g/100 mL、酶解溫度80.66 ℃、pH 7.65、XynB/AguA加酶量60/9 U/g，還原糖釋放量為17.82 mg/mL，進(jìn)一步經(jīng)酶解反應(yīng)歷程顯示酶解4 h所得低聚木糖中還原糖質(zhì)量濃度為17.91 mg/mL，木二糖質(zhì)量濃度為13.66 mg/mL。而木二糖是促進(jìn)人體內(nèi)雙歧桿菌生長(zhǎng)和穩(wěn)定腸道菌群的主要益生因子，能廣泛應(yīng)用食品藥品工業(yè)和飼料生產(chǎn)等領(lǐng)域。低聚木糖不僅具有增加體內(nèi)不飽和脂肪的含量，提高鈣元素的吸收利用[29-31]，降低胃潰瘍發(fā)病率，而且有助于降低結(jié)腸癌，降血脂和血壓[32-34]，使得低聚木糖成為功能性寡糖中的佼佼者。

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