自組裝肽納米纖維支架在骨缺損修復(fù)中的研究進(jìn)展

崔云霞 李保勝 蔡 青 王春陽(yáng) 王鶴齡 許彤彤 全 旭 孟維艷

隨著種植技術(shù)的不斷發(fā)展和完善，種植義齒已成為治療牙列缺損和缺失的主要修復(fù)方式。然而在臨床治療中，由于外傷、炎癥、腫瘤和牙周病等原因造成的不同程度的骨缺損，大大縮小了種植義齒的適應(yīng)癥。GBR是臨床上常用的骨增量方法，具有較高的成功率，能有效的解決骨量不足的問(wèn)題[1，2]。近年來(lái)，骨替代材料與引導(dǎo)骨再生（GBR）膜的聯(lián)合應(yīng)用，在修復(fù)骨缺損的臨床應(yīng)用中獲得了良好的治療效果。但現(xiàn)有的骨充填修復(fù)材料及屏障膜依然存在著許多不足[3]，難以達(dá)到臨床骨再生及骨修復(fù)的理想要求。尋找一種新型的、更適合的骨缺損修復(fù)材料一直是現(xiàn)在的熱點(diǎn)研究方向。

現(xiàn)有的骨修復(fù)材料主要包括高分子聚合物材料、生物陶瓷材料、金屬材料、生物玻璃和復(fù)合材料等，但在針對(duì)其材料性能進(jìn)行應(yīng)用時(shí)，各種材料也都有其局限性，如存在機(jī)械強(qiáng)度不足、脆性較大、釋放金屬離子、生物活性差等[4]。研究發(fā)現(xiàn)，自組裝肽納米纖維支架（self-assembling peptide nanofiber scaffolds，SAPNS）不僅具有良好的生物活性及可降解性，其對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)和組織修復(fù)更具有重要的應(yīng)用價(jià)值。SAPNS作為一種新型的生物可降解材料，在骨組織修復(fù)中有良好的應(yīng)用前景。本文就SAPNS的研究進(jìn)展和在修復(fù)骨缺損的應(yīng)用中作簡(jiǎn)要綜述。

一、SAPNS的特點(diǎn)及研究進(jìn)展

1.SAPNS的特點(diǎn)：分子自組裝的原理是利用分子與分子或分子中某一片段與另一片段之間相互識(shí)別，通過(guò)非共價(jià)鍵的弱作用力形成具有特定排列順序的分子聚合體。這些的弱作用力主要包括氫鍵，范德華力，靜電力和疏水作用力等。利用這一原理，自組裝肽通過(guò)合理調(diào)控多肽分子結(jié)構(gòu)并給予一定的外界刺激（如調(diào)節(jié)溫度、PH和離子強(qiáng)度等），多肽分子可以通過(guò)多重非共價(jià)鍵作用，自發(fā)或觸發(fā)地組裝形成特異形態(tài)與功能的組裝體，自行組裝成納米纖維的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)[5]1993年，科學(xué)家發(fā)現(xiàn)并在酵母蛋白中提取出具有自組裝特性的離子短肽[6]，之后學(xué)者們陸續(xù)設(shè)計(jì)出各種新型的自組裝肽并廣泛應(yīng)用到組織再生修復(fù)中。研究表明，SAPNS這種生物同源的新型生物材料，在細(xì)胞培養(yǎng)、藥物/基因控制釋放、組織工程支架材料等方面有著巨大的應(yīng)用前景[7]。

在組織再生修復(fù)領(lǐng)域，相比于其他材料SAPNS有其卓越的優(yōu)越性：①其基本結(jié)構(gòu)為氨基酸或多肽，具有良好的生物相容性和生物識(shí)別功能[8，9]。②自組裝肽納米纖維支架形成的微環(huán)境，與細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）具有較高的相似性[10]，有利于細(xì)胞的生長(zhǎng)和細(xì)胞功能的改善。③SAPNS具有生物可降解性[11]，且其降解產(chǎn)物主要是多肽和氨基酸，對(duì)周?chē)M織細(xì)胞不造成毒性作用。④富含功能化基序（如D型氨基酸，糖肽，功能化肽RAD16，RGD等）的自組裝肽納米纖維材料，可增強(qiáng)細(xì)胞的生物識(shí)別作用，促進(jìn)細(xì)胞的黏附和分化，提高生物材料的穩(wěn)定性[12～14]。⑤在藥物治療，再生支架，作為釋放細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子等的載體[15，16]等領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用。

2.SAPNS的研究進(jìn)展：近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者在不同領(lǐng)域?qū)APNS都進(jìn)行了廣泛的研究。采用納米生物技術(shù)將表皮生長(zhǎng)因子（EGF）結(jié)合于自組裝肽納米纖維支架（SAP）材料表面，可以增加創(chuàng)面的上皮化率。其應(yīng)用于創(chuàng)傷組織的表面覆蓋時(shí)，局部可以釋放生長(zhǎng)因子。研究表明含有EGF的SAP支架可加速創(chuàng)面覆蓋率約5倍，有利于促進(jìn)皮膚組織再生修復(fù)[17]。另一項(xiàng)研究成果表明：經(jīng)自組裝肽納米纖維涂層的不銹鋼支架可改善其表面的細(xì)胞生長(zhǎng)的微環(huán)境，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的存活與增殖[18]。將分離的神經(jīng)干細(xì)胞在自組裝納米纖維支架上培養(yǎng)后注入到動(dòng)物脊髓損傷模型，結(jié)果顯示SAPNS可誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞分化為神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞，有利于損傷脊髓的再生修復(fù)[19]。

隨著研究的深入，學(xué)者提出不同的設(shè)計(jì)策略對(duì)其進(jìn)行改性，以期改善和更好的發(fā)揮其功能。將含有活性成分序列修飾后的肽或氨基酸制備的納米纖維材料，在一定的程度上提高了支架材料的生物活性和細(xì)胞-界面的相容特性。雙親多肽經(jīng)離子觸發(fā)可自組裝成為納米凝膠支架材料，形成與細(xì)胞外微環(huán)境相似的立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)[20]。G學(xué)者等[21]設(shè)計(jì)了用于角膜組織再生的自組裝肽納米纖維支架系統(tǒng)，即含有特定序列修飾的的雙親性肽（YIGSR-PA）自組裝的納米纖維支架。將人角膜基質(zhì)細(xì)胞在該自組裝肽納米纖維支架上培養(yǎng)，觀察結(jié)果顯示這些細(xì)胞保留了它們的原有的特征形態(tài)；與對(duì)照組細(xì)胞相比，增殖分化能力增強(qiáng)。這種含有特定序列的肽自組裝的納米纖維材料可模擬層粘連蛋白功能用于受損的角膜，在支持基質(zhì)再生和角膜移植方面有巨大的應(yīng)用潛力。

多肽特定的殘端或側(cè)鏈基團(tuán)可使其在自組裝后具備特定的功能。采用功能基序修飾肽序列，可使肽自組裝形成的納米纖維支架攜帶具有該生物活性基序的功能，對(duì)增強(qiáng)細(xì)胞功能有重要作用[22]。例如：肽RADA16-I可以組裝成有序納米纖維和水凝膠，Wu等[14]通過(guò)三短肽BMP-7修飾功能化肽RADA16-I制備的三維支架材料RADKPS，在體外能激活退變的髓核細(xì)胞，發(fā)揮與BMP-7相同的功能特性，有利于提高膠原和蛋白聚糖的分泌表達(dá)。該材料還可以誘導(dǎo)BMSC向髓核細(xì)胞的分化，在椎間盤(pán)損傷的再生治療領(lǐng)域有較高的應(yīng)用價(jià)值。作為一種新型的組織再生支架，自組裝肽納米纖維支架在各個(gè)領(lǐng)域都表現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)，其在骨組織修復(fù)方面也具有著巨大的研究?jī)r(jià)值。

二、自組裝納米纖維支架的成骨作用的研究進(jìn)展

1.體外研究：研究證實(shí)，添加生長(zhǎng)因子或設(shè)置細(xì)胞培養(yǎng)的三維體系，有利于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的擴(kuò)增[23]。利用肽納米纖維支架工的多孔結(jié)構(gòu)和高表面體積比的特殊性質(zhì)，可以為細(xì)胞提供適合的空間和環(huán)境支持。用3D自組裝肽納米纖維支架為載體培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，表現(xiàn)出較好的生存、粘附、增殖和成骨分化能力[9，24]。在某些肽和蛋白質(zhì)片段內(nèi)發(fā)現(xiàn)含有RGD序列，加入這些功能片段可用來(lái)模擬這些蛋白質(zhì)的功能。將含有生物活性肽基序（精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸）修飾RGD肽自組裝成的納米纖維支架包載骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）。結(jié)果表明，自組裝肽納米纖維材料為MSCs細(xì)胞的粘附和多向分化提供了良好的支架，可誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干向成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和成軟骨細(xì)胞分化。表明其可能是一種適合于MSCs組織工程的支架，可用于細(xì)胞治療和再生醫(yī)學(xué)[15]。

Ustun等[8]用含有超分子糖胺聚糖樣的肽自組裝的納米纖維結(jié)構(gòu)模擬透明質(zhì)酸（haluronic acid，HA）的功能，并將其與MSCs細(xì)胞聯(lián)合培養(yǎng)，該材料表現(xiàn)出良好的生物相容性能，因其在某種程度上類(lèi)似天然的透明質(zhì)酸，可以誘導(dǎo)MSCs細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化。堿性磷酸酶（ALP）與骨傳導(dǎo)和骨誘導(dǎo)有關(guān)，并可促進(jìn)羥基磷灰石的沉積。Gulcihan等[25]設(shè)計(jì)了一種由特定的生物活性肽自組裝的納米纖維，含有磷酸酶樣肽的納米纖維支架（PPA）可模擬天然堿性磷酸酶的催化活性和增強(qiáng)生物礦化的功能，可作用于骨形成并且調(diào)節(jié)磷的平衡和骨基質(zhì)的鈣化形成。促進(jìn)成骨樣細(xì)胞和骨髓間質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞的成熟。陳貝克等[26]將肽RADA16-Ⅰ的C末端與PTHrP（107-111）氨基酸活性末端相接，構(gòu)建的新型自組裝納米水凝膠，在體外能有效提高成骨前體細(xì)胞MC3T3-E1細(xì)胞粘附、增殖以及成骨分化能力。

大量的體外研究證實(shí)，自組裝肽納米纖維支架材料對(duì)細(xì)胞有良好的生物相容性且對(duì)成骨相關(guān)的細(xì)胞BMSCs、MC3T3-E1等的增殖、粘附和分化有著良好的促進(jìn)作用。這些研究成果為進(jìn)一步將其應(yīng)用于促進(jìn)骨修復(fù)的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)奠定了良好的基礎(chǔ)。

2.體內(nèi)研究：多肽特定的殘端或側(cè)鏈基團(tuán)可使其在自組裝后具備特定的功能，PAs短肽序列在誘導(dǎo)骨組織的生長(zhǎng)和礦化有著很大的潛力。含有磷酸絲氨酸殘基的兩親性肽（PA）自組裝的納米結(jié)構(gòu)水凝膠材料S（P）-PA和RGS-PA注入到大鼠股骨缺損模型。4周后與植入同種異體骨的大鼠相比取得了類(lèi)似的成骨效果，可觀察到有骨細(xì)胞的長(zhǎng)入和新的編織骨形成[27]。U學(xué)者[8]向兔關(guān)節(jié)內(nèi)軟骨缺損模型內(nèi)注入糖胺聚糖樣肽自組裝成的納米纖維材料?？赡苡捎诤请牡募{米纖維對(duì)軟骨的早期誘導(dǎo)和促進(jìn)MSCs在缺損部位的粘附作用，12周后缺損處可見(jiàn)新形成的豐富的Ⅱ型組織膠原和基質(zhì)沉積，材料與缺損部位周?chē)慕M織結(jié)合密合無(wú)脫離。

現(xiàn)如今，盡管金屬植入物和表面改性技術(shù)在加速骨愈合方面取得了成功，這樣的表面還是無(wú)法充分吸引在骨整合初期成骨細(xì)胞聚集。研究證實(shí)，功能性肽修飾和生長(zhǎng)因子的控制釋放都是增加成骨活性的重要方法[22]。因此，將生長(zhǎng)因子或功能性肽用于到植入物表面的生物化學(xué)修飾是至關(guān)重要的。膠原蛋白模擬肽GFOGER可特異性結(jié)合到α2β1整合素受體參與成骨。學(xué)者將GFOGER吸附到支架表面合成GFOGER涂層的PCL支架修復(fù)大鼠股骨節(jié)段型缺損，涂層后的支架可上調(diào)成骨細(xì)胞分化，進(jìn)而增加骨形成[28]。骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2（BMP-2）和堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（bFGF）是一種有效的骨誘導(dǎo)因子，在骨再生修復(fù)過(guò)程中起著重要的作用[29]。經(jīng)分子設(shè)計(jì)的含有BMP-2自組裝肽納米復(fù)合生物材料在大鼠臨界股骨缺損模型中可顯著增強(qiáng)骨再生，且低劑量的BMP-2即表現(xiàn)出顯著的效果[30]。He等[31]將堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（bFGF）結(jié)合D型肽制備的納米纖維支架（D-RADA16）用于修復(fù)大鼠股骨髁缺損，在第8和12周均可觀察到缺損處廣泛的骨愈合，且骨缺損區(qū)骨組織再生量和骨密度增高，載有生長(zhǎng)因子bFGF的納米纖維支架與對(duì)照組相比，可進(jìn)一步促進(jìn)骨生成。

自組裝肽支架是一種水凝膠結(jié)構(gòu)，可以作為骨缺損填充材料。但對(duì)于大的骨缺損或承重骨缺損，水凝膠的機(jī)械力相對(duì)較弱，不能提供足夠的機(jī)械支撐。因此，有必要將其與其他具有良好機(jī)械強(qiáng)度的材料相結(jié)合。已經(jīng)有一些關(guān)于基于肽的骨愈合復(fù)合支架的研究。例如，肽的兩親物（PAs）水凝膠是用來(lái)填補(bǔ)鈦合金（Ti-6Al-4V）泡沫孔隙制備混合植骨材料（PA鈦合金復(fù)合材料）。這種復(fù)合材料可促進(jìn)種植體周?chē)苌珊凸窃偕⑵溆糜谥委烻D大鼠后肢股骨干缺損，顯示出良好的機(jī)械強(qiáng)度和成骨活性[32]。將含序列 KLD12（Ac-KLDLKLDLKLDL-NH2）的肽和P物質(zhì)制備的納米纖維（KLD12/KLD12-SP）注入到]聚乳酸/β-磷酸三鈣（PLA/b-TCP）多孔支架，并將這種復(fù)合支架材料用于修復(fù)大鼠顱骨缺損模型，在沒(méi)有細(xì)胞移植的情況下，該復(fù)合材料亦能吸附骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞至缺損部位，從而加速骨組織的形成。24周觀察可見(jiàn)缺損處的骨組織生長(zhǎng)，且與周?chē)M織整合良好[33]。

三、問(wèn)題和展望

良好的骨修復(fù)材料應(yīng)具有良好的機(jī)械性能、適當(dāng)?shù)姆€(wěn)定性以維持骨修復(fù)過(guò)程中的機(jī)械穩(wěn)定性[34]。自組裝肽納米纖維材料通常呈現(xiàn)的是一種水凝膠的狀態(tài)[20]，因此作為一種新型骨修復(fù)材料，在機(jī)械性能方面仍舊表現(xiàn)出許多不足，如抗剪切力、抗壓力和韌性較差[4]。因此，如何提高自組裝肽納米材料的生物力學(xué)性能仍是一個(gè)需要克服和改進(jìn)的研究熱點(diǎn)。有研究表明，自組裝纖維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的力學(xué)性能受特定分子間相互作用的影響，如離子鍵交聯(lián)作用的的納米纖維較由氫鍵作用的納米纖維表現(xiàn)出更強(qiáng)的剛度[35]。因此，我們猜想通過(guò)改變其組成的肽和網(wǎng)狀纖維之間相互作用的類(lèi)型來(lái)調(diào)整材料的剛性和抗變形能力，以改善其機(jī)械性能。此外，凝膠狀態(tài)的自組裝肽納米支架材料或許可用于修復(fù)種植體周?chē)奈⑿⌒凸侨睋p、作為抗菌藥物的載體用于種植體周?chē)椎闹委熁蚴亲鳛橐环N涂層材料應(yīng)用于金屬支架或鈦網(wǎng)表面，形成一種復(fù)合生物材料，從而提高其生物相容性和成骨效能，為骨修復(fù)材料的制備和研究提供新的思路。

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