抗真菌藥物棘白菌素應(yīng)用過程中“矛盾現(xiàn)象”的特點(diǎn)、發(fā)生機(jī)制研究進(jìn)展

宋星澎，鄭銳

(中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院，沈陽 110022)

侵襲性真菌感染是重癥患者死亡的首要原因。目前抗真菌藥物較少，多烯類(如兩性霉素B)、咪唑類(如氟康唑，泊沙康唑和伏立康唑)，嘧啶類似物(如氟胞嘧啶)和棘白菌素(如卡泊芬凈，米卡芬凈和阿尼芬凈)等四類是侵襲性真菌感染的主要治療藥物。多烯類和咪唑類可直接或間接影響真菌膜，氟胞嘧啶則通過干擾DNA和RNA合成發(fā)揮抗菌作用。新一代抗真菌藥物棘白菌素是一種葡萄糖聚合酶抑制劑，通過非競爭抑制1-3-β-D葡聚糖合成酶，造成細(xì)胞壁葡聚糖含量減低，破壞細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，最終導(dǎo)致菌體破裂死亡。棘白菌素對(duì)念珠菌顯示優(yōu)異的抗真菌活性，并且對(duì)多數(shù)曲霉屬物種具有良好的抑菌作用[1，2]。棘白霉素耐藥率較低，是目前侵入性念珠菌病經(jīng)驗(yàn)性治療的首選藥物，是侵襲性曲霉病的二線治療藥物[3,4]。標(biāo)準(zhǔn)化條件下進(jìn)行藥物敏感性測試時(shí)，棘白菌素可發(fā)生“矛盾現(xiàn)象”。棘白霉素類抗真菌藥物的“矛盾現(xiàn)象”是指在棘白霉素藥物低濃度時(shí)真菌表現(xiàn)敏感，但隨藥物濃度升高，真菌對(duì)其敏感性反而下降，甚至產(chǎn)生耐藥的現(xiàn)象，濃度非常高時(shí)，真菌再次對(duì)棘白霉素敏感[5～8]。念珠菌屬和曲霉菌屬均可在體外對(duì)棘白霉素類抗真菌藥物產(chǎn)生“矛盾現(xiàn)象”。目前，“矛盾現(xiàn)象”的產(chǎn)生機(jī)制及影響因素等方面尚有諸多不明確，“矛盾現(xiàn)象”是否對(duì)臨床治療真菌存在影響尚存在爭議。本文對(duì)棘白菌素應(yīng)用過程中“矛盾現(xiàn)象”的特點(diǎn)及發(fā)生機(jī)制相關(guān)研究進(jìn)展綜述如下。

1 “矛盾現(xiàn)象”的特點(diǎn)

“矛盾現(xiàn)象”于1988年在體外研究中被發(fā)現(xiàn)[9],在較低劑量(<1 μg/mL)時(shí)棘白霉素可有效抑制真菌細(xì)胞壁合成，有效殺死念珠菌，抑制曲霉菌伸張；加入較高劑量(4～32 μg/mL)棘白霉素時(shí)菌落出現(xiàn)生長；加入濃度非常高(約> 64 μg/mL)的棘白霉素時(shí)真菌再次對(duì)棘白霉素變得敏感，出現(xiàn)抑制生長，這種特異的現(xiàn)象被稱為“矛盾現(xiàn)象”[5～8]。并非每一種棘白菌素類抗真菌藥物均可導(dǎo)致“矛盾現(xiàn)象”?？ú捶覂簟⒚卓ǚ覂艉桶⒛岱覂舻热N棘白菌素衍生物最常導(dǎo)致念珠菌“矛盾現(xiàn)象”的是卡泊芬凈。藥物導(dǎo)致“矛盾現(xiàn)象”的概率隨念珠菌菌屬不同而不同。體外試驗(yàn)[10]表明，卡泊芬凈及阿尼芬凈導(dǎo)致真菌發(fā)生“矛盾現(xiàn)象”的可能性明顯高于米卡芬凈，卡泊芬凈的“矛盾現(xiàn)象”常見于熱帶念珠菌及近平滑念珠菌，阿尼芬凈的“矛盾現(xiàn)象”常見于白色念珠菌及光滑念珠菌。熱帶念珠菌更容易發(fā)生矛盾生長。煙曲霉菌株中卡泊芬凈的“矛盾現(xiàn)象”在治療中更常見[11]。然而，不同研究報(bào)道的單個(gè)棘白菌素抗真菌藥物和不同真菌分離株之間“矛盾現(xiàn)象”的發(fā)生率差異很大。Chamilos等[12]觀察到20個(gè)臨床分離株中有12個(gè)(60%)存在卡泊芬凈導(dǎo)致白色念珠菌矛盾生長。Fleischhacker等[13]在101個(gè)臨床分離株中僅發(fā)現(xiàn)14個(gè)(14%)可發(fā)生“矛盾現(xiàn)象”的真菌，盡管使用同種菌屬及同類棘白菌素，二者結(jié)果仍差異較大，可能與不同研究之間的方法學(xué)差異有關(guān)。

培養(yǎng)基成分、培養(yǎng)基添加劑及確切培養(yǎng)條件不同，棘白菌素應(yīng)用過程中發(fā)生“矛盾現(xiàn)象”的概率不同。Stevens等[14]研究發(fā)現(xiàn)，與RPMI 1640培養(yǎng)基(無血清細(xì)胞凍存基礎(chǔ)培養(yǎng)基)相比，合成氨基酸培養(yǎng)基真菌(SAAMF)中白色念珠菌的矛盾生長更明顯，平均來說，PRMI培養(yǎng)基需要兩倍于SAAMF培養(yǎng)基的棘白菌素濃度才能誘發(fā)“矛盾現(xiàn)象”，而兩種培養(yǎng)基在試驗(yàn)過程中均保持同樣的生理pH濃度，表明這一差異與pH值無關(guān)，而在酵母氮基培養(yǎng)基(YNB)中不太明顯，高濃度血清(50%)補(bǔ)充RPMI 1640可以消除卡泊芬凈的“矛盾現(xiàn)象”。較低血清濃度(10%)則會(huì)大幅增加誘導(dǎo)“矛盾現(xiàn)象”所需的棘白霉素濃度[15]，高血清濃度(50%)對(duì)曲霉菌的矛盾生長有抑制作用[16]，這一現(xiàn)象與血清對(duì)棘白菌素的作用靶點(diǎn)的干涉，對(duì)蛋白結(jié)合率的下調(diào)，以及對(duì)藥物弄得的稀釋等多方面因素有關(guān)，而在人體內(nèi)生理環(huán)境更加復(fù)雜，增加了“矛盾現(xiàn)象”出現(xiàn)的難度.總之，培養(yǎng)基的具體基礎(chǔ)類型，添加的血清濃度等因素均會(huì)影響“矛盾現(xiàn)象”的產(chǎn)生。

棘白菌素的濃度是否穩(wěn)定也可影響“矛盾現(xiàn)象”發(fā)生的幾率。 Stevens等[7]已經(jīng)觀察到當(dāng)在固體培養(yǎng)基(瓊脂)圓盤擴(kuò)散方法檢測抗菌藥物敏感性由于藥物濃度的不穩(wěn)定，“矛盾現(xiàn)象”似乎遭到抑制。 而對(duì)卡泊芬凈的間歇暴露不僅抑制了矛盾的生長，而且還增加了卡泊芬凈的抗菌活性，提升了卡泊芬凈的抗感染效果。生物膜法培養(yǎng)與傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)方法相比更容易出現(xiàn)“矛盾現(xiàn)象”[17]。Melo等[18]研究證實(shí)，使用生物膜時(shí)，更加頻繁地觀察到“矛盾現(xiàn)象”的出現(xiàn)。而棘白菌素是否能維持穩(wěn)定的濃度是另一個(gè)影響“矛盾現(xiàn)象”的因素，Stevens等[7]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)在固體培養(yǎng)基(瓊脂)不穩(wěn)定的藥物濃度對(duì)“矛盾現(xiàn)象”產(chǎn)生了抑制作用，Shields等[15]研究發(fā)現(xiàn)，間歇性暴漏于棘白菌素作用下，可有效地抑制“矛盾現(xiàn)象”，且進(jìn)一步增加卡泊芬凈的殺菌效果[19]。但是這種現(xiàn)象只在卡泊芬凈高濃度范圍內(nèi)(4～32 μg/mL)，可能原因?yàn)榭ú捶覂艨梢种?-3β葡聚糖的合成及誘導(dǎo)凋亡[20]。

2 “矛盾現(xiàn)象”的發(fā)生機(jī)制

“矛盾現(xiàn)象”是單純的體外現(xiàn)象還是與臨床治療真菌感染有關(guān)，目前臨床尚無定論。沒有臨床試驗(yàn)證明“矛盾現(xiàn)象”會(huì)影響人類的抗念珠菌治療。動(dòng)物試驗(yàn)表明，“矛盾現(xiàn)象”有可能影響棘白菌素的殺菌效果，但并不會(huì)影響念珠菌感染的預(yù)后[21]。曲霉菌感染的動(dòng)物試驗(yàn)提示，“矛盾現(xiàn)象”有可能增加棘白菌素的治療劑量，然而動(dòng)物模型中的“矛盾現(xiàn)象”并未影響實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的存活率[22]。目前還未明確在臨床中發(fā)現(xiàn)“矛盾現(xiàn)象”。因?yàn)轶w內(nèi)“矛盾現(xiàn)象”可能受血清、藥物濃度波動(dòng)等多種因素影響。血清內(nèi)藥物濃度的不穩(wěn)定可能阻礙了“矛盾現(xiàn)象”的出現(xiàn)，而導(dǎo)管和植入物感染引起的微生物生物膜效應(yīng)可能增加“矛盾現(xiàn)象”的出現(xiàn)率，而在高劑量棘白菌素下仍持續(xù)感染，或引入具有特別長效作用的新的棘白菌素衍生物，如棘白菌素CD101，均可能在人體內(nèi)誘發(fā)“矛盾現(xiàn)象”[23，24]，但是人體內(nèi)“矛盾現(xiàn)象”仍有待進(jìn)一步的研究觀察。

inp51及irs4基因與“矛盾現(xiàn)象”可能有關(guān)，抑制這兩處基因表達(dá)可消除“矛盾現(xiàn)象”的出現(xiàn)?？紤]這兩處基因可能與1-3β葡聚糖合成有關(guān)，但是具體途徑仍還有待明確，而與常見的耐藥相關(guān)基因的突變FKS1關(guān)系復(fù)雜，有研究提示矛盾效應(yīng)與FKS基因表達(dá)無明顯關(guān)系[25]，而既往研究表明幾丁質(zhì)的合成與FKS1基因無關(guān)，但是現(xiàn)在有研究表明，在“矛盾現(xiàn)象”中，菌絲中1-3-β葡聚糖會(huì)從棘白菌素抑制下逐漸恢復(fù)，表明這一過程中1,3-葡聚糖合成得到恢復(fù)，提示1,3-葡聚糖合酶Fks1的表達(dá)很可能與“矛盾現(xiàn)象”有關(guān)，而fks1的過表達(dá)則使得曲霉菌更易感，而減少表達(dá)導(dǎo)致菌絲更能耐受棘白菌素的殺菌作用[26]。

目前針對(duì)“矛盾現(xiàn)象”的機(jī)制，首先考慮與細(xì)胞壁的幾丁質(zhì)的合成有關(guān)。使用尼可霉素抑制幾丁質(zhì)的合成可有效消除“矛盾現(xiàn)象”，而在體外實(shí)驗(yàn)中卡泊芬凈的刺激下，可發(fā)現(xiàn)曲霉菌的幾丁質(zhì)合成會(huì)明顯升高，幾丁質(zhì)使用N-乙酰葡萄糖氨分子以β-1.4葡萄糖苷鍵聚合而成，處于真菌細(xì)胞壁的最內(nèi)側(cè)，臨近質(zhì)膜，呈放射狀，是真菌菌絲尖端生長最主要成分。在卡泊芬凈“矛盾現(xiàn)象”發(fā)生時(shí)，可觀察到明顯的絲裂原活化蛋白激酶MpkAMPK1及其相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(TF)RlmARLM1上調(diào)，依賴于鈣和鈣依賴磷酸酶的轉(zhuǎn)入因子 CrzA與MRNA結(jié)合并調(diào)節(jié)特定幾丁質(zhì)合酶基因的表達(dá)，增加細(xì)胞壁幾丁質(zhì)的合成[27]，大幅增加幾丁質(zhì)的合成，有三個(gè)信號(hào)通路被確定為上調(diào)棘白菌素處理對(duì)幾丁質(zhì)合成的響應(yīng)。Walker等[28]發(fā)現(xiàn)在白色念珠菌中，PKC途徑、高滲透甘油(HOG)和神經(jīng)鈣蛋白三個(gè)途徑相互刺激幾丁質(zhì)合成酶Chs2和Chs8促進(jìn)及定制的合成，以抵抗棘白菌素的作用。磷酸酶A催化亞基CnaA和下游鈣調(diào)磷酸酶響應(yīng)性鋅指轉(zhuǎn)錄因子CrzA的缺失的煙曲霉突變體則會(huì)出現(xiàn)對(duì)棘白菌素的敏感性增加，導(dǎo)致“矛盾現(xiàn)象”消失[29]。真菌細(xì)胞溶質(zhì)游離Ca2+瞬時(shí)增加，激活鈣調(diào)蛋白-鈣調(diào)磷酸酶信號(hào)，鈣調(diào)蛋白和鈣調(diào)磷酸酶基因表達(dá)增強(qiáng)，促進(jìn)菌絲生長[30]，在受到鈣離子拮抗劑的作用，“矛盾現(xiàn)象”也會(huì)出現(xiàn)明顯減退，此外，“矛盾現(xiàn)象”與β葡萄糖聚合酶有關(guān)，當(dāng)矛盾生長出現(xiàn)時(shí)，菌絲頂端β葡萄糖聚合酶將出現(xiàn)局部更新，促進(jìn)β-1,3-葡聚糖合成，以保護(hù)菌體[31],這種機(jī)制的表現(xiàn)似乎與棘白菌素衍生物有關(guān)，僅在某些菌株和物種中發(fā)生，并且需要數(shù)天才能顯現(xiàn)。目前考慮在棘白菌素作用下真菌首先出現(xiàn)幾丁質(zhì)合成增加，以抵抗棘白菌素作用，在后續(xù)過程中出現(xiàn)β葡聚糖酶局部高表達(dá)，促進(jìn)1，3-β葡聚糖的合成，但是，真菌重建β-1,3-葡聚糖合成的機(jī)制仍未明確[32]。但是“矛盾現(xiàn)象”的產(chǎn)生，幾丁質(zhì)之間及1，3β葡聚糖之間的關(guān)系復(fù)雜，有研究表明，在“矛盾現(xiàn)象”中，可發(fā)現(xiàn)由于1，3β葡聚糖增加引起幾丁質(zhì)合成減低，并通過增加自身合成來增強(qiáng)細(xì)菌的活性，而幾丁質(zhì)的合成則只能更加與FKS1基因活性減低有關(guān)，F(xiàn)KS基因活化則會(huì)抑制幾丁質(zhì)合成[5]， 考慮“矛盾現(xiàn)象”中細(xì)胞壁的合成是一個(gè)動(dòng)態(tài)復(fù)雜的過程。目前磷脂酰肌醇(4,5)-二磷酸-5磷酸以及熱休克蛋白缺乏也被認(rèn)為與“矛盾現(xiàn)象”有關(guān)，磷脂酰肌醇(4,5)-二磷酸-5磷酸被破壞，引起PKC-Mkc1過度激活途徑的激活，增加對(duì)棘白菌素的敏感度，消除“矛盾現(xiàn)象”。也有研究[33，34]提示熱休克蛋白90(Hsp90)參與煙曲霉菌磷酸酶對(duì)棘白菌素的應(yīng)激反應(yīng)，激活鈣調(diào)磷酸酶，促進(jìn)細(xì)胞壁的合成，在熱休克蛋白受抑制的情況下，會(huì)增加念珠菌的敏感性，會(huì)提高可消除“矛盾現(xiàn)象”。

綜上所述，不同棘白菌素類抗真菌藥物導(dǎo)致真菌發(fā)生“矛盾現(xiàn)象”的幾率不同，卡泊芬凈是最常引起念珠菌發(fā)生“矛盾現(xiàn)象”的抗真菌藥物。念珠菌屬和曲霉菌屬均可在體外對(duì)棘白霉素類抗真菌藥物產(chǎn)生“矛盾現(xiàn)象”。

藥物導(dǎo)致“矛盾現(xiàn)象”的概率隨念珠菌菌屬不同而不同。“矛盾現(xiàn)象”的發(fā)生可能與inp51及irs4基因過表達(dá)、細(xì)胞壁幾丁質(zhì)合成、葡萄糖聚合酶有關(guān)磷脂酰肌醇(4,5)-二磷酸-5磷酸以及熱休克蛋白等因素有關(guān)。是否有其他基因參與“矛盾現(xiàn)象”的發(fā)生，熱休克蛋白等因素影響“矛盾現(xiàn)象”的具體途徑，仍有待進(jìn)一步的研究。