Caspase-3抑制劑聯(lián)合葛根素對頸椎間盤纖維環(huán)細(xì)胞增殖活力及磷酸化信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)的影響

王 超 蔡 平 周陳西 陳印磊 羅如松

(南京中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210023)

頸椎病發(fā)生與椎間盤退行性有關(guān)，其可以致使頸椎的穩(wěn)定性發(fā)生改變進(jìn)而引起一系列病理變化，導(dǎo)致位于頸部的脊神經(jīng)、椎動脈、脊髓等功能障礙。據(jù)統(tǒng)計，頸椎病在中國的發(fā)病率高達(dá)17.3%，并且其發(fā)病率呈現(xiàn)逐年上升的趨勢，發(fā)病年齡逐漸低齡化〔1〕。椎間盤細(xì)胞凋亡是頸椎病發(fā)生的機制之一，椎間盤細(xì)胞大量凋亡后導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)成分合成減少，從而促進(jìn)椎間盤退變和衰老〔2〕。纖維環(huán)是頸椎間盤組成部分之一，能夠維持椎間盤內(nèi)部穩(wěn)定，防止髓核從內(nèi)部突出〔3〕。葛根素是一種分離至葛根中的異黃酮類，對于骨質(zhì)疏松、頸椎病等均具有治療作用，另外葛根素還可以調(diào)控心肌細(xì)胞、肝細(xì)胞等多種細(xì)胞凋亡〔4〕。含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)-3是細(xì)胞凋亡過程中的凋亡執(zhí)行因子，z-DEVD-fmk是Caspase-3的抑制劑，能夠抑制細(xì)胞中Caspase-3的活化，發(fā)揮抑制細(xì)胞凋亡的作用〔5〕。本研究探討Caspase-3抑制劑聯(lián)合葛根素對頸椎間盤纖維環(huán)細(xì)胞增殖活力及細(xì)胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1一般材料 SD大鼠5只，5周齡購自浙江省實驗動物中心，許可證號：SCXK(浙)2014-0001。Caspase-3抑制劑z-DEVD-fmk、白細(xì)胞介素(IL)-1β、DMEM/F12、噻唑藍(lán)(MTT)、胰蛋白酶、青鏈霉素均購自美國Sigma；葛根素購自山東華信制藥集團(tuán)股份有限公司；聚氰基丙烯酸正丁酯(BCA)蛋白定量檢測試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所；酶切Caspase-3多克隆抗體、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄因子(STAT)3多克隆抗體、磷酸化(p)-STAT3多克隆抗體、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)多克隆抗體均購自美國Santa Cruz；酶標(biāo)儀、流式細(xì)胞儀均購自美國Thermo。

1.2頸椎間盤纖維環(huán)細(xì)胞分離培養(yǎng)〔6〕SD大鼠用10%的水合氯醛腹腔麻醉致死，放在75%的乙醇中浸泡10 min。將大鼠從頸部延中線切開皮膚至尾部，將位于椎體兩邊的肌肉分離后，將椎體旁的肋骨剪斷，取出完整的脊柱，放在含有1%青霉素和鏈霉素的培養(yǎng)皿中，把肌肉組織分離干凈，用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3次，將頸椎椎間盤組織剪下并用PBS洗滌3次，把椎間盤的髓核分離剔除后，取纖維環(huán)組織，用眼科剪將組織剪成小于1 mm3的組織塊。4℃，1 000 r/min離心3 min，棄上清，用0.25%的胰蛋白酶在37℃孵育30 min后，加入等量的DMEM/F12，4℃，1 000 r/min離心3 min，棄上清，加入PBS洗滌1次。加入0.2%的Ⅱ型膠原酶，在37℃中消化6 h，每間隔30 min震蕩搖勻一次，4℃，1 000 r/min離心5 min，吸除上清液，加入含有15%的胎牛血清的DMEM/F12，接種到細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，在37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每隔3 d換液一次，沒有消化的組織繼續(xù)用0.2%的Ⅱ型膠原酶消化。培養(yǎng)12 d后，用0.25%胰蛋白酶消化傳代，用10%胎牛血清的DMEM/F12重懸細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)。后續(xù)試驗中所用細(xì)胞為第3代頸椎間盤纖維環(huán)細(xì)胞。

1.3實驗分組 取第3代頸椎間盤纖維環(huán)細(xì)胞，分為正常組、模型組、葛根素組、抑制劑組、聯(lián)合組。其中正常組細(xì)胞用正常的細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)，模型組、葛根素組、抑制劑組、聯(lián)合組細(xì)胞培養(yǎng)液中均加入IL-1β使其終濃度為12 ng/ml，另外，葛根素組細(xì)胞培養(yǎng)液中還加入葛根素使其終濃度為300 μmol/L，抑制劑組細(xì)胞培養(yǎng)液中還加入Caspase-3抑制劑z-DEVD-fmk使其終濃度為25 μmol/L，聯(lián)合組細(xì)胞培養(yǎng)液中還同時加入葛根素和Caspase-3抑制劑使其終濃度分別為300、25 μmol/L。

1.4Western印跡法檢測酶切Caspase-3、STAT3、p-STAT3表達(dá) 正常組、模型組、葛根素組、抑制劑組、聯(lián)合組分別按照1.3中方法處理后，培養(yǎng)48 h，加入4℃預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2次，加入細(xì)胞裂解液，放置于冰上裂解30 min，轉(zhuǎn)移到EP管中，4℃，14 000 r/min離心30 min，蛋白存在于上清中。用BCA法定量檢測蛋白濃度，步驟參照BCA蛋白定量檢測試劑盒。用12%分離膠，5%濃縮膠，90 V恒壓電泳。90 V電壓轉(zhuǎn)膜80 min。5%牛血清白蛋白室溫封閉1.5 h。1∶1 000稀釋一抗，4℃結(jié)合過夜。1∶2 000稀釋二抗，37℃結(jié)合90 min。電化學(xué)發(fā)光(ECL)顯影定影，Bio-Rad成像系統(tǒng)采集圖片，分析蛋白相對定量水平。

1.5MTT檢測細(xì)胞活力 取第3代頸椎間盤纖維環(huán)細(xì)胞，以3×104個/ml接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔中加入100 μl的細(xì)胞懸浮液，觀察細(xì)胞貼壁后，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。將原來的細(xì)胞培養(yǎng)吸除后，按照正常組、模型組、葛根素組、抑制劑組、聯(lián)合組各自加入對應(yīng)的細(xì)胞培養(yǎng)液，每組設(shè)5個復(fù)孔，孵育48 h后，每孔中加入20 μl的MTT溶液(5 mg/ml)，放在37℃環(huán)境中孵育4 h。將每孔中的上清液吸除后，每孔中加入150 μl的二甲基亞砜，震蕩10 min后，放置于酶標(biāo)儀上，用波長490 nm測定光密度值(OD值)。

1.6流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 取第3代頸椎間盤纖維環(huán)細(xì)胞，以3×104個/ml接種到6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，觀察細(xì)胞貼壁后，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，按照正常組、模型組、葛根素組、抑制劑組、聯(lián)合組分別加入細(xì)胞培養(yǎng)液，培養(yǎng)48 h后，胰蛋白酶消化細(xì)胞，用PBS將細(xì)胞懸浮后，收集106個細(xì)胞，2 000 r/min離心10 min。加入200 μl的結(jié)合緩沖液混勻后，依次分別加入5 μl的碘化丙啶(PI)和膜聯(lián)蛋白 V-FITC(Annexin V-FITC)混合后，用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況。

1.7統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS22.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1酶切Caspase-3表達(dá)檢測結(jié)果 以GAPDH為內(nèi)參，正常組、模型組、葛根素組、抑制劑組、聯(lián)合組細(xì)胞酶切Caspase-3表達(dá)水平依次為：(0.41±0.06)、(1.32±0.12)、(0.96±0.11)、(0.87±0.07)、(0.59±0.08)。模型組、葛根素組、抑制劑組、聯(lián)合組細(xì)胞酶切Caspase-3表達(dá)水平均明顯高于正常組(P<0.05)。葛根素組、抑制劑組、聯(lián)合組細(xì)胞酶切Caspase-3表達(dá)水平均明顯低于模型組(P<0.05)。葛根素組、抑制劑組細(xì)胞酶切Caspase-3表達(dá)水平均明顯高于聯(lián)合組(P<0.05)。見圖1。

2.2細(xì)胞活力檢測結(jié)果 正常組、模型組、葛根素組、抑制劑組、聯(lián)合組細(xì)胞OD值依次為：(1.12±0.13)、(0.63±0.07)、(0.79±0.05)、(0.85±0.07)、(1.05±0.11)。模型組、葛根素組、抑制劑組、聯(lián)合組細(xì)胞OD值均明顯低于正常組(P<0.05)。葛根素組、抑制劑組、聯(lián)合組細(xì)胞OD值均明顯高于模型組(P<0.05)。葛根素組、抑制劑組細(xì)胞OD值均明顯低于聯(lián)合組(P<0.05)。

2.3細(xì)胞凋亡檢測結(jié)果 正常組、模型組、葛根素組、抑制劑組、聯(lián)合組細(xì)胞凋亡率依次為：(3.15±0.36)%、(39.54±1.69)%、(22.47±1.32)%、(20.84±2.01)%、(14.32±1.12)%。模型組、葛根素組、抑制劑組、聯(lián)合組細(xì)胞凋亡率均明顯高于正常組(P<0.05)。葛根素組、抑制劑組、聯(lián)合組細(xì)胞凋亡率均明顯低于模型組(P<0.05)。葛根素組、抑制劑組細(xì)胞凋亡率均明顯高于聯(lián)合組(P<0.05)。見圖2。

圖1 Western印跡法檢測各組酶切Caspase-3表達(dá)

圖2 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡

2.4STAT3、p-STAT3表達(dá)檢測結(jié)果 正常組、模型組、葛根素組、抑制劑組、聯(lián)合組p-STAT3/STAT3水平依次為：(0.72±0.08)、(0.18±0.03)、(0.29±0.02)、(0.34±0.04)、(0.45±0.06)。模型組、葛根素組、抑制劑組、聯(lián)合組p-STAT3/STAT3水平均明顯低于正常組(P<0.05)。葛根素組、抑制劑組、聯(lián)合組p-STAT3/STAT3水平均明顯高于模型組(P<0.05)。葛根素組、抑制劑組p-STAT3/STAT3水平均明顯低于聯(lián)合組(P<0.05)。見圖3。

圖3 Western印跡法檢測STAT3、p-STAT3表達(dá)

3 討 論

頸椎病的發(fā)病機制較為復(fù)雜，是增生性頸椎炎、頸椎骨關(guān)節(jié)炎、頸椎間盤脫出癥、頸神經(jīng)根綜合征的總稱，是一種退行性疾病〔7〕。頸椎間盤由纖維環(huán)和髓核組成，纖維環(huán)以同心圓的方式包圍髓核，纖維環(huán)在維持椎間盤壓力中發(fā)揮重要作用〔8〕。纖維環(huán)發(fā)生退變后，會導(dǎo)致椎間盤的承受能力失衡引起纖維組織稀疏，從而造成神經(jīng)和血管的粘連，嚴(yán)重者可引起髓核突出〔9〕。頸椎間盤纖維環(huán)細(xì)胞異常減少是纖維環(huán)退變的主要原因，隨著頸椎間盤纖維環(huán)細(xì)胞的不斷減少，細(xì)胞外基質(zhì)成分也不斷減少，導(dǎo)致椎間盤的滲透壓、容積等發(fā)生改變，進(jìn)而導(dǎo)致椎間盤發(fā)生退變〔10，11〕。IL-1β是一種炎癥因子，在椎間盤退行性病變中大量表達(dá)，能夠促進(jìn)椎間盤細(xì)胞凋亡〔12〕。本研究結(jié)果提示，IL-1β處理后頸椎間盤纖維環(huán)細(xì)胞增殖活力降低，細(xì)胞凋亡增加，這與之前的研究報道〔12〕相符合。

葛根素具有消炎、抗菌、抗病毒、增加免疫力等功效，對腦缺血再灌注、糖尿病腎病、阿爾茨海默病、骨質(zhì)疏松、頸椎病等均具有改善作用〔13～15〕。周軍等〔16〕研究表明，葛根湯能夠降低椎間盤組織中炎癥反應(yīng)緩解椎間盤退變。本研究結(jié)果提示，葛根素可以拮抗IL-1β對椎間盤纖維環(huán)細(xì)胞增殖活力的抑制作用和凋亡的促進(jìn)作用。

人類Caspase是一個含有11個成員的蛋白酶家族，其激活后可以促進(jìn)細(xì)胞凋亡，Caspase-3是Caspase蛋白家族的成員之一，其活化后標(biāo)志著細(xì)胞凋亡進(jìn)入不可逆的階段〔17～19〕。z-DEVD-fmk是Caspase-3的特異性抑制劑，能夠抑制Caspase-3活化從而發(fā)揮抗細(xì)胞凋亡的作用〔20〕。本研究結(jié)果顯示，z-DEVD-fmk和葛根素的作用較為一致，都能夠拮抗IL-1β對椎間盤纖維環(huán)細(xì)胞增殖活力的抑制作用和凋亡的促進(jìn)作用，并且二者聯(lián)合使用后對椎間盤纖維環(huán)細(xì)胞增殖活力和凋亡的作用更明顯。提示，z-DEVD-fmk和葛根素聯(lián)合使用能夠通過抑制椎間盤纖維環(huán)細(xì)胞凋亡促進(jìn)椎間盤纖維環(huán)細(xì)胞增殖活力從而改善頸椎病。

本研究結(jié)果顯示，IL-1β作用后的椎間盤纖維環(huán)細(xì)胞中p-STAT3/STAT3水平下降，而葛根素和z-DEVD-fmk可以部分恢復(fù)p-STAT3/STAT3表達(dá)水平，并且二者聯(lián)合使用效果更好，提示葛根素和z-DEVD-fmk對椎間盤纖維環(huán)細(xì)胞增殖和凋亡的作用可能與STAT3信號通路有關(guān)。

綜上，本研究為Caspase-3抑制劑聯(lián)合葛根素治療頸椎病提供了理論依據(jù)，為后續(xù)試驗中進(jìn)一步探討Caspase-3抑制劑和葛根素在頸椎病治療中的作用機制奠定了基礎(chǔ)。本研究存在一定的缺點，只在體外探討了Caspase-3抑制劑和葛根素對頸椎間盤纖維環(huán)細(xì)胞的作用，后續(xù)試驗中會對二者在體內(nèi)及其他椎間盤細(xì)胞中的作用進(jìn)行深入探討。

1Wang S，Sheng F，Pan Y，etal.Clinical study of cervical spondylotic radiculopathy treated with massage therapy combined with magnetic sticking therapy at the auricular points and the cost comparison〔J〕.Chin Acupunct Moxibust，2015；35(8)：773-7.

2Park MS，Ju YS，Moon SH，etal.Reoperation rates after anterior cervical discectomy and fusion for cervical spondylotic radiculopathy and myelopathy：a national population-based study〔J〕.Spine，2016；41(20)：1593-9.

3Bowles RD，Williams RM，Zipfel WR，etal.Self-assembly of aligned tissue-engineered annulus fibrosus and intervertebral disc composite via collagen gel contraction〔J〕.Tiss Engin Part A，2010；16(4)：1339-48.

4Wang Y，Yang C，Xie WL，etal.Puerarin concurrently stimulates osteoprotegerin and inhibits receptor activator of NF-κB ligand (RANKL) and interleukin-6 production in human osteoblastic MG-63 cells〔J〕.Phytomedicine，2014；21(8)：1032-6.

5Liu Y，Yan H，Chen S，etal.Caspase-3 inhibitor Z-DEVD-FMK enhances retinal ganglion cell survival and vision restoration after rabbit traumatic optic nerve injury〔J〕.Restorat Neurol Neurosci，2015；33(2)：205-20.

6馬 俊，張 穎，陳元元，等.氧濃度及 Notch 通路對大鼠纖維環(huán)細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期的影響〔J〕.脊柱外科雜志，2015；13(1)：50-5.

7劉姝含，劉美含，劉 飛.針刺結(jié)合桂枝加葛根湯治療頸型頸椎病的療效〔J〕.中國老年學(xué)雜志，2017；37(1)：183-4.

8Matsumoto M，Okada E，Toyama Y，etal.Tandem age-related lumbar and cervical intervertebral disc changes in asymptomatic subjects〔J〕.Eur Spine J，2013；22(4)：708-13.

9Messner A，Stelzeneder D，Trattnig S，etal.Does T2 mapping of the posterior annulus fibrosus indicate the presence of lumbar intervertebral disc herniation? A 3.0 Tesla magnetic resonance study〔J〕.Eur Spine J，2017；26(3)：877-83.

10Liao J，Xie QY，Zhang L，etal.Effects of electroacupuncture on Wnt-β-catenin signal pathway in annulus fibrosus cells in intervertebral disc in rats with cervical spondylosis〔J〕.Chin Acupunct Moxibust，2014；34(12)：1203-7.

11Bateman AH，Balkovec C，Akens MK，etal.Closure of the annulus fibrosus of the intervertebral disc using a novel suture application device in vivo porcine and ex vivo biomechanical evaluation〔J〕.Spine J，2016；16(7)：889-95.

12McCann MR，Veras MA，Yeung C，etal.Whole-body vibration of mice induces progressive degeneration of intervertebral discs associated with increased expression of IL-1β and multiple matrix degrading enzymes〔J〕.Osteoarthr Cartil，2017；25(5)：779-89.

13梅崢嶸，譚湘萍，黃漢輝，等.葛根素對阿爾茨海默病細(xì)胞模型 Aβ 蛋白的抑制作用〔J〕.中國現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)，2015；32(1)：5-9.

14Yan B，Xing D，Ding Y，etal.HPLC method for the determination and pharmacokinetic studies on puerarin in cerebral ischemia reperfusion rat plasma after intravenous administration of puerariae radix isoflavone〔J〕.J Pharmac Biomed Anal，2005；37(2)：297-301.

15Sun YM，Huang DD，Cheng C.Effect of puerarin on alkaline phosphatase and osteocalcin of osteoblasts in vitro in elderly female patients with osteoporosis〔J〕.J Logist Univ PAP Med Sci，2015；24(10)：775-9.

16周 軍，方素萍，霍海如，等.葛根湯對退變頸椎間盤組織磷脂酶 A2 的影響〔J〕.中國中醫(yī)骨傷科雜志，2002；10(4)：12-4.

17Sitte I，Klosterhuber M，Lindtner RA，etal.Morphological changes in the human cervical intervertebral disc post trauma：response to fracture-type and degeneration grade over time〔J〕.Eur Spine J，2016；25(1)：80-95.

18Kinning E，McMillan M，Shepherd S，etal.An unbalanced rearrangement of chromosomes 4：20 is associated with childhood osteoporosis and reduced caspase-3 levels〔J〕.J Pediat Genet，2016；5(3)：167-73.

19Atari-Hajipirloo S，Nikanfar S，Heydari A，etal.The effect of celecoxib and its combination with imatinib on human HT-29 colorectal cancer cells：involvement of COX-2，Caspase-3，VEGF and NF-κB genes expression〔J〕.Cellul Molec Biol (Noisy-le-Grand，F(xiàn)rance)，2016；62(2)：68-74.

20Shiri R，Yari F，Ahmadinejad M，etal.The caspase-3 inhibitor (peptide Z-DEVD-FMK) affects the survival and function of platelets in platelet concentrate during storage〔J〕.Blood Res，2014；49(1)：49-53.